Содержание к диссертации
Введение
1. Состояние вопроса 12
1.1. Понятие о гомеостазе 12
1.2. Адаптация и адаптивность 13
1.3. Механизмы адаптации 16
1.3.1. Модификационная адаптация 17
1.3.2. Генотипическая адаптация 19
1.3.2.1. Источники генотипической адаптации 19
1.3.2.2. Мутации 20
1.3.2.3. Рекомбинации 24
1.3.2.4. Образование коадаптированных блоков генов 27
1.3.3. Интегрированность генотипической и модификационной адаптации 29
1.4. Преадаптация или проспективная адаптация 30
1.4.1. Генетические основы преадаптации 31
1.4.1.1. Генетический полиморфизм 31
1.4.1.2. Наличие дуплицированных генов 33
1.5. Роль интродукции в обогащении состава насаждений древесных растений и улучшении экологической ситуации промышленных городов 34
1.5.1. Виды интродуценты древесных растений в г. Воронеже и Воронежской области 35
1.6. Важность изучения генетических механизмов, поддерживающих гомеостаз у видов - интродуцентов 38
2. Экспериментальная часть 44
2.1 Объекты и места проведения исследований 44
2.2. Материал и методика 52
2.3. Результаты и обсуждение 56
2.3.1. Цитогенетика вяза мелколистного 56
2.3.1.1. Мейоз при микроспорогенезе 56
2.3.1.2. Изучение числа митотических хромосом в клетках апикальной меристемы листьев у модельных деревьев вяза 77
2.3.1.3. Общее заключение по разделу 80
2.3.2. Цитогенетика скумпии кожевенной 81
2.3.2.1. Устойчивость листа, как важнейшего органа растений, в условиях антропогенного загрязнения 81
2.3.2.2. Функционирование клеток меристемы листьев у скумпии в условиях интродукции и антропогенном прессинге 83
2.3.2.3. Пролиферация и дифференциация клеток эпидермиса ускумпии 94
2.3.2.4. Механизмы, обеспечивающие устойчивость как листа, так и вида в целом 96
2.3.2.5. Общее заключение по разделу 100
2.3.3. Цитогенетика ели колючей (голубой формы) 101
2.3.3.1. В - хромосомы у ели колючей и их связь с репродуктивными процессами и устойчивостью организма 101
2.3.3.2. Кариотип у ели колючей (голубой формы) в меристеме хвои материнских деревьев и в корешках проростков их семян 106
2.3.3.3. Гипотеза образования В - хромосом у ели колючей (голубой формы) 113
2.3.3.4. Влияние В - хромосом на фертильность, устойчивость и регулярность клеточных делений 117
2.3.3.5. Общее заключение по разделу 121
Выводы 122
Список использованной литературы 127
- Источники генотипической адаптации
- Роль интродукции в обогащении состава насаждений древесных растений и улучшении экологической ситуации промышленных городов
- Изучение числа митотических хромосом в клетках апикальной меристемы листьев у модельных деревьев вяза
- Механизмы, обеспечивающие устойчивость как листа, так и вида в целом
Введение к работе
характеристик гомеостаза конкретных интродуцируемых видов крайне важно как для ускоренной оценки отобранных деревьев, так и для ранней диагностики наследственных свойств их потомства, поскольку при этом можно наблюдать ответные реакции клеток и их генетического аппарата. Среди характеристик хромосомного аппарата в мейозе и митозе важно выявить те, которые могут поддерживать гомеостаз интродуцируемых видов в экстремальных условиях. Целенаправленный отбор на наследственно обусловленную повышенную экологическую устойчивость древесных видов-интродуцентов будет способствовать улучшению качества зеленых насаждений в городах, особенно промышленных. В связи с этим важна цитогенетическая оценка состояния устойчивых древесных растений в условиях комплексного воздействия (Захаров, Кларк, 1993; Захаров и др., 2000) интродукции и антропогенного загрязнения. Это определило цель настоящей работы.
Цель работы. Цель диссертационной работы заключалась в проведении цитогенетической оценки интегрального эффекта интродукции и антропогенного стресса у видов - интродуцентов лиственных и хвойных древесных растений и установлении цитогенетических характеристик их гомеостаза. Задачи исследования.
Выбор древесных видов-интродуцентов как объектов исследования.
Отбор фенотипически лучших форм этих видов в условиях интродукции и разной степени антропогенного загрязнения.
3. Фиксация материала (генеративных, вегетативных почек, корешков
проростков их семян) у отобранных древесных растений. Изготовление и
анализ давленых препаратов.
4. Выявление общих и специфических особенностей мейоза при
микроспорогенезе и митоза у интродуцируемых древесных растений,
устойчивых в городской среде.
Положения, выносимые на защиту.
1. Гомеостатичность отобранных деревьев вяза мелколистного - (Ulmus pumila
L.) в экстремальных условиях произрастания обеспечивается такими
генетическими механизмами, как гибридность и миксоплоидия.
2. Нормальные митозы наряду с нарушениями митотического деления
формируют в меристеме листьев у скумпии кожевенной (Cotinus coggygria
Scop.) гетерогенную клеточную популяцию, в которой происходит отбор.
