Введение к работе
Актуальность проблемы. Современные данные биомедицины указывают на важную роль нарушений актинового цитоскелета в возникновении нейродегенеративных (НД) болезней старения, прионных заболеваний и канцерогенезе (Ramaekers, Bosman, 2004). Ремоделирование актинового цитоскелета также влияет на синаптическую пластичность - основу процессов обучения и памяти (Meng et al., 2002).
Одним из основных контролёров состояния актина в клетке является сигнальный каскад ремоделирования актина, передающий сигнал по цепочке: рецепторы нейротрансмиттеров - малые ГТФазы Rho-семейства - ЫМ-киназа 1 (LIMK1) -кофилин - актин. Важнейшим узлом этого каскада является ЫМ-киназа 1. После активации LIMK1 фосфорилирует кофилин и смещает соотношение G-актин/Р-актин в сторону образования F-актина (Yang et al., 1998). С нарушениями функционирования каскада ремоделирования актина связано большое число нейродегенеративных заболеваний. Одним из самых известных геномных заболеваний, связанных с дисфункцией LIMK1, является синдром Уильямса (Jarvinen-Pasley et al., 2008).
Начальным звеном системы ремоделирования актина является глутаматергический сигнальный каскад (Shi, Ethell, 2006; Yang et al., 1998). Функционирование рецепторного компонента этого каскада - N-метил-Б-аспартатных (NMDA) рецепторов - рассматривают как молекулярно-физиологическую основу процессов обучения и памяти (Cull-Candy et al., 2001). Гиперактивность этих рецепторов наблюдается при болезнях Альцгеймера (БА), Паркинсона (БП), Хантингтона (БХ) и других поражениях, сопровождаемых нейродегенерацией (Беспалов, Звартау, 2000).
Важным эндогенным лигандом NMDA-рецепторов служит метаболит кинуренинового пути обмена триптофана - кинуреновая кислота (KYNA) (Беспалов, Звартау, 2000). Метаболиты этого пути (кинуренины) участвуют в возникновении и развитии многих заболеваний, например воспалительных и дегенеративных болезней нервной системы (Лапин, 2004). Из них возбуждающим и нейродегенеративным действием обладают L-кинуренин и 3-гидроксикинуренин (ЗНК) (Maeda et al., 1997). KYNA является единственным известным эндогенным протектором, защищающим клетку от действия возбуждающих кинуренинов (Beninger et al., 1986; French et al., 1984).
Показано, что уровень LIMK1 в головном ганглии дрозофилы чётко коррелирует с содержанием кинуренинов (Лопатина et al., 2007). Считается, что на основе KYNA возможно создание лекарственных препаратов, способных воздействовать на NMDA-рецепторы и систему ремоделирования актина (Danysz, Parsons, 1998). Поэтому представляется важным исследовать влияние кинуренинов на сигнальный каскад ремоделирования актина. Возможным механизмом связи между содержанием LIMK1 и KYNA является специфическое взаимодействие KYNA с NMDA-рецепторами. Механизм воздействия ЗНК на LIMK1 и каскад ремоделирования актина в настоящий момент неизвестен.
В подавляющем большинстве случаев начало развития НД болезней происходит спонтанно. Ассоциированные с подобными расстройствами гены часто располагаются в районах хромосом со специфической архитектурой (Kim, Rossi, 2007). Поэтому большинство НД болезней старения способны возникать спорадически из-за нарушений целостности генетического аппарата (Minamide et al., 2000). Фактором запуска патологии могут являться различные стрессорные воздействия (Gilgun-Sherki et al., 2003).
Одним из самых хорошо изученных стрессорных воздействий является тепловой
шок (ТШ), в ответ на который происходит активация системы белков теплового шока (БТШ/HSP, Heat Shock Protein) (Morimoto, 1993; Wu, 1995). Компоненты актинового каскада также принимают участие в организации ответа на ТШ. Показано взаимодействие между LIMK1 и HSC70 (Giot et al., 2003). При стрессорных воздействиях наблюдается перемещение комплекса LIMKl-кофилин-актин в ядро (Савватеева-Попова et al., 2004), что может служить одной из основ для ремоделирования актина ядра и избирательного запуска транскрипции.
