Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Интроны как функциональные элементы генома 11
1.1.1 Представленность интронов у различных видов 11
1.1.2. Теории возникновения интронов 16
1.1.3. Консервативность интронов 17
1.1.4. Роль интронов в геноме 18
1.1.5. Интроны - источники некодирующих РНК 24
1.2. Ген Trithor-ax-like (Trt) D.melanogaster 27
1.2.1. Структура гена Trl 27
1.2.2. Транскрипция гена Trl 28
1.2.3. Регуляция экспрессии гена Trl 30
1.2.4. Доменная структура продукта гена Trl - белка GAGA (GAF) 33
1.2.5. ДНК-связывающая активность белка GAGA 37
1.2.6. Белок-белковые взаимодействия белка GAGA 40
1.2.7. GAF как модификатор структуры хроматина 42
1.2.7.1. Участие белка GAGA в регуляции экспрессии генов 43
1.2.7.2. Роль белка GAGA в функционировании различных регуляторных элементов 47
1.2.8. Взаимодействие белка GAGA с гетерохроматином и его влияние на деление клеток 53
1.2.9. Белок GAGA требуется для дозовой компенсации у самцов дрозофилы 54
1.2.10. Характеристика мутаций гена Trl 56
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1. Материалы, использованные в работе 60
2.2. Олигонуклеотиды 60
2.3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе 61
2.4. Анализ жизнеспособности 62
2.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии 62
2.6. Выделение геномной ДНК для использования в ПЦР 63
2.7. Выделение тотальной РНК из яичников и других тканей дрозофилы 63
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 64
2.9. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix 64
2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях 65
2.11. Получение Р32-меченых ДНК-зондов 65
2.12. Нозерн-блот гибридизация 66
2.13. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 66
2.14.Лигирование 66
2.15. Подготовка электрокомпетентных клеток E.coli 66
2.16. Электропорация плазмидной ДНК в клетки Е. coli 67
2.17. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 67
2.18. Скрининг бактериальных колоний с помощью ПЦР 68
2.19. Трансформация генома дрозофилы ^-транспозонами 68
2.20. Детекция (3-галактозидазы в органах и тканях дрозофилы 69
2.21. Выделение ядерного экстракта из эмбрионов дрозофил 69
2.22. Метод торможения ДНК-пробы в геле 70
2.23. Выделение рекомбинантного белка 71
2.24. Вектор для трансформации эмбрионов дрозофил 72
Глава 3. Результаты и обсуждение 73
3.1. Получение мутаций по второму интрону гена Trl 73
3.2. Идентификация и картирование полученных мутаций 77
3.2.1. Отбор линий, несущих перестройки 77
3.2.2. Картирование полученных перестроек 80
3.3. Анализ жизнеспособности полученных мутантов 85
3.3.1. Частичное восстановление жизнеспособности мутантов ТгГ"1ТгГ3 при введении дополнительных кДНК копий гена Trl 90
3.4. Анализ экспрессии гена 7>/у мутантов Trl1'72 93
3.5. Выявление консервативных фрагментов во втором интроне гена Trl 94
3.6. Изучение связывания ядерных экстрактов и рекомбинантного белка
GAGA с последовательностями второго интрона 98
3.7. Выявление энхансерных элементов второго интрона гена Trl с помощью трансформации эмбрионов дрозофилы 108
Заключение 113
Выводы 117
Список литературы 118
- Ген Trithor-ax-like (Trt) D.melanogaster
- Роль белка GAGA в функционировании различных регуляторных элементов
- Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
- Идентификация и картирование полученных мутаций
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Для эукариотических организмов характерно наличие дифференциальной экспрессии генов: большинство генов высших эукариот активны только в определённых типах клеток в определённые периоды онтогенеза и функционально неактивны во всех остальных клетках и на других стадиях развития. В результате в разных тканях организма происходит избирательная активация специфических генов. В связи с этим одной из центральных проблем современной биологии является исследование механизмов, обеспечивающих регуляцию дифференциальной активности генов
В последнее время становится все более очевидным, что наряду с 5'-областями генов, существенный вклад в регуляцию их экспрессии вносят интроны. Роль интронов в регуляции транскрипции генов была продемонстрирована на множестве эукариотических организмов, включая грибы, растения, позвоночных и беспозвоночных животных. Предполагается, что во многих случаях интроны оказывают даже большее влияние на формирование уровня и паттерна экспрессии генов, чем промоторные регуляторные районы (цит. по Alan B.Rose, 2008). Например, известно, что в больших интронах генов могут располагаться цис-регуляторные элементы, участвующие в ткане- или стадия-специфической экспрессии генов. К настоящему времени описано множество как позитивных, так и негативных регуляторных элементов, расположенных в интронах. Чаще всего они располагаются в самых больших интронах генов, особенно тех, которые имеют сложную картину экспрессии.
