Содержание к диссертации
Введение
I. Мобильные генетические элементы и механизмы контроля их транспозиции (обзор литературы) 11
I.1.Классификация МГЭ. 11
I.2. Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов . 13
I.3.Механизмы регуляции транспозиции ретроэлементов. 18
I.3.1.РНК-интерференция 19
I.3.1.1.Пути РНК-интерференции, связанные с siРНК и miРНК 19
I.3.1.2.Путь РНК-интерференции, связанный с piРНК 23
I.3.2.Регуляция посредством участия белков семейства HP1 27
II.Методы исследования 38
II.1.Материалы 38
II.1.1.Линии D. melanogaster и их характеристики 38
II.1.2.Штаммы Escherichia coli 38
II.1.3.Векторы 38
II.2.Методы 38
II.2.1. Приготовление компетентных клеток E. coli 38
II.2.2.Трансформация E. сoli 39
II.2.3.Выделение хромосомной ДНК 39
II.2.4.Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli 40
II.2.5.Сбор тканей для последующего выделения РНК 41
II.2.6.Выделение тотальной РНК 41
II.2.7.Обработка ДНКазой 42
II.2.8.Обратная транскрипция 42
II.2.9.Полимеразная цепная реакция 42
II.2.10.Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 46
II.2.11. Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов 46
II.2.12.Электрофорез в агарозном геле 47
II.2.13.Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 47
II.2.14.Секвенирование 48
II.2.15.Получение рекомбинантных белков 48
II.2.16.Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии MOPS 49
II.2.17.Окраска полиакриламидных гелей красителем Coomassie G-250 49
II.2.18.Диализ растворов белков 49
11.2.19. Измерение концентрации белка 50
11.2.20. Анализ ДКН-связывающей активности рекомбинантного белка НР1а 50
III.Результаты и обсуждение 51
III.1.Анализ транскрипции локуса flamenco 51
III.2.Молекулярно-генетический анализ сплайсинга локуса flamenco 52
III.3.Анализ экспрессии генов системы РНК-интерференции 55
III.4.Анализ роли белков семейства HP1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy 56
III.4.1.Анализ экспрессии генов семейства hp1 57
III.4.2. Связывание белка HP1a с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy 59
III.4.2.1Получение рекомбинантного белка HP1a. 59
III.4.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов группы gypsy 60
III.4.2.3 Гель-шифт анализ 63
Заключение 71
Выводы 73
Список литературы 74
- Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов
- Приготовление компетентных клеток E. coli
- Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов
- Связывание белка HP1a с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy
Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов
Несмотря на специфичность Dcr-1 и Dcr-2, оба этих белка участвуют в siРНК-направленном подавлении активности генов. В обоих случаях требование не является абсолютным, белки взаимозаменяемы. Dcr-1 и Dcr-2 требуются для включения siРНК в siRISC, но играют разные роли. Dcr-2 требуется для формирования устойчивого комплекса siRNA-белка, который содержит Dcr-2 и R2D2 [Liu et al., 2003; Pham et al., 2004]. Этот комплекс начинает собирание siRISC. Dcr-1 не является необходимым для формирования устойчивого комплекса инициатора, зато принимает участие в формировании устойчивого промежуточного звена, необходимого для сборки комплекса siRISC. Dcr-1 в пределах комплекса инициатора облегчает устойчивую ассоциацию других факторов и формирование промежуточного комплекса.
Dcr-1, но не Dcr-2, требуется для подавления активности гена с помощью miRNAs. Потеря функционального гена dicer-2 не сильно отражается на развитии дрозофилы. Вероятно потому, что Dcr-1 обладает слабой процессирующей дцРНК активностью, что восполняет потерю Dcr-2.
Dcr-1 способен включать miРНК в комплекс RISC с расщепляющей активностью, а также может включать siРНК в RISC, блокирующий трансляцию. Сайленсинг транспозонов на этапах зародышевого развития осуществляется Piwi interacting РНК (piРНК) [Malone and Hannon, 2009]. piРНК имеют длину 25-29 нуклеотидов, на 5`-конце имеют фосфатную группу и, как правило, остаток уридина [Saito et al. 2006; Vagin et al. 2006; Brennecke et al. 2007], а на 3`-конце несут 2`-O-метил, который образуется с помощью РНК-метилтрансферазы семейства Hen-1 [Horwich et al., 2007]. Впервые они были обнаружены при изучении локуса Stellate, состоящего из повторяющихся копий гена, кодирующего гомолог киназы казеина II [Livak, 1990]. Последовательности piРНК соответствуют областям генома, сильно обогащенным мобильными элементами и другими повторяющимися последовательностями [Aravin et al., 2003]. У дрозофилы основную часть piРНК составляет подкласс rasiРНК, то есть короткие РНК, образующиеся из ретротранспозонов и других повторов [Aravin et al., 2006]. piРНК ассоциированы со всеми белками семейства Piwi.
