Введение к работе
Актуальность проблемы 'Зволюционио-консервативные гены, вовлеченные в контроль фундаментальных процессов жизнедеятельности клетки, как правило, характеризуются широким плейотропным эффектом Механизмы таких эффектов определить довольно трудно, так как их причинами являются дефекты, нарушающие связи многоуровневой цепи реіуляции основных внутриклеточных функций Более того, гены, контролирующие жизненно важные процессы в клетке, часто являются полифункциональными, так как имею г несколько продуктов (транскриптов), появляющихся в результате альтернативного сплайсинга
Ген shr у Drosophila meianogasler является представителем семейства эволюционно-консервативных жизненно важных генов и имеет ортологов у различных групп эукариотических организмов от дрожжей (Мех67) до человека (Тар) (обз Третьякова и др, 2001). Одной из основных функций гена ibr является участие в ядерном экспорте мРНК (Wilkie el al, 2001)
Мутантный аллель I(l)is4l)3 (сининим - sbrla), представляющий точковую замену в РНК-связмваюшем домене белка SBR, имеет плейотропный эффект В условиях повышенной температуры мутация l(l)ts403 влияет на синтез белков теплового шока (БТШ) (Evgen'ev el al 1985), конденсацию хроматина (Мамон, Куцкова, 1993а), нролиферативиую активность клеток (Мамон, Куцкова, 19936), эмбриональное развитие и морфогенез (Голубкова, 2004), расхождение половых хромосом в мейозе у самок (Мамон и др, 1990) и самцов (Комарова, 2001). Механизм влияния данной мутации на расхождение хромосом, также как и роль белка SBR в расхождении хромосом остаются неизвестными Неизвестно также, влияет ли мутация I(l)ls4t}3 на расхо~«дени< аутосом в мейозе и на расхождение хромосом в эмбриональных митозах Среди фенотипических проявлений мутантного аллсля Ul)ii403 при действии тепловым шоком (ТШ) на ооциты взрослых самок особое место занимает высокая (до 18 %) частота гибели потомков на личиночной сталии развития Потомки подвергнутых тепловому воздействию самок погибают в первом личиночном возрасте и имеют характерные нарушения, прежде всего, мальпигиевых' сосудов Нами были выдвинуты два предположения о причинах появления таких аномальных личинок Учитывая то, что продукт гена sbr функционирует как транспортер мРНК из ядра в цитоплазму, мы предположили, что дефекты морфогенеза у аномальных личинок могут быть связаны с нарушением транспорта тех мРНК, продукты которых необходимы для нормального развития личиночных органов
В основе второго предположения лежит идея о том, что аномальные личинки могут иметь нарушения хромосомного набора Такое, казалось бы, не очевидное предположение возникло на основании следующих фактов
Во-первых, оказалось, что аномальные личинки фенотипически идентичны личинкам, которые появляются в потомстве при анализе нерасхождения больших аутосом у D.melanogusi * гибридологическим метолом не зависимо от того, присутствует ли в генотипе исследуемой ЛИНИ,' мутация 1(1)1*403 Исполыуя данный метод для определения частоты нерасхождения ауюсом и мейозе у самок О melanogasler, скрещивают самок, несущих свободные аутосомы с самцами, несущими компаундные хромосомы 2 или 3 (Evans, 1971) Так как в потомстве, один из родителей которого несет компаундные хромосомы, велика вероятность появления анеуплондных потомков (Evans, 1971), мы предположили, что аномальные личинки из потомства мутантных самок I(l)ls403 также могут иметь нарушения хромосомного набора, например, быть трисомиками или моносомиками по какой-либо из больших аутосом
Во-вторых, было показано, что мутация l(l)is403 влияет на расхождение половых хромосом в мейозе как у самок (Мамон и др, 1990), так и у самцов (Комарова, 2001) Кроме того, известно, что анеуплоидия по аугосомам часто проявляется в различных врожденных аномалиях развития (Бочков и др . 1984), полому мы предположили, что аномальные личинки в потомстве муганшых самок I(l)ls4l)3 и в потомстве самцов, несущих коміїамілньїе хромосомы мої у г иметь нарушения числа хромосом в кариотипс
Цель и іадачи исследования Целью данной работы является выяснение генетической природы аномальных личинок легальною фенотипа нояплякнциуя г высокой частотой в
j РОС НАЦИимлапМА* і
I БИБЛИОТЕКА {
I. stseM
потомстве обработанных ТШ самок-имаго линии lfhis-403 и имеющих дефекгы в раївиїим мальпигиевых сосудов В связи с этим необходимо решить следующие задачи
-
Дать характеристику признака «высокая частота аномальных личинок» в потомстве самок Ifl)ts4<)3, подвергнутых тепловому воздействию' определить характер наследования, а также оценить способность к формированию терчотолерантности по данному признаку
-
Используя метод FISH (флуоресцентная гибридизация т situ), исследовать хромосомный набор аномальных личинок, появляющихся в потомстве самок 1(1)1x403
-
Исследовать хромосомный набор аномальных личинок, появляющихся при скрещивании самок, несущих свободные аутосомы, с самцами, имеющими компаундные хромосомы (2 илиЗ).
-
Определить содержание ДНК и размер ядер в клетках нервных ганглиев у нормальных и аномальных личинок первого возраста, появляющихся в потомстве обработанных ТШ самок 1(1)1x403.
Научная новизна работы Впервые показано, что у D. melanogasier особи, несущие частичную или полную моносомию по какой-либо из больших аутосом, способны доживать до первого личиночного возраста, и имеют дефекты в развитии мальпигиевых сосудов Аномальные личинки, имеющие характерный летальный фенотип, появляются в потомстве обработанных ТШ самок-имаго IfIjls403 с высокой частотой и имеют нарушения хромосомного набора, возможно являясь частичными или полными гаплоидами Установлено, что признак появление аномальных личинок является рецессивным и не зависит от нарушений в синтезе белков теплового шока Практическая ценность работы Определение частоты аномальных личинок с характерными нарушениями морфологии мальпигиевых сосудов можно предложить для разработки нової о экспресс-метода оценки анеугенного действия различных факторов на D. melanogasier
Метод хромосом-специфичной интерфазной флуоресцентной in situ ДНК-гибридизаини адаптирован для выявления состава хромосомного набора у личинок первого возраста I) mclanogasler Данные о связи морфологических нарушений развития выделительной системы с изменениями хромосомного набора могут иметь значение при изучении механизмов возникновения аномалий развития, как у различных модельных объектов, так и у человека Апробация работы Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях' на III конгрессе по патофизиологии (Лахти, 1998); на 40-й (Беллвью, 1999), 41-й (Питсбург, 2000), 43-й (Сан-Диего, 2002); 44-й (Чикаго, 2003) Международных конференциях по дрозофиле, на 17-ои Европейской конференции по дрозофиле (Эдинбург, 2001), на II Съезде ВОГиС (Санкт-Петербург 2000)
Публикации По материалам работы диссертации опубликовано 12 работ (4 статьи. 8 тезисов), I статья в печати
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 167 страницах, состоит из Введения. Материалов и методов. Обзора литературы, Результатов, Обсуждения, Заключения и Выводов одного Приложения, содержит 27 рисунков и 12 таблиц. Список литературы включает 248 наименований, из которых 31 на русском языке.