Одним их таких генов является ген Trithorax-like (Trl) D.melanogaster, который кодирует многофункциональный белок GAGA. Его правильная экспрессия необходима для множества процессов, протекающих на разных уровнях: на уровне ядра, клетки и целого организма. Этот белок участвует в регуляции экспрессии многих генов дрозофилы (гомеозисных, генов сегментации, генов «теплового шока», «домашнего хозяйства» и др. (Granok et al., 1995), способствуя формированию и/или поддержанию открытой структуры хроматина в регуляторных районах генов, что облегчает доступ к этим районам РНК полимеразы II и других специфических факторов (Wilkins and Lis, 1998). Известно, что белок GAGA связан с GA-богатыми последовательностями гетерохроматина на протяжении всего клеточного цикла и, возможно, участвует в установлении границ между эу- и гетерохроматином (Raff et al., 1994). Косвенным свидетельством в пользу этого предположения может служить то, что некоторые мутации гена 7)7 являются доминантными энхансерами эффекта положения мозаичного типа (Farkas et al., 1994). Белок GAGA участвует в функционировании энхансеров, сайленсеров, граничных элементов и инсуляторов (Ohtsuki and Levin, 1998; Strutt et al., 1997; O'Donnell and Wensink, 1994; Mishra et al., 2001; Busturia et al., 2001). Благодаря своей способности к олигомеризации, GAF может обеспечивать связь энхансера с промотором, которые могут располагаться как в одной, так и в разных молекулах ДНК (Mahmoudi et al., 2002). Кроме того, было показано, что этот белок участвует в формировании "клеточной памяти" о выбранном пути дифференцировки (Cavalli and Paro., 1998). Правильная экспрессия гена 7)7 необходима для нормальной жизнедеятельности дрозофилы, а мутации этого гена приводят к различным аномалиям: нарушениям клеточного деления, стерильности, снижению жизнеспособности (Bhat et al., 1996; Трунова и др., 2001). То есть функции белка GAGA охватывают широкий спектр процессов, необходимых для нормального развития D.melanogaster. Белок GAGA необходим и в ходе клеточных делений (как митоза, так и мейоза), и в интерфазном ядре, участвуя в регуляции транскрипции большого числа генов, входящих в сложноорганизованные генные сети, описывающие процессы роста и развития.
Хотя ген 7)7 относится к числу повсеместно экспрессирующихся генов, картина его экспрессии зависит от органа и типа ткани, от стадии онтогенеза и от температуры окружающей среды (Bhat et al., 1996; Soeller et al., 1993; Перелыгина и др., 1992; Baricheva et al., 1997). Можно предполагать, что такая сложная, зависящая от многих факторов, экспрессия данного гена определяется сложной системой регуляторных элементов. Однако к настоящему времени регуляторные районы гена 7)7 изучены недостаточно. Нет никаких данных относительно того, какие последовательности гена 7)7 имеют значение для его экспрессии в различных тканях и органах на разных стадиях онтогенеза при различных температурных условиях in vivo.
Ранее было показано, что гипоморфная мутация Тг1ЕР(3)3184, локализованная во втором интроне гена Trl, оказывает негативное влияние на динамику компактизации и сегрегации хромосом и морфологию яйцевых камер на разных стадиях развития дрозофилы (Трунова и др., 2001), что можно рассматривать как косвенные свидетельства того, что второй интрон гена Trl обладает регуляторным потенциалом. В связи с этим поиск регуляторных элементов во втором интроне гена Trl представляется перспективным.
Использование дрозофилы, как модельного объекта исследований, позволяет получать мутации в изучаемом районе и исследовать регуляторные элементы в эндогенном локусе в контексте целого организма в системе in vivo.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выявление и анализ функционально-значимых районов второго интрона гена Trithorax-like D.melanogaster. В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:
Получение и картирование мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trl D. melanogaster.
Молекулярно-генетический анализ полученных мутантов : а) исследование влияния этих мутаций на выживаемость дрозофил при различных температурах содержания мух; б) изучение уровня экспрессии гена Trl у мутантов.
3. Идентификация и анализ функционально-значимых участков второго интрона гена Trl: а) выявление эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне гена Trl; б) выявление сайтов связывания белка GAGA во втором интроне и изучение связывания рекомбинантного белка GAGA и белков эмбриональных ядерных экстрактов с выявленными сайтами.
Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью Р-элемент-индуцированной рекомбинации у самцов получены 23 новые мутации по гену Trl Dr.melanogaster, в том числе семь новых гипоморфных мутаций, представляющих
8 собой делеции, удаляющие различные участки второго интрона гена. Эти мутации могут служить удобным инструментом в изучении разнообразных функций белка GAGA. Все полученные мутации (20 делеций и три дупликации) картированы. Проведенный молекулярно-генетический анализ полученных мутантов позволил выявить во втором интроне гена Trl функционально-значимые районы: обнаружено, что делеции Trl3'85, Trl2'23, Trl3'59 , Trl1'23 и Trl1'72 во втором интроне гена Trl влияют на жизнеспособность мутантных мух, выращенных при различных температурах (25 и 29С), а делеция Trl1'72 во втором интроне вызывает изменение паттерна экспрессии гена при 29С. Впервые экспериментально показано связывание последовательностей второго интрона с рекомбинаптным белком GAGA и белками ядерных экстрактов клеток эмбрионов.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты дополняют имеющуюся информацию о регуляторном потенциале интронных последовательностей и расширяют возможности для дальнейших более детальных исследований регуляции гена Trl. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях:
International women's conference on Bien-technology (Daejion, Korea, 2003);
Международная конференция "Генетика в России и мире" (Москва, 2006);
ВОГИС III (Москва, 2004); XIV Школы по биологии развития «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 2004);
10-ой Пущинской Школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2006);
Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Украина, Харьков, 2008).
9 Публикации:
А.В.Катохин, А.В.Пиндюрин, Е.В.Федорова, Э.М.Баричева. Молекулярно-генетический анализ гена Trithorax-like, кодирующего транскрипционный фактор GAGA Drosophila melanogaster //Генетика. 2001. Т.37, № 4, С.467-474.
Е.В.Федорова, А.АОгиенко., Д.А.Карагодин, К.Г.Айманова, Э.М.Баричева. Получение и анализ новых мутаций по гену Trithorax-like Drosophila melanogaster // Генетика. 2006. Т.42. № 2. С. 149-158.
А.А.Огиенко, Д.А.Карагодин, С.А.Федорова, Е.В.Федорова, В.В.Лашина, Э.М.Баричева. Анализ новой гипомофной мутации гена Trithorax-like, влияющей на оогенез Drosophila melanogaster //Онтогенез. 2006. Т. 37. № 3. С. 157-166.
4. Е.В.Федорова, А.В.Пиндюрин, Э.М.Баричева. Поддержание паттернов экспресии гомеозисных генов в развитии Drosophila melanogaster белками групп Polycomb, trithorax и ЕТР // Генетика. 2009. Т. 45. №.10. С.1301—1318.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Получение и картирование мутаций выполнялись при участии Огиенко А.А. и Карагодина Д.С. (ИЦиГ СО РАН, лаборатория эволюционной биологии клетки). Изучение экспрессии гена Trl проведено при участии Карагодина Д.А. (ИЦиГ СО РАН, лаборатория эволюционной биологии клетки). Микроскопический анализ политенных хромосом проведен совместно с научным руководителем. Получение и очистка рекомбинантного белка проводились при участии Омелиной Е. (ИЦиГ СО РАН, лаборатория эволюционной биологии клетки). Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 241 ссылка. Работа изложена на 139 страницах печатного текста, содержит 3 таблицы и 21 рисунок.
Благодарности. Автор глубоко благодарен Баричевой Э.М., под руководством и при содействии которой была выполнена данная работа, и всем сотрудникам
10 лаборатории эволюционной биологии клетки - Огиенко А.А., Карагодину Д.А., Лашиной В.В., Павловой Н., Омелиной Е. за оказанную помощь в работе. Особую благодарность хотелось бы выразить Пиндюрину А.В. за предоставление вектора для экспериментов по трансгенезу, консультации, помощь в работе и дружескую поддержку; Васильеву Г.В., Брызгалову Л. и Антонцевой Е. за консультации; а также Меркуловой Т.И. и Волковой Е.И. за неоценимую помощь в планировании экспериментов и обсуждении результатов. Также автор выражает благодарность сотрудникам Цента микроскопических исследований ИЦиГ СО РАН.
Ген Trithor-ax-like (Trt) D.melanogaster
Ген Trithorax-like (Trl) D.melanogaster, расположенный в 70F1-2 районе 3L хромосомы, представлен в геноме единственной копией (Soeller et al., 1993) и кодирует многофункциональный ДНК-связывающий белок GAGA (GAF). Белок GAGA относится к белкам поддержания статуса экспрессии генов, отвечающих за эпигенетическое наследование или так называемую «клеточную память».
