Введение к работе
Актуальность работы. Хроматин определяют как комплекс геномной ДНК, гистоновых и негистоновых белков и РНК. Различают два типа хроматина - эухроматин и гетерохроматин. Среди целого ряда проблем, связанных с изучением гетерохроматина, наибольшее значение, в общебиологическом смысле, представляют проблемы, затрагивающие эволюционную роль гетерохроматина, его возможное участие в процессах видообразования. Гетерохроматин обладает высокой эволюционной лабильностью, как на цитогенетическом, так и на молекулярном уровне. На основе этого выдвинуто предположение о возможной роли реорганизации гетерохроматина при видообразовании. Видообразование может происходить за счет изменения количества, структуры гетерохроматина, а также перераспределения его по хромосомам (Корочкин, 1983; Кикнадзе и др., 1991; Стегний, 1991; Hennig, 1999; Корочкин, 2002). Поэтому в данном контексте является актуальным изучение гетерохроматина у филогенетически близких видов. Удобным объектом для этой цели являются виды Drosophila подгруппы melanogaster. Эта подгруппа включает два комплекса: комплекс «melanogaster» (D. melanogaster, D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana) и комплекс «yakuba» (D. orena, D. erecta, D. teissieri, D. yakuba, D. santomea) (Ashburner, 1989; Lachaise et al., 2000).
Для многих видов данной подгруппы (D. melanogaster, D. simulans, D. sechellia, D. erecta, D. yakuba) полностью или частично известна нуклеотидная последовательность ДНК эухроматина (Clark et al., 2007). Наиболее полные данные о последовательностях ДНК эухроматина и гетерохроматина к настоящему моменту опубликованы только для D. melanogaster (Clark et al., 2007). Размер генома D. orena больше чем у остальных видов подгруппы, в основном за счет повышенного содержания повторенной ДНК гетерохроматина (Boulesteix et al., 2006) и данные о последовательностях генома этого вида практически отсутствуют в литературе. Известно, что гетерохроматин в ядрах трофоцитов яичников Drosophila представлен в большей степени, чем в ядрах клеток слюнных желез (Mal'ceva, Zhimulev, 1993). В связи с этим, изучение состава ДНК хромоцентра трофоцитов D. orena может дать общее представление об организации последовательностей ДНК гетерохроматина у этого вида.
В 1979 г. был выявлен новый видоспецифичный признак -пространственная организация политенных хромосом в ядрах клеток генеративной системы малярийных комаров (Стегний, 1979). Обнаруженный феномен реорганизации архитектуры интерфазного ядра в клетках генеративной системы, которая, вероятно, происходит при видообразовании, был назван системной мутацией (Стегний, 1993). Подобный феномен был выявлен и у близкородственных видов Drosophila (Стегний, Вассерлауф, 1994; Вассерлауф, 2008). Так, у видов подгруппы melanogaster была выявлена следующая реорганизация хромосом в ядрах трофоцитов при видообразовании: от локального хромоцентра, характерного для анцестрального вида D. orena, к диффузному хромоцентру (D. simulans, D. sechellia, D. erecta), к независимо расположенным хромосомам {D. yakuba, D. teissieri, D. mauritiana, D. santomea) и к прикреплению хромосом центромерными или теломерными районами к
ядерной оболочке (D. melanogaster) (Стегний, Вассерлауф, 1994). Известно, что гетерохроматин определяет пространственную организацию хромосом в интерфазном ядре. При изменениях гетерохроматина связанных с его количеством, структурой и его межхромосомным перераспределением, вероятно, может происходить изменение пространственной ориентации хромосом в клетках генеративной системы. Таким образом, изучение и сравнение состава ДНК районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом трофоцитов у близкородственных видов подгруппы melanogaster представляется актуальным для понимания механизмов реорганизации архитектуры интерфазного ядра.
Цель и задачи работы. Цель работы: охарактеризовать состав ДНК хромоцентра трофоцитов яичников D. огепа и исследовать распределение последовательностей ДНК из хромоцентра на первичных политенных хромосомах трофоцитов у близкородственных видов подгруппы melanogaster рода Drosophila.
Были поставлены следующие задачи:
1. Провести микродиссекцию хромоцентра первичных политенных
хромосом трофоцитов яичников D. огепа и создать районоспецифичную
библиотеку ДНК.
-
Осуществить клонирование в плазмидном векторе фрагментов ДНК районоспецифичной библиотеки хромоцентра первичных политенных хромосом трофоцитов яичников D. огепа и определить нуклеотидную последовательность этих фрагментов.
