Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание и совершенствование мощных технологий, позволяющих детализировать молекулярные процессы, регулирующие развитие, привело к тесному сплетению генетики, клеточной биологии и биологии развития, и многие гены, которые, считалось, выступают в роли регуляторов основных биологических функций клетки (гены домашнего хозяйства), оказалось, обладают специфическими регуляторными функциями в развитии. Поэтому изучение особенностей проявления генов, кодирующих эволюционно консервативные факторы транскрипции, является актуальной проблемой.
Инсерционная мутация leg-arista-wing complex (lawc) дрозофилы, нарушающая правильную экспрессию многих локусов, была обнаружена в 1992 году в лаборатории Т.П. Герасимовой (ИОГен РАН). Район исследуемой инсер-ции был клонирован и картирован. Позднее в 1999 году в лаборатории Тидже-на (Tjan, США) у дрозофилы был открыт ген, гомологичный гену человека и кодирующий фактор базовой транскрипции ТВР related factor 2 (TRF2), который принадлежит к эволюционно консервативному семейству белков ТВР (TATA-box binding protein). Однако границы этого гена не были установлены. В первую очередь эти трудности обуславливались отсутствием мутаций, локализованных в этой области. И только к 2003 году, когда полностью расшифровали геном дрозофилы, стало ясно, что клонированная часть последовательности lawc лежит на расстоянии примерно 15 т.п.н. от открытой рамки считывания гена trf2. Открытие и клонирование инсерционной мутации lawc? сыграло важную роль в установлении границ гена trf2, в частности, района начала его транскрипции (совместная работа лабораторий П.Г. Георгиева, Ю.В. Ильина, Л.И. Корочкина, ИБГ РАН). В результате оказалось, что с одной мРНК trf2 могут синтезироваться две изоформы белка (полноразмерная и укороченная), отличающиеся N-концевыми последовательностями. Район локализации lawc (7Е район цитологической карты Х-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких летальных мутаций разной природы. Поэтому стало актуально изолировать аллели, нарушающие экспрессию конкретных изоформ TRF2.
Некоторые /awe-мутации вызывают стерильность самок, другие аллели приводят к раннему старению организма. В настоящее время старение предположительно связывают с нарушением самовоспроизведения стволовых клеток в репродуктивной системе. Гаметогенез у дрозофилы исследован очень хорошо. Однако его генетический контроль изучен недостаточно. Например, неизвестно, каким образом происходит выбор ооцита среди шестнадцати клеток цисты, хотя уже ясно, что за его спецификацию отвечает недавно открытая цитоплаз-матическая структура, возникающая в стволовых клетках полового пути, названная фьюсомой. Поэтому изучение генетической регуляции процессов идентификации ооцита и поддержания его статуса, а также самовоспроизведения стволовых герминативных клеток и старения предполагает исследование стерильных и слабофертильных мутантов у хорошо изученных модельных организмов.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в идентификации мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию каждой из изоформ фактора транскрипции TRF2, и изучении их влияния на оогенез у Drosophila melanogaster.
В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:
провести серию генетических экспериментов по исследованию влияния трансгенных конструкций, экспрессирующих различные белковые изоформы гена trf2, на фенотип летальных мутаций, локализованных в районе lawc-trf2;
провести цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития в поисках причин нерасхождения хромосом в мейозе у /awe-мутантов;
исследовать особенности распределения белка TRF2 на политенных хромосомах слюнных желёз личинок дрозофилы;
изучить функциональные особенности lawc/trf2 в репродуктивной системе самок дрозофилы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания яичников стерильных и слабофертильных мутантов ооцитспецифичными и другими маркерами;
исследовать материнский эффект летальных аллелей lawc с помощью клонального анализа и флуоресцентного окрашивания.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были изолированы летальные аллели lawc с нарушенной экспрессией полноразмерной и укороченной изоформ белка TRF2. Установлено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Обнаружено, что нерасхождение хромосом в мейозе у /awe-мутантов вызвано нарушением структуры хромоцен-тра и спаривания гомологичных хромосом ооцита ранних стадий развития. Впервые показано, что продукт ген lawc/trf2 участвует в формировании клеточного цитоскелета и связанного с ним транспорта ооцитспецифичного белка Orb. Обнаружено влияние уровня экспрессии lawc/trf2 на организацию актина в эпителиальных клетках яичника. Установлено, что стерильность /awe-мутантов вызвана нарушением механизма дифференцировки герминативных и соматических фолликулярных клеток. Обнаружено, что у мутантов с сокращенной продолжительностью жизни отсутствует самовоспроизведение герминативных стволовых клеток.
Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена lawc/trf2, а также помогут решить ряд спорных вопросов, касающихся взаимосвязей сигнальных путей в оогенезе у дрозофилы. Учитывая, что у позвоночных, в том числе у млекопитающих и человека, присутствуют гомологичные гены, то можно предположить, что полученные данные будут иметь универсальное значение.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на XIV школе по биологии развития (Звенигород, 2005), VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое примене-
ниє» (Москва, 2006), на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), на конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2007) и на 46-й, 47-й и 49-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сан-Диего, 2005; Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, их них 3 статьи в рецензируемых журналах и 9 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (91 источник). Содержит 21 рисунок и 10 таблиц.