К настоящему времени установлено, что ген Trl имеет 7 экзонов (рис. 2). Первый экзон не является белок-кодирующим. Существует четыре донорных сайта сплайсинга на границе первого экзона и первого интрона. В результате альтернативного сплайсинга формируется четыре варианта первого экзона: 1а (46 п.н.), lb (112 п.н.), 1с (290 п.н.), Id (469 п.н). Экзон 2 во всех известных к настоящему времени последовательностях кДНК и EST начинается с одной и той же позиции 3618 (здесь и далее координаты нуклеотидов даны в соответствии с последовательностью AJ225042, EMBL). Во втором экзоне заканчивается некодирующая лидерная последовательность всех транскриптов, и с позиции 3853 п.н. начинается кодирующая часть гена. Экзоны 2 (427 п.н.), 3 (466 п.н.), и 4 (336 п.н.) одинаковы у всех известных кДНК, а 3 -концы мРНК формируются за счет альтернативного сплайсинга. Пятый экзон представлен двумя: коротким - 5а (138 п.н.) и длинным -5Ь (773 п.н.) вариантами. Также двумя вариантами представлен шестой экзон: коротким - 6а (506 п.н.) и длинным - 6Ь (1531 п.н.). Экзон 6Ь завершается сайтом полиаденилирования и может сочетаться как с экзоном 5а, так и с экзоном 5Ь, в то время как экзон 6а выявляется только в комбинации с экзонами 5Ь и 7. Седьмой экзон был обнаружен только в одном транскрипте, он также завершается сайтом полиаденилирования (Катохин и др., 2001).
В зависимости от числа экзонов в транскрипте может присутствовать от 5 до 6 интронов. Второй интрон является самым большим, его размер составляет 2353 п.н. Размеры других интронов существенно меньше: первого - от 154 до 576 (в зависимости от использованного сайта сплайсинга), третий интрон - 118 п.н., четвертый - 158 п.н. Длина пятого интрона из-за альтернативного сплайсинга может варьировать, достигая в максимальном варианте 1,5 т.п.н.
При анализе формирования открытых рамок считывания (ОРС) все транскрипты были разделены на две группы. К первой группе относятся транскрипты, ОРС которых начинается в экзоне 2, проходит через экзоны 3 и 4 и заканчивающиеся в экзоне 5Ь. Они соответствуют изоформе белка GAGA-519. У транскриптов второй группы ОРС также начинается во 2-м экзоне, охватывает экзоны 3, 4, 5а и заканчивается в экзоне 6Ь (рис. 2). Они соответствуют изоформе GAGA-581 (Катохин и др., 2001; Benyajati et al., 1997).
Транскрипция гена Trl характеризуется ткане- и органоспецифичностью, зависит от стадии онтогенеза и от температуры окружающей среды (Soeller et al., 1993; Baricheva et al., 1997). Транскрипты гена Trl выявляются на всех стадиях онтогенеза дрозофилы. Однако наиболее сильная экспрессия наблюдается во время эмбриогенеза, достигая максимума в период 9-12 часов развития (Soeller et al., 1993). На стадии личинки количество мРНК значительно снижается и снова слегка увеличивается на стадии куколки. На стадии имаго экспрессия гена Trl незначительна, причем у самцов она еще более слабая, чем у самок (количество мРНК этого гена у последних в значительной степени определяется его экспрессией в яичниках). Уровень транскрипции гена Trl зависит не только от стадии онтогенеза, но и от типа ткани. При изучении экспрессии гена Trl у личинок третьего возраста и у имаго, было установлено, что Trl транскрипты присутствуют в РНК, выделенной из всех тканей и органов дрозофилы, однако гибридизация in situ на гистологических срезах показывает, что наиболее сильная транскрипция наблюдается в мозго-вентральном ганглии и прилегающих имагинальных дисках личинок, а также в нервной ткани взрослых мух (Перелыгина и др., 1992).
В эмбриогенезе от 0 до 12 часов преобладающим является транскрипт длиной 2,5 т.н., после 9 часов появляется еще один транскрипт длиной 3 т.н. Три транскрипта большего размера (от 3,3 до 4,4 т.н.) выявляли на разных эмбриональных стадиях менее четко (Soeller et al., 1993). У личинок 3-го возраста, выращенных при нормальной температуре (25С) в мозго-вентральном ганглии и прилегающих имагинальных дисках преобладают два основных транскрипта размером 2,0 и 2,5 т.н. и один минорный транскрипт размером 1,8 т.н., а в слюнных железах экспрессия гена Trl незначительна - выявляется только один транскрипт размером 2,0 т.н. (Baricheva et al., 1997).
Анализ РНК, выделенной из целых взрослых мух, показал наличие двух основных транскриптов - 2,5 т.н. и 3 т.н. (Baricheva et al., 1997). В РНК, выделенной из голов имаго, преобладают транскрипты 2,0 и 3,0 т.н. (Перелыгина и др., 1992). При анализе спектра транскриптов в яичниках взрослых самок было показано наличие одного основного транскрипта длиной 2,5 т.н. и трех минорных транскриптов большего размера (Bhat et al., 1996).