Одними из самых плохо изученных с биологической точки зрения воздействий являются электрическое и магнитное поля низкой интенсивности, способные оказывать заметное воздействие на живые организмы (Ghione et al., 2005). Экранирование живых объектов от естественного геомагнитного поля (нахождение в ослабленном геомагнитном поле, ОГМП) оказывает пагубное воздействие на нервную систему (Агаджанян, Макарова, 2005; Бинги et al., 2006). Этот эффект нуждается в тщательном изучении (Труханов, 2003).
Влияние сигнального каскада ремоделирования актина на все вышеуказанные процессы удобно изучать с использованием модельных систем. Хорошим объектом для подобных целей является дрозофила, поскольку после завершения программы «геном человека» было выяснено, что 75% генов человека и дрозофилы обладают высокой степенью гомологии (Fortini et al., 2000). Кроме того, дрозофила имеет короткий жизненный цикл и ее содержание относительно недорого. Поэтому во многих случаях дрозофилу используют для выяснения механизмов этиологии болезней человека и скрининга лекарственных препаратов (Reiter, 1993).
Поскольку при многих нейродегенеративных заболеваниях нарушается локомоторное поведение, один из способов разработки лекарственных средств основан на поиске фармакологических агентов, корректирующих нарушения локомоции у просто организованных животных (Braungart et al., 2004). Однако для решения такой задачи необходимо определить фенотип большого числа особей до и после воздействия лекарственного агента, что в настоящий момент представляет более сложную техническую задачу, нежели генотипирование (Simon, 2010). В связи с этим, весьма актуальна задача разработки систем для автоматического тестирования локомоторного поведения дрозофилы.
Для исследований сигнального каскада ремоделирования актина у дрозофилы очень удобен локус agnostic, который был обнаружен в районе ПАВ Х-хромосомы (Савватеева et al., 1978). Этот локус кодирует киназу LIMK1 и обрамлен протяжёнными АТ-богатыми повторами (Савватеева-Попова et al., 2004). Мутантом по этому локусу является agrf3 (Savvateeva, Kamyshev, 1981), у которого при ПЦР-картировании (Медведева et al., 2008) в З'-области гена limkl обнаружена инсерция длиной 1,7 т.п.н. Природа этой инсерции в настоящий момент неизвестна. Локус agnostic в силу своего строения может служить удобной моделью геномных болезней, таких как синдром Уильямса (Медведева et al., 2008). Исследовать влияние кинуренинов на локомоторное поведение дрозофилы также удобно, поскольку у нее описаны мутации, блокирующие определённые стадии КПОТ и приводящие к накоплению соответствующих кинуренинов, что заменяет их искусственное введение (Summers et al., 1982; Лопатина et al., 2007).
Цель и задачи работы
Цель работы: Привести сравнительный анализ влияния различных стрессорных воздействий (тепловой шок и экранирование геомагнитного поля) на развитие локомоторных нарушений у линий дрозофилы, несущих мутации в рецепторной и эффекторной частях сигнального каскада ремоделирования актина, и выявить возможные механизмы формирования этих нарушений.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Создать установку и разработать программное обеспечение для автоматической видеорегистрации и анализа локомоторного поведения личинок дрозофилы
Исследовать влияние двух типов стрессорных воздействий (тепловой шок и экранирование геомагнитного поля) на локомоторное поведение нормальных и мутантных личинок, для чего использовать спонтанные и мутантные варианты локуса agnostic, а также мутантов по ферментам кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ)
Определить точное положение и нуклеотидную последовательность вставки в ген limkl у мутанта agnts3
Исследовать влияние стрессорных воздействий на уровень LIMK1 и белков системы БТШ
Исследовать механизм связывания агонистов и антагонистов NR1-субъединицы NMDA-рецептора и возможность влияния 3-гидроксикинуренина (ЗНК) на функции рецептора
Научная новизна работы. Впервые исследован вклад экранирования естественного геомагнитного поля в развитие локомоторных расстройств у дрозофилы. Показано, что это воздействие отличается от теплового шока как на поведенческом, так и на молекулярном уровне. Указаны предполагаемые мишени стрессорного воздействия, связанного с экранированием геомагнитного поля.