Результатом такого отбора может быть оптимальное сочетание клеток разного
уровня плоидности, способствующее наиболее эффективной реализации
функций генов в конкретных условиях, то есть гетерогенность клеточной
популяции в меристеме листьев может способствовать устойчивости не только
листа, но и вида в целом.
3. Гомеостаз отдельных материнских деревьев ели колючей (голубой формы) -
Picea glauca (Moench) Voss. = P. canadensis B. S. P. и их семенного потомства в
условиях интродукции, отягщенных антропогенным стрессом, обусловливает
присутствие В-хромосом.
Научная новизна работы. При изучении мейоза при микроспорогенезе у отобранных деревьев вяза мелколистного - (Ulmus pumila L.) уточнены сроки наступления и продолжительность мейоза в условиях средней полосы России -г. Воронеже; показана зависимость начала мейоза от климатических условий. Так, было установлено, что в годы исследования начало мейоза провоцировалось длительными оттепелями зимой, весной и повышением температуры воздуха выше +5 С, и в зависимости от этого приходилось на разные сроки: с 8 по 14 марта в 1999 г., с 21 по 27 февраля в 2000 г. и с 23 января по 1 февраля 2001 г. Обосновано предположение о гибридной природе отобранных деревьев вяза на основании их морфологических особенностей и выявленных нарушений мейоза, особенно, на стадии метафазы I. Частота встречаемости нарушений на этой стадии была от 16,0 до 34,0%. Показано, что низкая репродуктивная способность у гетерозисных деревьев в условиях г.
Воронежа обусловлена, главным образом, нарушениями на стадии анафазы I (40,0% у дерева №8 и 45, 7% у дерева № 10), которая является критической стадией при формировании гамет. У отобранных форм вяза мелколистного установлено образование нередуцированных гамет (2п), что открывает возможности для получения в их потомстве полиплоидных (Зп) форм, характеризующихся, как правило, эффектом соматического гетерозиса и более высоким уровнем устойчивости. Показано, что существенным фактором, влияющим на репродуктивные процессы отобранных деревьев вяза, являются также неблагоприятные погодные условия (в основном перепад температуры воздуха). Понижение температуры воздуха до -4 С во время мейоза в годы исследования вызывало деградацию и массовую гибель микроспороцитов, снижая тем самым репродуктивные возможности деревьев. При определении числа хромосом в клетках апикальной меристемы листьев у вяза было установлено, что деревья, имеющие лучшие морфологические характеристики, являются миксоплоидами. Миксоплоидия в меристеме листьев обеспечивается присутствием клеток разного уровня плоидности, в том числе и с диплохромосомами. Наличие диплохромосом в клетках меристемы листьев у деревьев вяза описано впервые. Впервые у скумпии кожевенной (Cotinus coggygria Scop.) изучены особенности пролиферации клеток меристемы листьев при комплексе стрессорных воздействий. Выявлены неравномерные деления клеток меристемы, обусловливающие их вариабельность по длине (от 7,5 до 30,0 мкм). Частота встречаемости двоек, троек и четверок клеток составляет 86,5%. Измерение размеров делящихся клеток (особенно сравнение размеров сестринских клеток) может дать существенную информацию для познания внутриклеточного механизма, обеспечивающего переход клетки к митозу, при достижении ею определенного критического размера. Изучение числа хромосом в клетках меристемы листьев у скумпии показало, что клетки имели преимущественно диплоидный набор хромосом (2n = 30). Однако наряду с такими клетками наблюдались анеуплоидные 2,7%, одноядерные
полиплоидные - 1,9%, а также двуядерные - 10% и многоядерные - 3%. На основании полученных результатов высказывается предположение о том, что полиплоидизирующие митозы, наряду с обычными, и нарушения митотического деления, приводящие к образованию анеуплоидных клеток, формируют в меристеме листьев гетерогенную клеточную популяцию. В такой популяции в результате действия внутрипопуляционного клеточного отбора может быть обеспечено оптимальное сочетание клеток разного уровня плоидности для наиболее эффективной реализации функций генов, необходимых в конкретных условиях. Это дает основание полагать, что гетерогенность клеточной популяции в меристеме листьев способствует устойчивости в экстремальных условиях не только листа, как важнейшего органа растений, но и вида в целом. Впервые у скумпии наблюдался процесс формирования многоклеточных железок, являющихся органами накопления веществ (таннинов), которые способствуют повышению устойчивости вида; а также одноклеточных волосков, предохраняющих листья от избыточной транспирации. Длина инициальных клеток трихом, которые формируются в эпидермисе, была около 40 мкм. Они имеют крупное ядро, что позволяет предположить их полиплоидную природу. Впервые изучен кариотип у интродуцированной формы ели колючей (голубой формы) - Picea glauca (Moench) Voss. = P. canadensis B. S. P. в клетках меристемы хвои. У 8 из 10 изученных деревьев, кроме А-хромосом (2n = 24) встречаются В-хромосомы. Добавочные хромосомы установлены как в клетках меристемы хвои материнских деревьев, так и в корешках проростков семян. Частота встречаемости В-хромосом, во всех учтенных клетках, составляет 100%. В клетках меристемы хвои обнаружено по 1 В-хромосоме дополнительно к основному набору (2п = 24 + 1В), а в клетках меристемы корешков 1 и 2 В-хромосомы: (2п = 24+1В) и (2п = 24 + 2В), соответственно. Это дает основание полагать, что присутствие В-хромосом обеспечивает адаптивный успех самим деревьям, создавая предпосылки для проявления их репродуктивной
способности, нарушенной интродукцией и антропогенным стрессом, и повышает жизнеспособность у их потомства. По-видимому, в сложных экологических условиях гомеостатичность у данного вида поддерживается с помощью В-хромосом (в результате компактизации части хроматина ядра). У деревьев без В-хромосом в клетках меристемы хвои наряду с 24 хромосомами А-набора обнаружены тетраплоидные клетки (2n = 4х = 48). Такие клетки встречались с частотой 3,8%, также обеспечивая гетерогенность клеточной популяции. Предложена оригинальная гипотеза происхождения В-хромосом как изохромосом, образующихся из спутникового участка при разрыве А-хромосом в области вторичной перетяжки. Установлены общие и специфические механизмы, поддерживающие гомеостатичость у отобранных древесных видов-интродуцентов к комплексу стрессорных факторов. К механизмам общего типа относятся: гибридность - повышающая уровень гетерозиготности организмов; миксоплоидия, повышающая стабильность генетической системы (при полиплоидизации геномов отдельных клеток). Видоспецифическим механизмом является наличие В-хромосом дополнительно к основному А-хромосом набору.