Транскрипционная активность гена Trl меняется в зависимости от температуры содержания мух, а именно при холодовом и тепловом шоке (Baricheva et al., 1997). Если в норме в мозго-вентральных ганглиях и в прилежащих имагинальных дисках наблюдается три транскрипта (2,0; 2,5 и 1,8 т.н.), то при температурах 14 и 1бС присутствуют два транскрипта (2,0 и 2,5 т.н.). В слюнных железах личинок, выросших при 16С, появляется добавочный транскрипт 3,0 т.н., а при 14С - выявляются два транскрипта: 2,5 и 3,0 т.н. Было показано, что при тепловом шоке (37С) в описанных тканях происходит сохранение лишь одного транскрипта размером 2,0 т.н. (Baricheva et al., 1997), Факт изменения экспрессии гена Trl при различных температурах интересен в связи с тем, что GAF участвует в регуляции активности генов теплового шока hsp23, hsp26, hsp70, а также тем, что мутации гена Trl являются доминантными энхансерами эффекта положения, которые наиболее сильно проявляются при 14С (Farkas et al., 1994). Таким образом, ген Trl относится к числу генов, экспрессирующихся повсеместно, т.е. во всех тканях и органах и на всех стадиях онтогенеза дрозофилы. Характер экспрессии гена Trl является чрезвычайно сложным. К настоящему времени охарактеризованы только мРНК гена Trl, синтезируемые в яичниках и эмбрионах дрозофилы; мРНК, синтезированная, например, в нервной ткани, до сих пор слабо охарактеризована. Кроме того, возможно существование еще не обнаруженных тканеспецифических форм мРНК.
Роль белка GAGA в функционировании различных регуляторных элементов
Белок GAGA может облегчать взаимодействие отдалённых регуляторных элементов типа энхансеров со своими промоторами. В экспериментах по трансфекции и реконструкции транскрипции in vitro было показано, что GAP способствует физическому сближению промотора и удалённого от него, часто на многие тысячи оснований, энхансера. Благодаря своей способности к олигомеризации, обусловленной BTB/POZ доменом, белок GAGA образует белковый "мост", физически сближая энхансер с родственным ему промотором (Mahmoudi et al., 2002). Кроме того, GAF способствует активации промотора не только z c-расположенным энхансером, но даже и в том случае, если энхансер находится в другой молекуле ДРІК, т.е. в /я/7д«с-положении (Keplinger et al„ 2002). Авторы считают, что это предположение может объяснить ряд феноменов, связанных с участием GAF, наблюдаемых in vivo. Напрмер, сайты связывания GAF проксимальнее промотора гена Ubx вовлечены в его регуляцию дистальными регуляторными элементами АВХ и BXD (Laney and Biggin, 1992). Кроме того, GAGA элементы в промоторе гена engrailed (en) необходимы для его энхансер-зависимой активации (Orihara et al., 1999), а промотор гена eve (even-skipped) имеет внутренние инсуляторные свойства, которые, как было обнаружено, зависят от элемента GAGA, расположенного между TATA и инициатором (Ohtsuki and Levine, 1998).
GAGA-связывающие сайты могут быть вовлечены в осуществление регуляции активности генов на уровне геномных доменов, где мультимеры белка GAGA могут выступать в качестве граничных элементов и инсуляторов. Инсуляторы (эффект инсуляции - блокирование влияния энхансера на активность промотора) и граничные элементы участвуют в формировании границ независимых функциональных доменов, благодаря своей способности ограничивать распространение негативного влияния окружающего гетерохроматина и способности ограничивать действие позитивных г/ме-регуляторных элементов.
Среди описанных дрозофилиных граничных элементов и инсуляторов для нас особый интерес представляют Мер и Fab-7 граничные элементы комплекса Bithorax (ВХ-С) (обзор Mihaly et al., 1998), SF1 пограничный элемент гена Scr комплекса Antennapedia (Belozerov et al, 2003), район промотора гена even-skipped (eve) и два района гена al-тубулгта (O Donnell et al., 1994). Все эти элементы имеют сайты связывания для GAF, и некоторые из них регулируются и связывают GAF в условиях in vivo (Ohtsuki and Levin, 1998; Strutt et al., 1997; O Donnell and Wensink, 1994; Mishra et al., 2001; Busturia et al., 2001).
