Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение генетических систем,
контролирующих формирование тканей и органов многоклеточного организма, является одним из основных направлений современной генетики развития. Особое значение имеет не только анализ отдельных генов, но и выявление групп генов, скоординировано действующих в процессах клеточной дифференцировки и установлении пространственно упорядоченной организации клеток. Развитие глаза дрозофилы является удобной модельной системой для подобного рода исследований. Этот процесс имеет ряд общих черт с развитием глаза позвоночных, а многие гены и сигнальные пути, вовлеченные в формирование глаза дрозофилы, являются эволюционно-консервативными (Kumar, 2009). Данные, касающиеся генетического контроля формирования глаза дрозофилы, имеют общебиологическое значение и могут быть использованы для выяснения общих закономерностей органогенеза и у других видов, для которых применение генетических и цитогенетических методов исследования в условиях in vivo имеет значительные ограничения.
Сложный глаз дрозофилы состоит из 700-800 повторяющихся функциональных единиц - омматидиев, образованных клетками нескольких типов. Каждый омматидий состоит из 8 фоторецепторных нейронов (фотонейронов R1-R8), 4-х конусных клеток, секретирующих линзы, и 2-х первичных пигментных клеток. Вокруг омматидиев располагаются вторичные и третичные пигментные клетки, а также механо-сенсорные щетинки (Wolff, Ready, 1993). Формирование глаза дрозофилы является сложным многоэтапным процессом, каждая стадия которого контролируется множеством генов. К настоящему времени хорошо изучена роль сравнительно небольшого их числа, в частности, определены и изучены ключевые гены, ответственные за дифференцировку клеток, формирующих омматидий (Voas, Rebay, 2004). Роль других генов в формировании глаза изучена слабо, хотя есть данные о том, что мутации в них приводят к нарушению структуры глаза (Call et al., 2007). К числу таких генов относится ген Trithorax-like (Trl), кодирующий транскрипционный фактор GAGA. Этот эволюпионно-консервативный белок у дрозофилы принимает участие в формировании «открытой» конформации хроматина в различных регуляторных элементах, задействованных в регуляции транскрипции (Farkas et al., 2000; Lehmann, 2004; Mito et al., 2007; Deal et al., 2010; Mathara et al, 2010).
Нарушения поверхности глаза были обнаружены у Trl -мутантов (Farkas et al., 1994) и генетических мозаиков по аллелю ТгГ2325 (Call et al., 2007). В дальнейшем в глазах Trl -мутантов было выявлено наличие дополнительных вторичных и третичных пигментных клеток и недостаток щетинок вокруг омматидиев. Подобные дефекты наблюдались и у генетических мозаиков, гомозиготных по аллелю Trl , у которых дополнительно были обнаружены изменения количества и формы первичных пигментных клеток (Dos-Santos et al., 2008). Необходимо отметить, что интерпретацию полученных авторами результатов затрудняет отсутствие данных об изменении количества продуктов гена Trl в развивающемся глазу мутантов и генетических мозаиков,
используемых в перечисленных работах. Поскольку механизмы нарушений структуры глаза у 7>/-мутантов выявлены не были, вопрос о роли транскрипционного фактора GAGA в процессе формирования данного органа остается открытым.
Вероятно, белок GAGA вовлечен в регуляцию экспрессии генов, задействованных в развитии глаза дрозофилы. Результаты исследований связывания белка GAGA с последовательностями ДНК генома дрозофилы свидетельствуют о том, что к его потенциальным мишеням относится более 600 генов (van Steensel et al., 2003, 2010; de Wit et al, 2008; Schuettengruber et al, 2009). Однако экспериментально доказано участие белка GAGA в контроле экспрессии не более 10 генов, среди которых нет генов, участвующих в формировании глаза. Для выявления генов-мишеней белка GAGA, необходимых для нормального развития глаза дрозофилы, предпочтителен анализ морфологии глаз 7>/-мутантов. Результаты анализа клонов клеток, гомозиготных по аморфным 7>/-мутациям, которые обычно составляют лишь небольшую часть глазо-антеннального имагинального диска, могут не отражать нарушения всех процессов, в которые вовлечен белок GAGA. Возможно также, что данный белок участвует в регуляции экспрессии генов, продукты которых секретируются, в таком случае гомозиготные по 7>/-мутации клетки могут не демонстрировать некоторых нарушений, поскольку они получают секретируемые белки от окружающих клеток, не содержащих мутацию.