Практическое значение. Получены данные, дополняющие сведения о механизмах поддержания гомеостаза у древесных растений, которые необходимо учитывать, планируя интродукцию конкретных видов. Определены критерии генетической оценки перспективных форм у видов-интродуцентов древесных и диагностики наследственных свойств их семенного потомства, обусловливающие устойчивость при комплексном воздействии интродукции и антропогенного прессинга: а) количественные и качественные показатели мейоза; б) кариотипические характеристики; в) особенности прохождения митоза. Установлены механизмы общего и видоспецифического типа, обеспечивающие гомеостатичность у трех видов древесных растений таких, как вяз мелколистный - Ulmus pumila (L.), скумпия кожевенная - Cotinus coggygria (Scop.) и ель колючая (голубая форма) - Picea glauca (Moench) Voss. = P.
canadensis В. S. P., которые необходимо учитывать при их селекции. Это позволит проводить целенаправленный отбор на устойчивость, что будет способствовать улучшению качества зеленых насаждений. Это особенно важно для крупных промышленных городов, в том числе, и такого как Воронеж. Микрофотографии В-хромосом использовали, как иллюстративный материал при чтении спецкурса по «Цитогенетике» для студентов IY курса дневного отделения биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.
Исследования выполнялись с 1997 по 2003 в рамках темы НИР, разрабатываемой на кафедре генетики, селекции и теории эволюции и НИЧ 1р004, 3003р5.
Выражаю особую признательность сотрудникам кафедры генетики, селекции и теории эволюции: доценту М.Н. Назаровой, доценту Н.Н. Тульновой, инженеру Л.С. Мурой, инженеру М.М. Носову и сотруднику заповедника «Галичья гора» Воронежского госуниверситета М.В Ушакову за помощь при подготовке диссертационной работы.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных чтениях: «Проблемы эволюционной цитогенетики, селекции и интродукции» (Томск, 1997); симпозиуме «Проблемы повышения экологических функций леса» (Воронеж, 1999); XIX Мичуринских чтениях «Современные проблемы генетики и селекции плодовых и ягодных культур и пути их решения» (Мичуринск, 1999); XX Мичуринских чтениях «Проблемы и перспективы отдаленной гибридизации плодовых и ягодных культур» (Мичуринск, 2000); XIY межреспубликанской научно - практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий» (Краснодар, 2001); Международной научно -практической конференции «Интеграция науки и высшего лесотехнического образования по управлению качеством леса и лесной продукции» (Воронеж, 2001); Y всероссийском популяционном семинаре «Популяция, сообщество,
эволюция» (Казань, 2001); научной конференции «Интродукция растений. Охрана и обогащение биологического разнообразия видов» (Воронеж, 2002); XXI Мичуринских чтениях: «Проблемы формирования генетических коллекций плодовых, ягодных культур и перспективы их селекционного использования» (Мичуринск, 2002); International Conference «Dynamics and conservation of genetic diversity in forest ecosystems» (Strasbourg, 2002); International Congress «Emerging trends in plant chromosome research» (Punjabi, 2003). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Источники генотипической адаптации
Генотипическая адаптация представляет собой более короткий путь наследственной изменчивости, связанный с генотипическим изменением растения или состава популяции. Генотипическая (филогенетическая) адаптация происходит за счет генотипической изменчивости, т.е. путем перестройки физиолого-биохимических, морфологических признаков и формированием новых норм реакций, (т.е. новых генотипов) в процессе естественного или искусственного отбора. Генотипическая адаптация обеспечивает приспособленность организмов к долговременным изменениям условий среды обитания (Бессчетнова, 1971; Тимофеев-Ресовский, 1977). Генотипическая адаптация стала основой эволюции, потому что ее достижения закреплены генетически и передаются по наследству (Пахомова, 1995).