Впервые выявлены дефекты в структурных и регуляторных участках гена limkl, приводящие к изменениям параметров локомоции и пространственной ориентации при исследовательской активности. Также впервые выявлены дефекты локомоции личинок, связанные с нарушениями синтеза метаболитов КПОТ. Впервые установлено точное положение и характер вставки, в ген limkl у мутанта agnts3.
Продемонстрирована важная роль стэкинг-взаимодействия при связывании
антагонистов глицинового сайта NMDA-рецептора. Показано, что
3-гидроксикинуренин не способен специфически взаимодействовать с этим сайтом.
Основные положения, выносимые на защиту
Фермент LIMK1 принимает участие в формировании локомоторного поведения личинок дрозофилы. Мутация agnts3 по гену limkl приводит к падению уровня локомоторной активности.
Экранирование естественного геомагнитного поля оказывает на локомоторное поведение дрозофилы воздействие, отличающееся по механизму от теплового шока. В реализации ответа на это воздействие принимают участие белки LIMK1, алкогольдегидрогеназа (Adh) и fat body protein 2 (Fbp2).
Мутационно обусловленное накопление метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана, являющихся модуляторами глутаматергических рецепторов (начального звена сигнального каскада ремоделирования актина), также приводит к изменениям в локомоторном поведении и реакции на стрессорные факторы.
Практическая значимость работы. Реализован экспресс-метод регистрации локомоторных нарушений и выявления дефектов локомоторного поведения у личинок дрозофилы. Это создаёт предпосылки для разработки метода экспресс-оценки действия различных фармакологических агентов на локомоторное поведение дрозофилы. Разработанные методы можно использовать для поиска лекарственных препаратов, корректирующих нарушения локомоторного поведения. Большая скорость и сравнительно невысокая цена исследований на дрозофиле делают ее практически идеальным объектом для предварительного экспериментального тестирования терапевтических средств. Препараты, прошедшие отбор на такой системе, можно переводить на следующий этап тестирования с использованием позвоночных
животных.
Исследование влияния магнитного поля подтверждает, что экранирование магнитного поля является стрессорным воздействием, механизм которого, по-видимому, напоминает оксидативный стресс и связан с митохондриальными нарушениями. Подобные данные представляют большую ценность для дальнейших исследований стрессорного влияния магнитного экранирования.
Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены на следующих конференциях: Политехнический симпозиум «Молодые учёные -промышленности северо-западного региона». Санкт-Петербург, 2004; 10-я Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука 21 века». Пущино, 2006; XVII WFN Word Congress on Parkinson diseases and related disorders. Amsterdam, 2007; Международная школа-конференция посвященная 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашова «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов». Санкт-Петербург, 2007; Пятнадцатая конференция «Математика. Компьютер. Образование». Москва, 2008; The second Saint-Petersburg International conference on NanoBio Technologies. Saint-Petersburg, 2008; IX East European Conference "Simpler Nervous Systems". Saint-Petersburg, 2009; Международный молодёжный научный форум «ЛОМОНОСОВ-2010». Москва, 2010; 21 съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Калуга, 2010.
Вклад автора. Адаптация установки для автоматической регистрации локомоторного поведения и постановка экспериментов по записи локомоторного поведения личинок производилась совместно с Т.Л. Паялинои. Секвенирование гена limkl проведено совместно с А.В. Журавлевым и А.Н. Каминской. Двумерный электрофорез белков нервных ганглиев был проведен в совместных исследованиях в лаб. проф. М.Б. Евгеньева (Институт Молекулярной Биологии РАН, Москва).
Лично автором произведена адаптация и разработка программного обеспечения установки и статистическая обработка полученных результатов. Лично автором проведено исследование механизма связывания лигандов NRl-субъединицы NMDA-рецептора. Также автором проведен вестерн-блот анализ содержания белков LIMK1 и HSP70 в нервных тканях личинок. Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 202 страницах печатного текста, содержит 5 таблиц и иллюстрирована 55 рисунками. В списке цитируемой литературы приведено 233 источника.