Механизм биогенеза piРНК плохо изучен. В герминальных тканях дрозофил, которые состоят из герминальных клеток и соматических фолликулярных клеток, окружающих их, работают различные пути биогенеза piРНК [Li et al., 2009; Malone et al., 2009]. Как отмечалось выше, большинство из уникальных piРНК получены из богатых транспозонами гетерохроматиновых локусов, таких как flamenco [Brennecke et al., 2007; Yin and Lin, 2007]. Кластеры piРНК содержат антисмысловые последовательности к мРНК активных транспозонов, эти антисмысловые РНК ассоциированы с белками Piwi и Aubergine семейства PIWI [Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007; Yin and Lin, 2007]. Смысловые РНК из кластеров piРНК ассоциируются с белком Argonaut (Ago3) [Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007]. Транскрипты piРНК-кластеров экспортируются в цитоплазму, где множество факторов осуществляют биогенез piРНК. Большая часть открытых факторов располагаются в точке рядом с ядерной оболочкой клетки: Yb-тела у соматических клеток яичников и внутриклеточные гранулы в генеративных клетках. Yb-тела и внутриклеточные гранулы ассоциированы с митохондриями, а важный фактор биогенеза piРНК Zucchini интегрирован в мембрану митохондрии [Ipsaro et al., 2012; Nishimasu et al., 2012; Saito et al., 2010]. Антисмысловые РНК, связываясь с белками Piwi и Aubergine, осуществляют разрезание смысловой последовательности транскрипта активного транспозона на расстоянии 10 нуклеотидов от 5 конца. Продукты такого разрезания связываются с Ago3. Комплекс piRNA–Ago3 осуществляет вырезание
piРНК противоположной полярности, ассоциированной с Aub и Piwi, и т.д. Таким образом, в результате этого процесса в клетке накапливаются короткие смысловые и антисмысловые РНК, перекрывающиеся на 10 п.н. Этот процесс был назван «пинг-понг» (рис.7). После формирования piRISC комплексов происходит их транспортировка в ядро, где они осуществляют транскрипционный сайленсинг транспозонов [Sienski et al., 2012; Wang and Elgin, 2011; Le Thomas et al., 2013; Rozhkov et al., 2013].
Приготовление компетентных клеток E. coli
Для трансформации 100 мкл компетентных клеток, размороженных на ледяной бане, смешивали с 1-20 мкл плазмидной ДНК (100 нг), или 20 мкл лигазной смеси и инкубировали во льду в течение 45 мин. Затем пробирки помещали на 1 мин в термостат при 42С и быстро переносили в лед на 2-3 мин. После этого клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем добавляли к ним 0,6 мл среды LB и переносили в стерильные стеклянные пробирки с ватно-марлевыми пробками. Культуру инкубировали при 37С в течение 3 час при постоянном помешивании. 80-100 мкл культуры рассевали шпателем на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей соответствующие антибиотики, и инкубировали в течение ночи (12-16 час) при 37С.
Выделение хромосомной ДНК 50-100 мух помещали в пробирку (Eppendorf) объемом 1,7 мл и добавляли 500 мкл свежеприготовленного рабочего раствора (400 мкл 0,1 M раствора Tris–HCl (pH 9.0), 100 мкл 10% раствора SDS, 7 мкл DEPC (Diethylpyrocarbonate). Мух растирали вручную стерильным тефлоновым пестиком до получения гомогенной смеси. Полученный гомогенат инкубировали при температуре 70С 30 минут, добавляли 116 мкл 5М раствора ацетата калия и инкубировали при 0С 30 минут. Затем добавляли 1 объем смеси фенол-хлороформ (1:1), аккуратно перемешивали и центрифугировали 10 мин на центрифуге MiniSpin (Eppendorf) при 13400 об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку с 350 мкл изопропанола. Пробу инкубировали при комнатной температуре 5 мин и центрифугировали при 13400 об/мин 15 мин. Супернатант сливали, осадок ДНК промывали: добавляли 500 мкл 70% раствором этанола, затем центрифугировали 5 мин. Осадок ДНК подсушивали 5 минут на столе и растворяли в 30 мкл деионизованной воды.