Среди аллелей гена ТН, доступных в мировых коллекциях, нет хорошо охарактеризованных мутаций, которые значительно нарушают структуру глаза жизнеспособных мутантов. Нами были получены и описаны две новые гипоморфные мутации - Trl362 и ТНеп82 (Огиенко и др., 2006, 2008), оказывающие такое действие на поверхность глаза. Одна из них - Trlen , была охарактеризована в ходе данной работы. Эти мутации, приводящие к значительному снижению экспрессии гена ТН, дают уникальную возможность выявить весь спектр изменений структуры глаз 7>/-мутантов и определить потенциальные гены-мишени белка GAGA, задействованные в развития глаза дрозофилы. По нашим предварительным данным к таким генам могут относиться lozenge (lz) и BarHl. Данные гены кодируют эволюционно-консервативные транскрипционные факторы, которые участвуют в контроле нескольких процессов в ходе формировании глаза дрозофилы (Higashijima et al, 1992; Daga et al, 1996; Lim, Choi, 2004; Wildonger et al, 2005).
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в установлении роли гена Trithorax-like в процессе формирования глаза D. melanogaster и выявлении его взаимодействий с генами, участвующими в данном процессе.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
і ~ гт1 і еп82
-
провести молекулярно-генетическии анализ аллеля 1Н ;
-
охарактеризовать экспрессию гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях у гетерозигот
Trlen82/THR85 и TH362/THR85;
-
исследовать влияние мутаций гена Trl на структуру глаза имаго и глазо-антеннальных имагинальных дисков 42-часовых куколок мутантов Trlen82ITrlR85 и Trl362ITrlR85;
-
выяснить влияние мутаций гена Trl на проявление мутаций генов lz и ВагНТ,
-
изучить экспрессию гена lz в глазо-антеннальных имагинальных дисках у гетерозигот Trlen82ITrlR85 и Trlш/TrlR85;
-
провести анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с потенциальными сайтами, выявленными в 5'-областях генов lz и BarHl.
Научная новизна. Впервые показано, что снижение уровня экспрессии гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральном ганглии приводит к изменению количества фотонейронов и конусных клеток в части омматидиев, а также к изменению ориентации некоторых омматидиев в глазу дрозофилы. Установлено, что проявление мутации генов lz и BarHl усиливается на фоне мутаций по гену Trl, что свидетельствует о взаимодействии этих генов. Выявлено, что белок GAGA вовлечен в активацию экспрессии гена lz в клетках глазо-антеннальных имагинальных дисков предкуколок.
Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о процессе формирования глаза насекомых. Поскольку структурные гомологи белков GAGA, Lz и BarHl присутствуют и у позвоночных, то полученные результаты представляют интерес для всех биологов, занимающимися вопросами развития. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций по генетике развития для студентов биологических факультетов.
Вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и обработка полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Анализ экспрессии генов Trl и lz в норме и у мутантов выполнен при участии ДА. Карагодина (ИЦиГ СО РАН). Приготовление полутонких срезов глаза дрозофилы проводился совместно с СИ. Байбородиным (ИЦиГ СО РАН).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Мутации, вызывающие снижение экспрессии гена Trl, приводят к широкому спектру нарушений структуры глаза.
-
Мутации гена Trl усиливают проявление мутаций генов lz и BarHl, участвующих в формировании глаза дрозофилы.
-
Снижение экспрессии гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях куколок 7>/-мутантов коррелирует со снижением количества белка Lz в глазо-антеннальных дисках.
Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены: на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.); на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы
молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007 г.); на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 3.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов, списка литературы. Работа изложена на 135 страницах, содержит 6 таблиц и иллюстрирована 23 рисунками. В списке литературы приведен 241 источник.