Мутации и рекомбинации рассматриваются в качестве основных источников генотипической изменчивости растений, обусловливающих потенциал филогенетической адаптации. Частота, спектр мутаций и рекомбинаций имеют широкую амплитуду колебаний в пределах генома, а также между разными видами растений и разновидностями вида. В этом смысле частоту и спектр мутационной и рекомбинационной изменчивости можно рассматривать в качестве адаптивного свойства вида.
Теория мутаций, высказанная СИ. Коржинским в 1899 г., была обоснована и развита Гуго де Фризом в 1901 г., который создал мутационную теорию на основе исследования признаков растений ослинника (Oenothera glazioviana). В соответствии с определением Г. де Фриза мутация представляет собой явление скачкообразного, прерывистого изменения наследственного признака. Однако, в действительности оказалось, что Г. де Фриз не получил мутаций, а наблюдал, в основном, результат комбинативной изменчивости. Все формы, с которыми он работал, оказались сложными гетерозиготами по транслокациям. Несмотря на это, сформулированное им представление о мутациях, было правильным и имеет фундаментальное значение. Природу мутаций, их индуцирование, частоту возникновения, характер распределения изучали многие исследователи (Сойфер, 1969; Дубинин, 1976, 1978а; Ауэрбах, 1978; Дубинин, Пашин, 19786; Лучник, 1978; Митрофанов, Олимпиенко, 1980; Рапопорт и др., 1980; Тарасов, 1982; Щербаков, 1982 и др.). В последние годы XX века было показано, что в основе возникновения мутационного процесса, независимо от причины (физические, химические, биологические мутагены), важная роль принадлежит активным формам кислорода и продуктам перекисного окисления липидов (Chiu et al., 1989; Chiu, Liu, 1997; Bunout, Cambiazo, 1999; Kang et al., 1999; Bohr et al., 1999; Бурлакова, 2001; Мазурик, Михайлов, 2001).
Существует несколько принципов классификации типов мутаций (Инге-Вечтомов, 1989). А. По характеру изменения генома: Геномные мутации - изменение числа хромосом. 2. Хромосомные мутации, или хромосомные перестройки — изменение структуры хромосом. 3. Генные мутации - изменения генов. Б. По проявлению в гетерозиготе: 1. Доминантные мутации. 2. Рецессивные мутации. В. По уклонению от нормы или так называемого дикого типа: 1. Прямые мутации. 2. Реверсии. Г. В зависимости от причин, вызывающих мутации: 1. Спонтанные, возникающие без видимой причины. 2. Индуцированные. Д. По локализации в клетке: 1. Ядерные. 2. Цитоплазмотические (мутации неядерных генов). Е. По отношению к возможности наследования: 1. Генеративные, возникающие в половых клетках. 2. Соматические, возникающие в соматических клетках. Ж. По характеру действия: 1. Нейтральные. 2. Летальные. 3. Полулетальные. 4. Незначительно благоприятные.
Хотя большинство мутаций снижают приспособленность генотипов к среде обитания, характер и уровень мутабильности представляют адаптивное свойство вида (Дубинин, 1966). Примером адаптивных мутаций могут служить инверсии. Адаптивное значение инверсий в популяции состоит в том, что в инвертированном участке хромосомы естественный отбор может создать определенный комплекс генов, гомозиготы по которому будут обладать
приспособленностью к специфическим условиям среды. Известно, что в гетерозиготах по инверсии адаптивный комплекс генов защищен от рекомбинационного разрушения.
Мутации генов являются первичным источником наследственной изменчивости у всех организмов. В результате мутаций возникают случайные изменения признаков, т.е. эти изменения адаптивно не направлены. Естественным и искусственным отбором закрепится лишь небольшая часть этих изменений. Нейтральные мутации бывают редко и большинство новых мутаций оказываются частично вредными. Летальные мутации проявляются обычно либо как доминантные, либо как рецессивные (Stern, Tigerstedt, 1974). Полулетальные мутации в разной мере ослабляют жизнеспособность организма или клетки. Благоприятные мутации представляют собой разновидность вредных мутаций в том смысле, что одна и та же мутация в зависимости от условий внешней и внутренней среды может быть как полезной, так и вредной (Кимура, 1985). Так, десинаптические мутанты у вяза обнаруживали наибольшую устойчивость в засушливых условиях полупустыни (Буторина, 1989а). Важное адаптивное значение имеет также полиплоидия, о чем можно судить по встречаемости полиплоидных форм разных видов растений, в основном, на границах ареалов в экстремальных природных условиях (Левицкий, 1976). Повышению мутабильности способствует также гибридизация, особенно отдаленная. При этом аллополиплоидия способна обеспечить фертильность отдаленных гибридов. Об этом свидетельствуют примеры таких культурных растений, как пшеницы, сливы и др.
Роль интродукции в обогащении состава насаждений древесных растений и улучшении экологической ситуации промышленных городов
К XXI веку города превратились в огромные мегаполисы и становятся средой обитания для почти 80 % жителей нашей планеты. Города становятся по выражению Одума (1975) «паразитами биосферы». Для преодоления экологического кризиса необходим переход к новой идеологии, к экологизации экономики и производства (Гирусов и др., 1998).