Для выделения плазмидной ДНК отдельную колонию трансформантов засевали в 2 мл жидкой среды LB с антибиотиком и инкубировали в течение ночи при 37С. 1,5 мл культуры помещали в пластиковые пробирки объемом 1,7 мл и центрифугировали на центрифуге MiniSpin (Eppendorf) при 13400 об/мин 30 сек, супернатант удаляли. Осадок ресуспендировали в 350 мкл STET (50мМ трис-HCl, 50 мМ EDTA, 5% TritonX-100, 8% сахароза, pH 8.0), затем добавляли 25 мкл водного раствора лизоцима (10 мг/мл), перемешивали и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Далее пробирку помещали в кипящую водяную баню на 40 сек, центрифугировали в течение 15 мин при 13400 об/мин, затем удаляли осадок. К супернатанту добавляли 175 мкл 7,5 М ацетата аммония и 310 мкл изопропанола. Смесь перемешивали на вортексе, инкубировали 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали 15 мин при 13400 об/мин. Супернатант удаляли, осадок промывали 500 мкл 70% этанола и центрифугировали 5 мин при 13400 об/мин. После удаления супернатанта осадок подсушивали, растворяли в 20-50 мкл деионизованной воды и хранили при –20С.
Мух анестезировали диэтиловым эфиром и вскрывали под бинокулярным микроскопом с помощью препаровальных игл. Органы (яичники, семенники) и корпуса (по 20-30 мг) собирали в отдельные пробирки объемом 1,5 мл с заранее добавленным реагентом для выделения суммарной РНК ExtractRNA (Евроген).
Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью реактива ExtractRNA (Евроген) в соответствии с протоколом фирмы производителя с незначительными модификациями. 15-20 мг исследуемого образца (15 особей) помещали в пробирку «эппендорф», добавляли 100 мкл раствора ExtractRNA и растирали с помощью гомогенизатора со сменными пластиковыми пестиками до исчезновения крупных фрагментов ткани. Добавляли еще 400 мкл раствора ExtractRNA, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Далее добавляли объема хлороформа, несколько раз перемешивали до образования гомогенной эмульсии и инкубировали при +4С 20 мин. Полученную смесь центрифугировали 15 мин при 16000 g, 250 мкл водной фазы, содержащей РНК, переносили в пробирки с 300 мкл изопропанола, перемешивали, инкубировали 20 мин при +4С для осаждения РНК и центрифугировали 15 мин при 16000 g. Осадок промывали 70%-ным этанолом, подсушивали и растворяли в 30 мкл деионизованной воды. Растворы РНК хранили в морозильной камере при -20С. Количество выделенной РНК измеряли спектрофотометрически на приборе Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).
Перед постановкой реакции обратной транскрипции образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermentas) согласно протоколу фирмы. Для обработки ДНКазой брали 4 мкг РНК, реакцию проводили в объеме 40 мкл при 37С в течение 1 час. Реакцию останавливали добавлением EDTA (конечная концентрация 2,5 mM), для инактивации ДНКазы пробу прогревали в течение 10 мин при 65С.
Для обратной транскрипции использовали набор MMLV-RT Kit (Евроген). 500 нг обработанной ДНКазой РНК смешивали с 1 мкл гексануклеотидного праймера со случайной последовательностью, доводили объем до 9 мкл, прогревали 2 мин при 70С, затем помещали пробы в лед. К смеси РНК и праймера добавляли буфер для обратной транскрипции, ревертазу, смесь нуклеотидов и дитиотритол в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Пробы инкубировали сначала 5 мин при комнатной температуре, затем 50 мин при 40С. Ревертазу инактивировали прогреванием в течение 10 мин при 70С.
Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов
Для выделения плазмидной ДНК отдельную колонию трансформантов засевали в 2 мл жидкой среды LB с антибиотиком и инкубировали в течение ночи при 37С. 1,5 мл культуры помещали в пластиковые пробирки объемом 1,7 мл и центрифугировали на центрифуге MiniSpin (Eppendorf) при 13400 об/мин 30 сек, супернатант удаляли. Осадок ресуспендировали в 350 мкл STET (50мМ трис-HCl, 50 мМ EDTA, 5% TritonX-100, 8% сахароза, pH 8.0), затем добавляли 25 мкл водного раствора лизоцима (10 мг/мл), перемешивали и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Далее пробирку помещали в кипящую водяную баню на 40 сек, центрифугировали в течение 15 мин при 13400 об/мин, затем удаляли осадок. К супернатанту добавляли 175 мкл 7,5 М ацетата аммония и 310 мкл изопропанола. Смесь перемешивали на вортексе, инкубировали 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали 15 мин при 13400 об/мин. Супернатант удаляли, осадок промывали 500 мкл 70% этанола и центрифугировали 5 мин при 13400 об/мин. После удаления супернатанта осадок подсушивали, растворяли в 20-50 мкл деионизованной воды и хранили при –20С.