Регуляторный район комплекса Bithorax - Fab-7 состоит из граничного домена (chromatin domain boundary) и iab-7 PRE элемента, являющимся сайленсером. Характерной чертой граничных элементов является наличие в них участков ДНК со специфической структурой хроматина - гиперчувствительных к хроматин-специфическим нуклеазам (West et al., 2002). Эти гиперчувствительные районы (HS) содержат последовательности-мишени для белков, которые участвуют в выполнении функции инсуляции. Один из таких гиперчувствительных районов HS1, длиной примерно 400 пн, содержит множественные сайты связывания для GAF. Швайсберг с соавт. обнаружили, что GAF локализуется в Fab-7 граничном элементе in vivo, связывается с субфрагментами HS1 in vitro и это связывание зависит от GAGA-консенсусных последовательностей. Используя различные трансгенные конструкции, авторы показали, что GAF-связывающие сайты необходимы, но недостаточны для полной энхансеро-блокирующей активности Fab-7. Более того, различные GAGA сайты требуются для различных энхансеро-блокирующих активностей на различных стадиях развития. А энхансеро-блокирующая активность эндогенного граничного элемента Fab-7 чувствительна к мутациям по гену Trl (Schweisberg et al., 2004).
В сайленсирующем элементе (PRE) iab-7, имеющим размер 230 п.н., расположен HS3 сайт, в котором были обнаружены два консенсуса для GAF и два -для РНО (Galloni et al., 1993; Soeller et al., 1993). Дальнейшие эксперименты подтвердили, что GAGA фактор необходим для проявления сайленсирующей активности iab-7 PRE. По-видимому, GAF необходим для формирования или поддержания HS3 сайта iab-7, свободного от нуклеосом, что облегчает связывание в iab-7 PRE Pc-G и/либо trx-G комплексов со своими последовательностями. Так, в сегмент-специфичных г/мс-регуляторных районах iab-6 и iab-7 гена Abd-B выявлены множественные сайты связывания с GAF, где они перемежаются с сайтами для продуктов генов Polycomb (Karch et al.,1994; Hagstrom et al., 1997; Mihalyetal., 1998).
Регуляторный район гена Sex combs reduced (SCr) комплекса Antennapedia прерывается транскрипционной единицей fushi tarazu (ftz). Инсулятор SF1 был идентифицирован в межгенном районе Scr-ftz. Он содержит кластер консервативных GAGA сайтов, которые необходимы для блокировки ftz-дистального энхансера от активирующего промотора Scr (Belozerov et al., 2003)
Энхансер-блокирующая активность полноразмерного SF1 проявляется как у эмбрионов, так и у имаго, и не зависит от ориентации и энхансера, но снижается у Trl мутантов. SF1 может являться членом консервативного семейства хроматин-пограничных элементов/инсуляторов НОМ/Нох комплекса (гомеозисных генов) и, вероятно, облегчает независимую регуляцию частично перекрывающихся генов Scr и ftz, инсулируя эволюционно мобильную транскрипционную единицу ftz (Belozerov et al., 2003).
Регуляторный элемент Мер комплекса Bithorax можно разделить на две функционально различные части (Karen et al., 1994; Zhou et al., 1999; Busturia et al., 2001). Одна часть функционирует как граница, проявляет свойства инсулятора и изолирует домен iab-5 от действия проксимальных регуляторных элементов (Gyurkovics et al., 1990; Karen et al., 1994). Вторая часть состоит из участка размером 138 п.н., проявляет функции PRE и включает четыре сайта связывания для РНО и два сайта - для GAF, которые достаточны для поддержания сайленсирования в эмбрионах и личинках в трансгенных системах (Muller et al., 1999; Busturia et al., 2001). Мутационный анализ показал, что для эффективного сайленсинга in vivo необходимы и РНО, и GAF сайты, в то время как по отдельности они проявляют лишь слабую сайленсирующую активность. Было показано, что и сам белок GAF необходим для сайленсирующей активности МСР138 элемента. Модель возможного механизма сайленсинга с участием МСР предполагает, что GAF и РНО, последовательно или независимо друг от друга связываясь с ДНК, способствуют созданию активного хроматина и последующей сборке необходимого для сайленсинга белкового комплекса (Busturia et al., 2001).
Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
Для этого скрещивали гетерозиготных самок Trl /Bal с самцами МУВаї, где М - одна из полученных нами делеций во втором интроне гена Trl - нуль-аллель, Bal - балансерная хромосома.. Родителей скрещивали массово, помещая по 20 самок и 10 самцов в молочные бутылки со стандартной питательной средой. Через 8-14 часов родителей удаляли и подсчитывали общее количество отложенных яиц (доля яиц с генотипом МУТНт в соответствии с Менделевским расщеплением составляет 0,25). Взрослых мух из F1 просматривали под бинокулярной лупой на наличие маркерных генов балансеров и подсчитывали число особей генотипа M/TrlR85. Каждый опыт повторялся по 2-3 раза. Сравнивая число вылетевших мух с рассчитаным числом отложенных яиц этого же генотипа, оценивали МОГ жизнеспособность компаундов M/Trl . Для оценки достоверности отклонений от менделевского расщепления в F1 использовали t-критерий. Ошибка выборочного среднего считалась по формуле Sp=(pq/n)A , где п - численность выборочной совокупности, а р и q - выборочные статистические параметры. Слюнные железы извлекали из личинок 3-его возраста в физиологическом растворе Эфрусси-Бидла, содержащем 7,5 г NaCl, 0,35 г КС1, 0,21 г СаС12 віл бидистиллированной воды. Затем железы по одной на препарат, фиксировали до 3-5 мин в капле 45% уксусной кислоты, нанесенной на предметное стекло, и раздавливали под покровным стеклом. Препараты анализировали под микроскопом с помощью фазовоконтрастного устройства. Идентификацию районов хромосом проводили по фотографическим картам Лефевра (Lefevre, 1976). Микроскопический анализ проводили в Центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН на микроскопе Axioscope 2 plus. Обработку изображений проводили с помощью Adobe Photoshop 6.0. Выделение геномной ДНК осуществляли по методике (Bender et al., 1983) с модификациями. 1-3 имаго или куколки Drosophila гомогенизировали в 1.5 мл пробирке пестиком в 200 мкл лизирующего буфера (0.1 М NaCl, 0.2 М сахароза, 0.1 М Трис, 0.05 М ЭДТА, 0.5% SDS и 0.5% DEPC), и инкубировали 30 мин при 65С. Добавляли 300 мкл 5 М ацетата калия и 30 мин выдерживали на льду.
Центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку. ДНК осаждали добавлением 500 мкл 96% этанола. Центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин, осадок ДНК промывали 70% охлажденным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл Н20. РНК выделяли с использованием реагента Trizol согласно рекомендациям изготовителя. Для определения концентрации и чистоты РНК измеряли поглощение на длинах волн 260 нм (А2бо) и 280 нм (А28о)- Для чистых препаратов РНК отношение А2бо/А28о находится в пределах 2 - 2,2, а для загрязненных ДНК или белками оно меньше 2. Концентрацию РНК определяли, используя формулу: С (мкг/мкл) = 0,04 А26о. 1. На 20 яичников добавляли 150 мкл TRIzol реагент и гомогенизировали. 2. Выдерживали 5 мин при комнатной температуре. 3. Добавляли 30 мкл хлороформа, выдерживали 2 мин. 4. Центрифугировали 15 мин при 10000g при +4С. 5. Верхнюю водную фазу (примерно 70 мкл) переносили в новую пробирку. 6. Добавляли 75 міст изопропанола, тщательно перемешивали, выдерживали 10 мин на льду. 7. Центрифугировали 10 мин при 10000g при +4С . 8. Осадок промывали 75% этанолом, подсушивали и растворяли в 20 мкл Н20. 9. Образцы выделенной РНК хранили при -20С. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе "Personal Cycler 20" фирмы Biometra в 20 мкл, по методике (Maniatis et al., 1989) с модификациями. Состав реакционной смеси: 1/10 часть 10 х PCR буфера (160 мМ (NH4)2S04 , 650 мМ Tris - НС1 (рН 8.8), 0.5 % Tween 20); 0.2 мМ dNTPs; 1.5 мМ MgCb; праймеры 0.5 pmol/ul; Taq.Pol. 0.05 ед./мкл (Ходырева, ИБХМ); ДНК матрица 0.05-0.1 мкг. Реакцию проводили при следующих условиях: 1 цикл: 94С - 3 мин (денатурация) 25-35 циклов: 94С - 30 сек (денатурация) 58С - 40 сек (отжиг праймеров) 74С - 2 мин (элонгация) 1 цикл: 74С-10мин 4С - оо. Набор основан на использовании в качестве терминаторов дидезоксинуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями BigDye. Реакцию мечения флуоресцинтными красителями проводили на амплификаторе "Personal Cycler 20" фирмы Biometra. На 10 мкл реакционной смеси добавляли 0.2 1 мкг ДНК, однократный реакционный буфер (40 мМ Трис-HCl (рН 9.0), 1 мМ MgCl2), 2-4 пкМ праймера и 2-4 мкл готовой смеси реагентов BigDye Terminator Ready Mix (Applied Biosystems, США). Реакцию проводили при следующих условиях: 1 цикл: 94С - 3 мин (денатурация) 10-15 циклов: 94С - 1 мин (денатурация)
Идентификация и картирование полученных мутаций
Все полученные рекомбинанты были проверены на наличие перестроек, затрагивающих ген Trl. Из литературных данных известно, что одна из границ перестроек, получаемых с помощью Р-элемент индуцированной рекомбинации обычно прилегает непосредственно к месту встройки транспозона (Preston et al., 1996А). Поэтому прежде всего была проверена целостность районов, прилегающих к Р-элементам. Это осуществлялось с помощью ПЦР-анализа с использованием нескольких пар праимеров: в каждой паре праимеров один праимер соответствует участку ДНК гена Trl, непосредственно прилегающему к Р-элементу, а другой — участку на расстоянии 500 - 1000 п.н. от места встройки транспозона. Для анализа рекомбинантов, полученных на основе встройки Trl (3) 4, использовались пары праимеров: 2088down - 3184up и 3184down - ргГ8. Для анализа рекомбинантов, полученных на основе встройки ТгТ 5, использовались праймеры ex2_lev — 2088up и 2088down - 3184up (рис. 9). Отсутствие продукта амплификации с этих пар праимеров свидетельствовало о наличии делеции в районе, фланкирующем место встройки транспозона.