В решении ряда экологических вопросов немалая роль отводится насаждениям (Колесников, 1974; Горышина, 1979; Реймерс, 1990). Растительный компонент городских экосистем существенным образом влияет на экологическую обстановку города, снижает негативное воздействие техногенного загрязнения и оптимизирует городскую среду.
Однако в ряде случаев озеленение городов не может удовлетвориться ассортиментом местной флоры древесных растений, поэтому введение в культуру новых, ранее не произраставших в данном естественноисторическом районе видов и форм древесных растений, на основе современных достижений генетики и селекции, имеет важное значение.
При подборе древесных пород для интродукции большое внимание уделяется изучению исходного материала (Вавилов, 1960; Бородина и др., 1970; Тахтаджян, 1974, 1978а; Плотникова, 1981; Соколов, Связева, Кубли, 1986 и др.). Высокая эффективность зеленых насаждений культурных ценозов, превышающая эффективность ценозов местных видов, может быть обеспечена подбором самых перспективных видов и форм древесных растений в отношении быстроты роста, устойчивости к неблагоприятным факторам среды вредителям и болезням, повышенной декоративности и соответствующим уровнем взаимодействия всех компонентов искусственного ценоза. Особенно ценно сочетание всех перечисленных качеств в одной породе (Лапин и др., 1979; Артюховский и др., 1985; Проскуряков, Рубаник, 1986; Науменко, Смогунова, 1994). Создание зеленых насаждений из интродуцированных древесных растений с учетом их выявленных генетических особенностей (внедрение гибридных, миксоплоидных, полиплоидных и др. форм) обеспечит более высокую степень их адаптации, и будет способствовать улучшению качественного состава насаждений. Таким образом, интродукция, осуществляемая на генетической основе, ведет к тому, что интродуцированные древесные растения с необычными для новых условий свойствами обогащают местные фитоценозы, генофонд древесных растений. Интродуцированные древесные растения повышают гетерогенность городских насаждений и тем самым повышают устойчивость насаждений в экстремальных условиях произрастания.
Интродукция древесных растений в г. Воронеже и Воронежской области осуществляется на базе Центрального научно-исследовательского института лесной генетики и селекции (ЦНИИЛГиС), ботанического сада Воронежского государственного университета, дендрологического парка и лесничества учебно-опытного лесхоза Воронежской государственной лесотехнической академии (ВГЛТА), сада им. Б.А. Келлера Воронежского государственного агроуниверситета (ВГАУ). В общей сложности на их территории произрастает не одна тысяча интродуцированных видов и форм древесно - кустарниковых пород (Григорьевская, 2000).
Интродуцированной дендрофлоре Ботанического сада ВГУ, городских парков, в том числе и ЦПК и О «Динамо» и окрестностей г. Воронежа посвящены работы авторов (Машкина, 1939а, 19396, 1949, 1954, 1971; Голицина, 1952; Козо-Полянского, 1952; Данилова, 1960; Николаева, 1977, 1996; Назаровой и др., 2001). Для правильного выбора состава озеленительных посадок необходимо знание генетических механизмов, обеспечивающих устойчивость в городских условиях, декоративных свойств и биологии отдельных пород. Подбор ассортимента высокодекоративных, устойчивых древесных и кустарниковых растений для озеленения во многом определяет облик объектов зеленой архитектуры, их эстетическую ценность и благотворное воздействие на человека.
Среди интродуцентов преобладают североамериканские виды, которые, как правило, хорошо адаптируются в условиях г. Воронежа. Тарачков (1856), объяснил это явление сходством климатических условий Северной Америки и Воронежской области. Отдел Голосеменные (Pinophyta) представлен 32 видами, из них 13 видов являются выходцами из Северной Америки. К этой группе принадлежат, например, ель колючая (голубая форма) - Picea glauca (Moench) Voss. - P. canadensis B. S. P; лжетсуга Мензиеза - Pseudotsuga menziesii (Mirb.); туя западная - Thuja occidentalis (L.); сосна веймутова - Pinus strobes (L.); сосна желтая - Pinus ponderosa (Dougl. et Laws) и др. В саду им. Б.А. Келлера растет Ginkgo biloba (L.) - гинкго двулопастный (Машкин, 1954, 1971; Лапин и др., 1979). Известно, что наиболее устойчивыми к комплексу стрессорных факторов крупного, промышленного города Ворнежа являются - ель колючая (голубая форма) и лжетсуга мензиеза (Буторина, Мурая, 1976; Буторина, Богданова, 2001; Сучкова, 2002). В городских насаждениях широко представлены и виды -интродуценты лиственных пород. Наиболее распространены виды из родов тополь - Populus; клен - Acer; сирень - Syringa. Хорошо прижилась в скверах и межквартальных посадках катальпа бигнониевая - Catalpa bignonioides (Walt.). Высокоустойчивыми и поэтому широко распространенными видами для городских улиц являются, например, вяз мелколистный - Ulmus pumila (L.); тополь бальзамический - Populus balsamifera (L.); акация белая - Robmia pseudoacacia (L.) (Лесные экосистемы ...., 1999). К устойчивым видам в зеленых насаждениях г. Воронежа принадлежит и скумпия кожевенная — Cotinus coggygria (Scop.). Скумпия выделяет большое количество фитонцидов, что повышает ее устойчивость (Барышман, 1958; Покозий, 1971; Артюховский и др., 1994).