Мух анестезировали диэтиловым эфиром и вскрывали под бинокулярным микроскопом с помощью препаровальных игл. Органы (яичники, семенники) и корпуса (по 20-30 мг) собирали в отдельные пробирки объемом 1,5 мл с заранее добавленным реагентом для выделения суммарной РНК ExtractRNA (Евроген).
Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью реактива ExtractRNA (Евроген) в соответствии с протоколом фирмы производителя с незначительными модификациями. 15-20 мг исследуемого образца (15 особей) помещали в пробирку «эппендорф», добавляли 100 мкл раствора ExtractRNA и растирали с помощью гомогенизатора со сменными пластиковыми пестиками до исчезновения крупных фрагментов ткани. Добавляли еще 400 мкл раствора ExtractRNA, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Далее добавляли объема хлороформа, несколько раз перемешивали до образования гомогенной эмульсии и инкубировали при +4С 20 мин. Полученную смесь центрифугировали 15 мин при 16000 g, 250 мкл водной фазы, содержащей РНК, переносили в пробирки с 300 мкл изопропанола, перемешивали, инкубировали 20 мин при +4С для осаждения РНК и центрифугировали 15 мин при 16000 g. Осадок промывали 70%-ным этанолом, подсушивали и растворяли в 30 мкл деионизованной воды. Растворы РНК хранили в морозильной камере при -20С. Количество выделенной РНК измеряли спектрофотометрически на приборе Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).
Перед постановкой реакции обратной транскрипции образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermentas) согласно протоколу фирмы. Для обработки ДНКазой брали 4 мкг РНК, реакцию проводили в объеме 40 мкл при 37С в течение 1 час. Реакцию останавливали добавлением EDTA (конечная концентрация 2,5 mM), для инактивации ДНКазы пробу прогревали в течение 10 мин при 65С.
Для обратной транскрипции использовали набор MMLV-RT Kit (Евроген). 500 нг обработанной ДНКазой РНК смешивали с 1 мкл гексануклеотидного праймера со случайной последовательностью, доводили объем до 9 мкл, прогревали 2 мин при 70С, затем помещали пробы в лед. К смеси РНК и праймера добавляли буфер для обратной транскрипции, ревертазу, смесь нуклеотидов и дитиотритол в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Пробы инкубировали сначала 5 мин при комнатной температуре, затем 50 мин при 40С. Ревертазу инактивировали прогреванием в течение 10 мин при 70С.
Приготовление реакционной смеси выполняли по протоколу фирмы «Fermentas». Реакцию проводили в амплификаторе ТП4-ПЦР-01-«Терцик» (ДНК-Технология). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК и кДНК, полученную на матрице РНК D. melanogaster., используя Taq-полимеразу (2.5 ед/мкл). Концентрация MgCl2– 2.5 мМ, каждого праймера – 0.4 мкМ на реакцию. В качестве матрицы использовали геномную ДНК или кДНК, полученную на РНК, D. melanogaster анализируемых линий с парами праймеров, подобранными для целей конкретного эксперимента. При ПЦР с кДНК в качестве контроля амплифицировали кДНК гена alphaubulin.
Связывание белка HP1a с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy
Амплификаты регуляторных областей ретротранспозонов лигировали с плазмидой pALA по протоколу фирмы производителя (Евроген) . Затем фрагмент вырезали по заданным сайтам рестрикции Xho I/HindIII и EcoR I и переклонировали его в векторную плазмиду pEGFP-n1, таким образом, чтобы регуляторные области элемента лежали в одной рамке считывания с репортерным геном GFP. Конечным этапом было переклонирование фрагмента с ДКП и нетранслируемой областью, слитого с репортерным геном по сайтам рестрикции Xho I/HindIII и NotI в плазмиду pCaSpeR-hs. Рестрикцию проводили по протоколам фирмы-производителя (Fermentas).
Состав рестрикционной смеси: 2 мкл ДНК образца, 1 мкл 10х буфера, 0,1 мкл рестриктазы (1 ед.а.), 7 мкл Н2Оmq. Смесь инкубировали при 37С в течение 1-2 час.
Для лигирования с вектором использовали T4 ДНК-лигазу (Fermentas) согласно протоколу фирмы. Лигирование проводили в пробирке объемом 0,5 мл. Объем реакционной смеси составлял 15 мкл.
