Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема стресса является одной из важнейших в современной биологии. Показано, что у насекомых в ответ на действие стрессирующих факторов возникает неспецифическая адаптивная нейроэндокринная реакция, аналогичная стрессу млекопитающих (обзоры: Раушенбах, 1990, 1997; Rauschenbach, 1991; Jancovic-Madni, 1991; Chernysh, 1991; Cymborowski, 1991). Ряд гормонов, задействованных в развитии стресс-реакции, также контролирует репродуктивную функцию (обз.: Грунтенко, Раушенбах, 1998). Изучение закономерностей взаимодействия этих гормонов (и его генетической компоненты) в контроле репродуктивной функции насекомых в стрессирующих условиях актуально, поскольку (1) ответ репродуктивной системы насекомых и млекопитающих имеет общие черты, одной из котрорых является остановка воспроизводительной функции самок в условиях сильного стресса (Bazhan et al, 1996; Rauschenbach et al, 1996) и (2) знание нейроэндокринного механизма, приводящего к остановке размножения насекомых, позволяет создавать новые виды инсектипидов, безопасных для млекопитающих.
В лаборатории генетики стресса (ИЦиГ СО РАН) было установлено, что основными компонентами стресс-реакции у личинок и имаго обоих полов дрозофилы являются биогенные амины, дофамин (ДА) и октопамин (ОА), ферменты их синтеза (тирозингидроксилаза и тирозиидекарбоксилаза (ТДК)) и экдистероиды, а также у личинок и самок ювенильный гормон (ЮГ) (Rauschenbach et al, 1993, 1995а, b, 1996; Sukhanova et al, 1997; Gruntenko et al, 1999, 2000a; Hirashima et al, 2000a,b; Gruntenko et al, 2003). Показано, что у дрозофилы (D. virilis и D. melanogaster) различные виды стресса (высокая температура, голод, механические и химические раздражители) вызывают резкое повышение уровней ДА, ОА, 20-гидроксиэкдизона (20Э) и ЮГ (снижение деградации гормона), а также снижение активности ТДК и тирозингидроксилазы. Следствием изменений в системах метаболизма ЮГ и 20Э являются деградация части ранних вителлогенических ооцитов, замедление развития ооцитов, накопление зрелых ооцитов, и прекращение откладки яиц, что способствует адаптации на популяпионном уровне, позволяя «переждать» неблагоприятные условия без значительной потери потенциальной численности (Rauschenbach et al, 1996, Gruntenko et al., 2003).
В исследованиях, проведенных на различных видах насекомых, было
обнаружено, что экзогенные ОА и ДА влияют на синтез ЮГ, его выделение
1 ^__
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ і БИБЛИОТЕКА }
из corpora allata и деградацию гормона (Lafon-Cazal, Baehr, 1988; Thompson et al, 1990; Pastor et al, 1991; Kaatz et al, 1994; Rachinsky, 1994; Woodring, Hoffmann, 1994; Granger et al., 19%; Hirashima et al, 1999).
Однако оставалось неясным, какой характер носит регуляция уровня ЮГ биогенными аминами, и является ли она генетически детерминированной. Исследование линии D. melanogaster с мутацией Methoprene-tolerant27 (Met27), резко снижающей рецепцию ЮГ (Wilson, Ashok, 1998), показало, что ее особи имеют нарушения в развитии стресс-реакции в системах метаболизма ЮГ и ДА (Gnmtenko et al, 2000), что позволило предположить как наличие генетической компоненты во взаимодействии биогенных аминов и ЮГ, так и важную роль ЮГ в развитии стресс-реакции. Проверке этого предположения и посвящена данная работа.
Цель и задачи исследования: Целью работы является выяснение вопроса, существует ли взаимодействие между системами метаболизма ЮГ и биогенных аминов в регуляции размножения и развития стресс-реакции Drosophila и какова его генетическая компонента.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1 Исследовать влияние мутаций, резко изменяющих уровень
биогенных аминов, на метаболизм ЮГ и размножение D. melanogaster, для
чего изучить в нормальных и стрессирующих условиях метаболизм ЮГ и
плодовитость:
а) особей двух линий независимого происхождения с мутацией локуса
ebony, контролирующего активность Д-аланилдофаминсинтетазы,
приводящей к удвоению уровня ДА, scarlet ebony (ste) и ebony (є);
б) особей линии iav с мутацией гена inactive, регулирующего
активность тирозиндекарбоксилазы, приводящей к резкому снижению
уровня тирамина;
в) особей линии ТрИ*"8, несущей нуль-мутацию гена тирамин-Р-
гидроксилазы (фермента синтеза ОА), приводящую к полному отсутствию
ОА.