Перечисленные древесные растения по-разному устойчивы в условиях г. Воронежа. Генетические механизмы, обеспечивающие гомеостаз в условиях интродукции и антропогенного стресса, в целом, слабо изучены, а у видов-интродуцентов в Воронежской области не исследовались вообще. Ранее цитогенетические механизмы устойчивости растений к условиям интродукции исследовали: Базилевская, (1964, 1981); Буторина, Мурая, (1976); Буторина и др., (19826); Тарасенко, (1980, 1983, 1995); Муратова, Владимирова, (2001); к экстремальным условиям произрастания: Соколовская, Стрелкова, (1938); Darmer, (1947); Бреславец, (1963); Круклис, (19716); Карташова, Малахова, (1973); Жукова, Петровский, (1975); Леме (1976); Moir, Fox, (1977); Teoh, Rees, (1977); Ehrendorfer, (1980); Stebbins, (1980, 1985); Сиволапов (1987); Hizume et al, (1988); Муратова (1990); Калашник, (1992); Седельникова, (1997) и др.
Таким образом, подбор интродуцированных древесных растений для озеленения мегаполисов должен прежде всего осуществляться с учетом их генетических особенностей, способствующих устойчивости к экстремальным условиям.
При создании интродукционной популяции, которая есть лишь часть природной популяции, имеющая по сравнению с ней обедненный генофонд, очень важно выявить максимум потенциальных возможностей этого генофонда. Поэтому для интродукции интересно выявлять не только морфологические изменения, но и цитогенетические, способные вести к повышению жизнеспособности и устойчивости к неблагоприятным условиям среды. На основании состояния кариотипа, процесса мейоза, семенной продуктивности можно судить о генетической стабильности видов - интродуцентов и их популяций (Тарасенко, 1980, 1983, 1995).
Изучение числа митотических хромосом в клетках апикальной меристемы листьев у модельных деревьев вяза
Полученные результаты могут быть использованы для уточнения механизмов, поддерживающих гомеостаз. Как показали проведенные исследования и статистическая обработка данных, разные уровни антропогенной нагрузки в местах произрастания опытных деревьев вяза не оказали влияния на особенности их цитогенетических характеристик. Это можно рассматривать как проявление высокой гомеостатичности видов рода Ulmus, обеспечиваемой их широкой нормой реакции по признаку устойчивости к неблагоприятным факторам. Более значительное влияние на эти показатели оказал температурный фактор (например, на сроки наступления мейоза и репродуктивные способности у отобранных деревьев вяза). Были установлены достоверные различия по степени мутабильности между стадиями мейоза у изученных деревьев вяза, которые, по-видимому, обусловлены особенностями их генотипа. Поскольку на всех пробных площадях отбирались для исследования только фенотипически лучшие деревья, следовательно и более устойчивые к антропогенным стрессорам деревья, то определенный теоретический и практический интерес могут представлять установленные цитогенетические механизмы, их гомеостаза. На основании полученных результатов предполагается возможность таких генетических механизмов, поддерживающих гомеостаз, как миксоплоидия и гибридность. Миксоплоидия усиливает жесткость генетической системы за счет присутствия полиплоидных клеток (как в клетках генеративной ткани, так и в клетках апикальной меристемы листьев) наряду с диплоидными, которыми
поддерживается ее пластичность. Гибридность, в результате которой, с одной стороны, появляется значительное число аномалий в мейозе, подавляющие развитие генеративной сферы, но, с другой стороны, способствующие интенсификации ростовых процессов из-за соответствующего перераспределения пластических веществ в онтогенезе. Для озеленения г. Воронежа используется декоративный вид - скумпия кожевенная (Cotinus coggygria Scop.), являющийся интродуцентом в Воронежской области. В условиях средней полосы России, в том числе, и в г. Воронеже чувствует себя нормально. Однако интродуцированные растения, используемые в озеленении промышленных городов, могут испытывать двойной стресс, поскольку они выращиваются за пределами ареала и в условиях высокой антропогенной нагрузки. Поэтому важно проводить отбор наиболее устойчивых из них к экстремальным условиям. В последнее время загрязнение окружающей среды становится важным внешним фактором, к которому растения эволюционно не приспособлены. Загрязнение среды сильно влияет на их рост, развитие, состояние естественных и культурных фитоценозов не только в локальном, но и глобальном масштабах. Кислые дожди, увеличение концентрации озона в приземном слое воздуха, уменьшение стратосферного слоя озона, увеличение интенсивности ультрафиолетового излучения и глобальное потепление климата рассматриваются как результат деятельности человека, который может вызвать непредсказуемые последствия для живой природы (Fuhrer et al., 1989; Kerr, McEiroy, 1993; Hoffman, Persons, 1997; Pickering, Owen, 1997). В связи с увеличением роли антропогенных факторов в загрязнении среды чрезвычайное значение приобретает изучение комплексного воздействия природных и антропогенных факторов на живые организмы. Установлено, что загрязняющие среду вещества оказывают на растения не только прямое отрицательное воздействие, но и сужают пределы толерантности, т.е. уменьшают их устойчивость к естественным факторам (температуре, влажности и др.). С другой стороны, в зависимости от условий естественной среды влияние на растения одних и тех же загрязняющих веществ в сходных концентрациях может быть различным (Cumming et al., 1989; Dueck et al., 1994; Sutinen, 1994).