Электрофорез в агарозном геле Электрофорез проводили с напряжением 5 В/см в 1% агарозном геле (0,5 г агарозы; 50 мл ТАЕ [40mM трис,20 mM уксусная кислота, 2mM EDTA]; 5 мкл бромистого этидия [0,5 мг/мл]). Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля Фрагмент ДНК выделяли из агарозного геля набором Clean up mini (Евроген), в соответствии с протоколом, приложенным к набору.
Вырезанный фрагмент геля с ДНК помещали в пробирку объемом 1,5 мл. К вырезанному из геля фрагменту ДНК добавляли связывающий раствор в соотношении 1:3 (к 100 мкг вырезанного фрагмента добавляли 300 мкл связывающего раствора). Инкубировали смесь при 55С в течение 10 мин. Переносили раствор на колонку и центрифугировали 30 сек, супернатант сливали. Добавляли 700 мкл промывочного раствора на колонку и центрифугировали 1 мин Супернатант сливали. Колонку переносили в новую пробирку, добавляли 15 мкл буфера для элюции на колонку и центрифугировали 1 мин.
Для получения рекомбинантного белка штамм E.coli BL21 трансформировали плазмидой pET30, содержащей полноразмерную копию гена hp1a. В колбу с 200 мл бактериальной культуры, находящейся в логарифмической фазе роста, добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 час. Полученную культуру осаждали центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в 10 мл буфера для нанесения на колонку (0,5М NaCl, 5мМ имидазол, 10мМ фосфатный буфер pH 7,4 1мМ PMSF) и разрушали клетки ультразвуковым гомогенизатором УЗГ-0,1/22 (УЗТ). Полученный лизат центрифугировали 30 мин при 16000 g, белок выделяли из супернатанта с помощью колонки HisTrap FF (GE Healthcare). В протокол, рекомендованный производителем, был добавлен этап промывки белка растворами, содержащими 50 и 150мМ имидазола. Качество полученного препарата оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. II.2.16. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии
Электрофорез проводили в камере для вертикального электрофореза VE-10 (Хеликон) в 10%-ном ПААГ. К 3,3 мл 30%-ного акриламида (29 г акриламида к 1 г бисакриламида) добавляли 4 мл 1М раствора Tris-HCl pH 6,8 и доводили водой H2Omq до объема 10 мл. Для инициации радикальной полимеризации добавляли 100 мкл 10%-ного APS. В качестве катализатора использовали 30 мкл ТЕМЕД.
Полиакриламидные гели отмывали от SDS в течение 15 мин в 10% растворе изопропанола, затем окрашивали 30 мин в 0,05%-ном растворе Coomassie brilliant blue G-250, содержащем 20% этанола и 2% трихлоруксусной кислоты. После окрашивания гель отмывали в нескольких сменах горячей дистиллированной воды до проявления полос и исчезновения фона.
Диализ растворов белков проводили в диализных трубках SERVAPOR (Serva). 1 мл раствора белка в буфере для элюции с колонки HisTrap FF диализовали против 200 мл раствора 10mM Tris-HCl, 50 mM KCl pH 7,4 при 4С в трех сменах буфера: по 3 час в двух первых сменах и ночь в последней смене. Выпавший осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин на охлаждаемой центрифуге 5415R (Eppendorf) при 13400 об/мин, супернатант собирали и использовали в дальнейшей работе.
Связывание белка проводили в пробирке объемом 0,5 мл в буфере, содержащем 10mM Tris-HCl, 0,5M KCl pH 7,4 в течение 30-60 мин при 0С. Очищенные фрагменты смешивали с 8 мкг белка. Связывание анализировали в 8%-ном ПААГ: к 2,65 мл 30%-ного акриламида (29 г акриламида к 1 г бисакриламида) добавляли 0,5 мл 10TBE. Затем к смеси добавляли 1 мл 80%-ного глицерина и доводили ее до объема 10 мл H2Omq. Для инициации радикальной полимеризации добавляли 100 мкл 10%-ного APS. В качестве катализатора использовали 30 мкл Анализ транскрипции локуса flamenco Локус flamenco представляет собой место скопления дефектных копий МГЭ. Предполагается, что транскрипт flamenco участвует в процессе РНК-интерференции МГЭ, выступая в роли молекулы-предшественника, дающей начало малым РНК, ассоциированных с белком PIWI (piРНК). У инсерционных мутантов по локусу flamenco малые РНК, взаимодействующие с белком PIWI, не образуются [Brennecke et al., 2007].