Сохранение или эксцизия (полная или частичная) Р-элемента выявлялась с помощью амплификации с использованием пары праимеров, где один праимер соответствовал 5 - или 3 -концу Р-элемента (phsneo_b или Ргу4, соответственно), а другой - последовательности гена Trl, находящейся на различном расстоянии от места встройки транспозона (рис. 9). Совпадение длин продуктов амплификации в исходной и анализируемой линиях свидетельствовало о сохранении Р-элемента и отсутствии каких-либо перестроек. Отсутствие продукта амплификации указывало на эксцизию Р-элемента. Изменение размера продукта амплификации по сравнению с контролем (ПЦР с ДНК исходной линии) свидетельствовало о наличии перестроек (делеций или дупликаций).
Размеры полученных делений. Верхняя линия изображает геномную последовательность гена Trl с отмеченными сайтами рестрикции BamHI (В), EcoRI (Е), Nco I (N), Pst (Р), Xho I (X). Под ней указано положение праймеров, использованных в данной работе. Треугольники обозначают места встроек Р-элементов в линиях ЕР(3)3184 и l(3)s2325, стрелки внутри треугольников указывают на ориентацию транспозонов. Ниже представлен фрагмент РНК гена Trl. Низкие прямоугольники соответствуют некодирующим районам, высокие -кодирующим. Сиреневым прямоугольником выделен второй интрон гена Trl. Делеции показаны горизонтальными линиями.
I: делеции, затрагивающие кодирующую область гена Trl. Многоточие указывает на то, что границы делеции лежат за пределами гена. II: делеции, затрагивающие область второго интрона гена Trl.
Анализ полученных рекомбинантов показал, что в эксперименте с использованием встройки тґіЕр(3 3184 _ одиннадцать, а в эксперименте с использованием встройки Trls2325 - двенадцать рекомбинантных самцов содержали новые структурные перестройки гена Trl. Таким образом, среди проверенных рекомбинантных самцов процент особей, несущих перестройки по гену Trl, составляет 13% (в эксперименте с jrfp(3)3184 и \\o/Q (в эксперименте с Trls2325), В работе Престона с соавт. количество перестроек составляло около 60% (Preston et al., 1996А).
Отметим, что наблюдается некоторое отличие представленных данных от литературных. Обращает на себя внимание тот факт, что в работе Престона с соавт. на долю дупликаций приходилась почти половина всех полученных перестроек (Preston et al, 1996А). В наших экспериментах дупликации составляют только одну восьмую часть перестроек, хотя не исключено, что проведенный в данной работе анализ не позволил выявить все полученные большие дупликации. Кроме того, приблизительно половина полученных в работе Престона делеций приходилась на долю маленьких (до 600 п.н.) делеций, тогда как остальную часть составляли большие делеций. В данной работе на долю больших делеций пришлось около трети всех полученных перестроек и только одну восьмую часть составляли маленькие делеций. Большую часть полученных перестроек составляли средние по размеру делеций (длиной от 600 п.н. до 3.5 т.п.н.). Другим отличием является редкое сохранение полноразмерных копий Р-элементов в полученных линиях, в то время как у Престона Р-элемент, как правило, сохранялся целиком. Кроме того, полученные в данной работе линии часто содержат различные по длине фрагменты Р-элементов. Из 23 мутаций по гену Trl, полученных с помощью Р-элемент индуцированной рекомбинации у самцов, только в шести (в трех делециях, а также в трех дупликациях) сохраняется полноразмерный -элемент. В восьми перестройках сохранились фрагменты транспозона величиной от 4 до 995 п.н. (табл. 1), и только в одной мутации произошло полное удаление Р-элемента. Точные размеры сохраненных последовательностей Р-элементов в восьми перестройках определить не удалось, поскольку все эти перестройки являются большими делениями, далеко выходящими за пределы гена (табл. 1).