Было показано, что техногенные загрязнения, которые неизбежны в крупном промышленном городе, обладают фитотоксическим действием. У наиболее чувствительных видов растений (например, липы мелколистной и каштана конского), произрастающих в насаждениях г. Воронежа, они вызывают видимые изменения листьев (потерю тургора, возникновение некрозов, хлорозов, изменение окраски) уже в начальном периоде вегетации (в первой декаде июня). У этих видов встречались также аномальные формы листьев (Шунелько, 2000). Стеббинс (Stebbins, 1965) установил, что гены контролирующие форму листьев и других частей растений, проявляют свое действие, влияя прежде всего на темп и распределение митозов. Однако у скумпии, также используемой в озеленении города, в сходных условиях произрастания подобных изменений листовой пластинки не было обнаружено. Это обстоятельство послужило обоснованием актуальности изучения функционирования меристемы листьев у скумпии, поскольку оно может свидетельствовать об устойчивости в экстремальных условиях произрастания как листа - важнейшего органа растений, так и вида в целом.
Ранее было установлено, что листья древесных растений могут быть использованы как материал для оценки степени загрязнения воздушного бассейна тяжелыми металлами (Junzo et al., 1992; Sawidis, Marnasidis, 1995; Бессонова и др., 1996; Гуськов и др., 2000). Митоз у скумпии практически не изучен. Определено только число хромосом на метафазных пластинках (2п = 30) (Волховских и др., 1969). Исследования же митоза у скумпии в экстремальных условиях произрастания (комплексное влияние техногенных загрязнений и интродукции) не проводились вообще, поэтому в задачу исследования входило изучение функционирования клеток меристемы листьев у скумпии в экстремальных условиях и установление изменений хромосомного аппарата в митозе, которые могли бы способствовать адаптации вида. Изучение клеток меристемы у скумпии показало, что длина клеток изменяется от 7,5 до 30 мкм, а средняя длина хромосомы составляет около 1 мкм. В меристеме листьев, обработанных 0,002-молярным раствором 8-оксихинолина, учитывали только клетки, в которых было можно подсчитать число хромосом. Подсчет хромосом в клетках меристемы листьев выполнен у пяти деревьев скумпии кожевенной. Анализ 537 метафазных пластинок показал, что клетки листьев у отобранных деревьев скумпии имели преимущественно диплоидный набор хромосом (2n = 30) (рис. 9, а).
Механизмы, обеспечивающие устойчивость как листа, так и вида в целом
Наблюдаемые процессы деления в клетках меристемы листьев у скумпии свидетельствуют о том, что меристема представлена клетками, которые различаются по числу хромосом. Миксоплоидия обеспечивает лабильность меристемы (Sivolapov, Blagodarova, 1997), так как является гибким механизмом, регулирующим дозы генов, определяющих устойчивость вида. У голосеменных растений миксоплоидия - достаточно редкое явление, что обусловлено большей стабильностью их генома. Миксоплоидные формы были обнаружены у сосны, ели, лиственницы (Kanezava, 1949; Mergen, 1958; Круклис, 1971; Jonson и Saylor, 1972; Исаков и др., 1977; Муратова, 1978; Буторина, 1982а, 1987, 1988; Сунцов, 1982). Это, как правило, слабожизнеспособные формы. Однако было показано, что у ели колючей наличие В - хромосом в клетках меристемы корешков проростков семян и хвоинок способствовало усилению семеношения в экстремальных условиях существования (Буторина, Богданова, 2001). Среди покрытосеменных древесных растений миксоплоидия наиболее распространена. Миксоплоиды установлены у дуба, березы, вяза, тополя (Woodworth, 1930; Буторина и др., 19826, 1986; Буторина, 1985, 19896). На примере женского клона тополя сереющего показано (Сиволапов, 1987), что миксоплоидная природа меристемы листьев обеспечивает хороший рост и жизнеспособность этого клона в экстремальных условиях за счет определенного сочетания клеток разного уровня плоидности при изменении условий среды. У миксоплоидов часто увеличивается синтез веществ, представляющих хозяйственную ценность для человека. Общеизвестны факты повышения количества синтезируемого продукта у полиплоидов, например, эфирного масла у тетраплоидов камфорного базилика и мяты перечной, сахаристости корнеплодов у триплоидов сахарной свеклы (Лутков, 1962, 1966).
На клеточном уровне известны три взаимосвязанные системы, обеспечивающие поддержание стабильности генома: 1) система окислительно-восстановительного гомеостаза, продуцирующая различные цитотоксические факторы, в том числе активные формы кислорода (Н202 - перекись водорода, супероксидный анион-радикал, ОН - гидроксильный радикал), участвующие в элиминации генетически чужеродного материала; 2) система контроля клеточного цикла в сверочных точках (checkpoints), которая обеспечивает экстренное удаление клетки с патологически измененной ДНК, способной нарушить постоянство генома. Главным компонентом этой системы является опухолевый супрессор — белок р53; нарушение функции опухолевых супрессоров (р53, pRb) приводит к дисфункции сверочных точек клеточного цикла (checkpoints) и к нестабильности генома (Копнин, 2000); 3) механизмы репарации ДНК.