2 Выяснить, существует ли обратная связь в регуляции метаболизма
ЮГ биогенными аминами. Для этого:
а) изучить влияние на уровень ДА мутации apterous (линия ар56*
D. melanogaster), приводящей к резкому падению синтеза ЮГ;
б) исследовать влияние экспериментального повышения титра ЮГ на
уровень ДА у D. melanogaster.
,t-ллі /......»( -' * :
f Л * I > t. і Л !
?» jOt Jt>
3. Исследовать роль ЮГ в развитии ответа на стрессирующие воздействия и адаптации D. melanogaster. Для этого планируется:
а) изучить стресс-ответ у линии ap3ff, используя в качестве его
индикаторов реакцию теплового шока (экспрессию гена hsp70) и
нейроэндокринную стресс-реакцию (изменения в системах метаболизма ДА,
ОАиЮГ);
б) исследовать уровни плодовитости и выживаемости особей линии
ар^в нормальных условиях и при тепловом стрессе.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые продемонстрировано существование онтогенетической регуляции метаболизма ЮГ дофамином у самок дрозофилы: мутация, удваивающая уровень ДА, снижает деградацию ЮГ у молодых самок и повышает у половозрелых. Впервые показано, что ОА также регулирует метаболизм ЮГ у самок дрозофилы - мутация, лишающая их ОА, повышает деградацию ЮГ у молодых и зрелых особей. Поскольку онтогенетическая регуляция титра ЮГ принципиальна для нормального протекания оогенезе, сделано заключение, что у дрозофилы ДА играет более важную, чем ОА, роль в регуляции репродуктивной функции. Впервые установлено наличие обратной связи в регуляции метаболизма ЮГ биогенными аминами у самок насекомых: мутация, приводящая к дефициту ЮГ, повышает уровень ДА у самок, но не изменяет его у самцов; экспериментальное повышение титра ЮГ у мутантных самок снижает у них содержание ДА. Впервые показано, что дефицит ЮГ (1) не препятствует инициации стресс-ответа у дрозофилы (в качестве индикаторов ответа использованы клеточная реакция теплового шока (экспрессия гена hsp70) и нейроэндокринная стресс-реакция), (2) не влияет на его развитие у самцов, (3) изменяет развитие нейроэндркршшой стресс-реакции у самок: стресс-реактивность систем метаболизма ОА, ДА и ЮГ у мутантных самок резко снижена. Впервые показано, что ЮГ играет важнейшую роль в контроле приспособленности (плодовитости и выживаемости в неблагоприятных условиях) самок дрозофилы, но не имеет существенного значения для самцов.
Практическая значимость работы заключается в том, что ее результаты дают представление о структуре нейроэндокринного механизма, приводящего к снижению приспособляемости насекомых, что позволяет создавать новые виды инсектицидов, безопасных для млекопитающих.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на
IV Европейском симпозиуме по экофизиологии беспозвоночных (Санкт-Петербург, 2001), на международных конференциях: «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2000), VI Восточноевропейской конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных (Москва-Пущино, 2000), «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), 18ой Европейской конференции по исследованиям на дрозофиле (Гетшнген, Германия, 2003) и на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004).
Вклад автора. Основная часть экспериментов проведена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории генетики стресса к.б.н. Н.В. Адоньевой, апплицировавшей мухам ЮГ, ЕВ. Богомоловой, участвовавшей в проведении экспериментов по оценке плодовитости. Автор выражает благодарность к.б.н. АВ.Катохину и С.Е.Титову за неоценимую помощь в выполнении молекулярной части работы. Автор бесконечно признателен профессору И.К. Захарову, доктору М.Монастириоти, профессору Дж. Хиршу и доктору Д.Сегалу за предоставление линий D. melanogaster, без которых данная работа была бы невозможна. Особую благодарность автор выражает своему руководителю — к.б.н. Н.Е. Грунтенко и заведующей лабораторией д,б.н. И.Ю. Раушенбах.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы, который состоит из 240 наименований. Работа изложена на 136 страницах, содержит 26 рисунков и 5 таблиц.
