Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение регуляции экспрессии генов является одной из актуальных проблем современной генетики. Важную роль в регуляции экспрессии генов играют их регуляторные зоны, которые наряду с наличием в них сайтов связывания регуляторных белков могут являться источником разных типов регуляторных РНК. В настоящее время показано, что значительная часть генома эукариотических организмов способна транскрибироваться в двух направлениях (смысловом и антисмысловом), то есть многие гены эукариот перекрываются. Так, у Drosophila melanogaster перекрывается 26.2 % кодирующих белки генов. Такое строение генома приводит к появлению общих для разных генов регуляторных зон и возникновению перекрывающихся РНК, как кодирующих, так и не кодирующих белки. В свою очередь, перекрывающиеся регуляторные элементы, и, главным образом, перекрывающиеся транскрипты, представляют собой дополнительный способ регуляции экспрессии генов. Эволюционная и биологическая значимость этого явления не совсем ясна. Большинство найденных перекрытий возникает между генами, транскрибируемыми с противоположных цепей одного и того же локуса. Часто в перекрытие вовлекается не кодирующий белок транскрипт. Накапливаются данные, что антисмысловые транскрипты участвуют во множестве клеточных процессов, таких как геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, альтернативный сплайсинг, сайленсинг генов и метилирование, трансляция. Наличие перекрывающихся транскриптов и их регуляторная роль показаны для ряда генов у разных организмов, среди которых гены, вовлечённые в онкогенез и развитие других патологий. Существуют разные модели механизмов регуляции смысловой мРНК антисмысловым транскриптом. Одной из них является модель транскрипционной интерференции (ТИ) (или транскрипционного столкновения). Согласно этой модели, процесс транскрипции одного гена подавляет транскрипцию перекрывающегося с ним другого гена. Большинство исследований перекрывающихся генов и антисмысловой транскрипции проводится in vitro или in silico и остро нуждаются в подтверждении результатов in vivo.
Ранее в нашей лаборатории была открыта мутация D. melanogaster, нарушающая правильную экспрессию многих нейрогенов и транскрипционных факторов, контролирующих развитие организма. По данным GenBank район локализации мутации содержал два гена leg-arista-wing complex и TBP-related factor 2 QawclTrfT), предположительно имеющих общую 5'-регуляторную зону. Транскрипты, синтезирующиеся с данного локуса, представляли собой набор разнонаправленных мРНК, количество и структура которых неизвестны. По нашим предварительным данным по крайне мере один из транскриптов гена law с должен перекрываться с транскриптами гена Trf2. Мы предположили, что гены lawc и Trf2 взаимодействуют, а зона перекрытия и разнонаправленные транскрипты могут участвовать в координировании экспрессии обоих генов.
Исследование 5'-регуляторной области генов lawc и Тг/2 важно не только для
понимания механизмов контроля экспрессии данного локуса, но и для
получения знаний о способах и механизмах регуляции экспрессии
перекрывающихся генов у эукариот. Описание 5'-регуляторной зоны lawclTrf2
позволит в дальнейшем использовать данный локус в качестве модели для
исследования взаимодействия перекрывающихся генов in vivo.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в исследовании
регуляторной 5'-зоны перекрывающихся генов leg-arista-wing complex и ТВР-
relatedfactor 2 у Drosophila melanogaster.
В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:
-
установить экзон-интронную структуру гена lawc;
-
исследовать экспрессию мРНК перекрывающихся генов lawc и Trf2 на разных стадиях развития D. melanogaster и в культуре клеток Schneider 2;
-
провести сравнительный анализ экспрессии перекрывающихся генов lawc и Trf2 у мутантов с различными нарушениями регуляторных областей;
-
исследовать эффект подавления экспрессии /uwc-транскриптов на уровень экспрессии перекрывающихся с ними противоположно направленных транскриптов Trf2 in vitro в культуре клеток Schneider 2 и in vivo;
-
исследовать паттерн экспрессии перекрывающихся генов lawc и Trf2 у разных видов дрозофил.
Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружено, что часть регуляторной области локуса lawclTrf2 входит в состав нескольких разнонаправленных транскриптов и является общей для двух генов. Открыт новый экзон и установлены реальные точки старта транскрипции известных ранее сплайс-вариантов мРНК гена lawc. Изолировано шесть новых сплайс-вариантов мРНК гена lawc; нуклеотидная последовательность одного из них внесена в базу данных Genbank под номером JX546150. Впервые показано наличие у гена Trf2 не описанных ранее коротких транскриптов длиной 1,1 т.н. и 3,1 т.н., формирующихся в 5Л-регуляторной зоне. Впервые выявлены новые полоспецифические (специфичные только для самок или самцов) транскрипты обоих генов. Выявлены возможные регуляторные зоны, ответственные за тканеспецифическую регуляцию экспрессии генного комплекса в репродуктивной системе самок. Показано, что экспрессия прямых и обратных перекрывающихся транскриптов lawclTrf2 в раннем эмбриогенезе пространственно не совпадает, что предполагает регуляцию экспрессии этих генов по механизму транскрипционной интерференции на данном этапе развития. Впервые охарактеризована природа мутантных аллелей исследуемого района. В экспериментах in vivo и in vitro по избирательному посттранскрипционному подавлению экспрессии гена lawc показана зависимость уровня экспрессии гена Trf2 от транскрипционной активности гена lawc. Обнаружен активирующий эффект РНК-интерференции на экспрессию одного из двух перекрывающихся генов (увеличение экспрессии вместо подавления), что очень важно учитывать на практике, поскольку в литературе всё больше уделяется внимание проблеме лечения ряда генетических
заболеваний (включая рак) с помощью генотерапии на основе РНК-интерференционного подавления экспрессии «испорченного» гена. Показана эволюционная консервативность района перекрытия генов lawc и Trf2 для близкородственных видов дрозофил подгруппы melanogaster. Степень достоверности и апробация результатов. Результаты проведенных исследований являются достоверными, что подтверждено публикациями в рецензируемых журналах, воспроизводимостью результатов в различных условиях и на различных моделях. Исследования проводились на сертифицированных и откалиброванных приборах, для анализа полученных данных были использованы современные методы обработки данных, применяемые для исследования биологических процессов. Результаты работы докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2008; 2009; 2010; 2011); на X Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), на Международной молодёжная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), на X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2009), на Международной конференции «Современное состояние генетики в Казахстане (Алмата, 2010), на Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра (Санкт-Петербург, 2010), а также на международных конференциях по дрозофиле (ADRC) в США (San Diego, 2008; Chicago, 2009; Washington, 2010; Washington, 2013) и в Испании (Barcelona, 2013).
Личное участие автора. Представленная работа полностью выполнена автором, включая разработку экспериментальных моделей и планирование экспериментов, получение исходных экспериментальных данных и непосредственное участие в научных экспериментах, статистическую обработку и интерпретацию полученных результатов, подготовку основных публикаций по проделанной работе и представление результатов исследований на конференциях соответствующей тематики.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков, 3 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 223 цитируемых источника и одного приложения.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 4 в журналах, соответствующих Перечню ВАК, одна электронная публикация и 14 тезисов докладов и материалов конференций.