Охватывающие геном мутации, названные адаптивными, появляются в ответ на стрессорные воздействия. Они регулируются у прокариот SOS-ответом - комплексом последовательных реакций, включающих индукцию генных продуктов, блокирующих клеточное деление. SOS-ответ, широко изученный у Escherichia coli, является глобальным ответом на повреждение ДНК, прототипом контроля клеточного цикла в сверочных точках и системы репарации ДНК.
В отсутствие функционально полноценного SOS - ответа клетки чувствительны к ДНК - повреждающим агентам (McKenzie et al., 2000). Аналогичная система быстрого ответа на повреждение ДНК существует и в клетках млекопитающих. Показано, что в клетках млекопитающих двунитевые разрывы ДНК могут быть результатом нормальных метаболических процессов или действия ДНК - повреждающих агентов, например, ионизирующей радиации или специфических ферментов, которые инициируют рекомбинацию. Нерепарированные двунитиевые разрывы могут приводить к таким последствиям, как гибель или трансформация клеток. Репарация двунитиевых разрывов у млекопитающих происходит, например, путем гомологичной рекомбинации (Мазурик, Михайлов, 2001). Активация онкогена может индуцировать нестабильность путем нарушения в клетках эксцизионной репарации, находящейся под контролем гена р53 (Mendonca et al., 1999).
Однако мутагенез, наблюдаемый в клетках организма, существующего в реальных условиях повышенного фона техногенных воздействий, связанных с человеческой деятельностью, обусловлен факторами, многообразие и эффекты которых трудно учесть. In vivo нестабильность генома может возникать от действия разных генотоксических факторов.
Известно, что лист растения может функционировать только тогда, когда способен к газообмену с окружающим воздухом. Следовательно, он чувствителен к атмосферному загрязнению. Одной из наиболее распространенной формой атмосферного загрязнения в г. Воронеже является двуокись азота (N02), возникающая при любых процессах горения в воздухе, поэтому присутствующая и в автомобильных выхлопах. Под влиянием света NO2 расщепляется на NO и атомарный кислород. Последний образует с молекулярным кислородом озон. Это вещество - высокотоксично. У растений озон повреждает тонкостенные палисадные клетки, изменяя проницаемость мембран - клеток и хлоропластов (Рейвн и др., 1990; «Доклад об использовании ...,2001).
Оксид азота (NO) - высокореакционноспособная радикальная молекула, имеющая на внешней я - орбитали неспаренный электрон. Оксид азота (NO) служит регулятором многих биохимических и физиологических процессов и оказывает существенное влияние на протекание окислительно-восстановительных реакций, продуктами которых являются активные формы кислорода (АФК) (Ванин, 1998). В водной фазе взаимодействие NO с супероксидным анион - радикалом приводит к образованию пероксинитрита (ONOO") - высокотоксичного соединения, обладающего существенно большей реакционной способностью, чем NO и супероксидный анион-радикал, являющегося сильным ДНК - расщепляющим агентом (Маеда, Акаике, 1998), что приводит к усилению повреждения ДНК, а также митохондриального окисления. Так, установлено, что при действии ионизирующей радиации на кроветворные клетки - предшественники при повышенном содержании оксида азота в них наблюдалось подавление митохондриальной функции, связанное с ингибированием дыхательного комплекса I (НАД.Н - дегидрогеназы) и III (цитохром с - редуктазы) из-за усиленного образования пероксинитрита (Реагсе et al., 2001).
Существует гипотеза, что механизм индуцируемой нестабильности генома заключается в том, что в потомстве облученных клеток возникает увеличение образования АФК, которое приводит к оксидативному повреждению ДНК и, как следствие, повышает частоту клеточной гибели, соматических мутаций и аберраций. Дестабилизация хромосом уже давно рассматривается как первый и прямой признак общей нестабильности генома (Sabatier et al., 1992). Нестабильность - состояние генома, когда в клетках организма наблюдается повышенное количество спонтанных повреждений, высокая частота мутаций и темпов мутирования, повышение уровня амплификации генов и изменение характера генной экспрессии. На организменном уровне нестабильность генома проявляется увеличением риска опухолевой и других патологий (Безлепкин, Газиев, 2001).
Увеличение синтеза стрессорных белков и протоонкогенов вследствие активации их генов, является звеном неспецифической адаптации к действию разных факторов. Активация механизмов репарации ДНК в клетках с высоким уровнем эффективности антиоксидантных механизмов приводит к устранению структурных повреждений в геноме и нормализации метаболических процессов. Часть клеток, сохранивших повреждения, элиминируется механизмами апоптоза - одной из форм клеточной гибели, сходной у клеток самоубийц разных организмов (Lane, 1992).
Нестабильность генома может рассматриваться как проявление готовности к адаптационным изменениям. Это было показано на примере радиационно - индуцированной нестабильности генома (Бурлакова и др., 2001; Мазурик, Михайлов, 2001).