-
Провести поиск гомологии фрагментов районоспецифичной библиотеки ДНК с известными повторяющимися и уникальными последовательностями из геномов разных видов Drosophila при помощи программ «RepeatMasken>, «BLAST» и проанализировать фрагменты на наличие внутренних тандемных повторов при помощи программы «Tandem Repeats Finder».
-
Осуществить флуоресцентную in situ гибридизацию зонда на основе районоспецифичной библиотеки ДНК на первичные политенные хромосомы трофоцитов видов подгруппы melanogaster рода Drosophila.
Научная новизна работы. Впервые был изучен молекулярный состав ДНК хромоцентра трофоцитов D. огепа. В результате анализа нуклеотиднои последовательности клонов в составе минибиблиотеки ДНК хромоцентра D. огепа были обнаружены разнообразные повторяющиеся последовательности ДНК (представители различных классов МГЭ, среди которых преобладали LTR-ретротранспозоны и LINE-элементы; минисателлиты и другие различающиеся по нуклеотиднои последовательности повторы), а также последовательности, гомологичные генам.
In situ гибридизация ДНК-зонда из хромоцентра трофоцитов D. огепа с первичными политенными хромосомами трофоцитов видов подгруппы melanogaster и анализ состава ДНК хромоцентра позволили установить, что хромоцентр трофоцитов D. огепа и прицентромерный гетерохроматин видов данной подгруппы (D. erecta, D. teissieri, D. yakuba, D. santomea, D. simulans, D. melanogaster, D. sechellia, D. mauritiana) содержат консервативные
последовательности ДНК, среди которых преобладают разные типы повторов, но также встречаются последовательности, гомологичные генам.
Показано, что ДНК из хромоцентра D. огепа консервативна в плане своего распределения преимущественно в прицентромерных районах всех хромосом у видов подгруппы melanogaster, несмотря на различия во взаимном расположении хромосом в трофоцитах у этих видов.
Показано, что у D. огепа хромоцентр трофоцитов не подвергается деконденсации в ядрах с ретикулярной структурой и сохраняет свое компактное состояние, в то время когда происходит дезинтеграция всех хромосом и ядро приобретает ретикулярную (сетчатую) структуру.
Положения, выносимые на защиту. 1) Установлено, что в состав ДНК хромоцентра политенных хромосом трофоцитов D. огепа входят: диспергированные повторы (представители разных классов МГЭ); тандемные повторы; последовательности, гомологичные генам. 2) Показано, что районоспецифичная ДНК из хромоцентра D. огепа консервативна в плане своей локализации в прицентромерных районах хромосом X, 2 и 3 трофоцитов яичников всех видов подгруппы melanogaster.
Практическая значимость работы. Полученная районоспецифичная библиотека «Dorel», а также клоны минибиблиотеки ДНК из хромоцентра D. огепа являются ценным материалом для проведения дальнейших исследований гетерохроматина у видов подгруппы melanogaster, и, возможно, у других видов Drosophila. Нуклеотидные последовательности клонов минибиблиотеки опубликованы в электронной базе данных «GenBank» (индексы доступа с НМ594089 по НМ594162).
Полученные результаты могут быть использованы при чтении лекций по ряду биологических дисциплин.
Апробация результатов работы. Результаты исследований были представлены на IV международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «KARYO-IV», Санкт-Петербург (2006), на VII Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока (в рамках Сибирской зоологической конференции) «Энтомологические исследования в Северной Азии», Новосибирск (2006), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск (2007), на Международной конференции, посвященной памяти А.А. Прокофьевой-Бельговской, «Хромосома 2009», Новосибирск (2009), на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященному 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, «ВОГиС», Москва (2009). По теме диссертации сделано три публикации в отечественных журналах рецензируемых ВАК.
Вклад автора. Основные результаты настоящего исследования получены автором самостоятельно. Микродиссекция и DOP-ПЦР проводились совместно с д-ром биол. наук Н.Б. Рубцовым и канд. биол. наук Т.В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Секвенирование и анализ последовательностей ДНК in silico - с канд. биол. наук Е.А. Елисафенко (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск) и мл. науч. сотр. Т.А. Шелковниковой (НИИ ББ ТомГУ, г. Томск).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы, в который входит 188 ссылок. Работа изложена на 119 страницах, содержит 19 рисунков и 7 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
