Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Стресс-реакция как механизм адаптации 14
1.1.1. Реакция теплового шока 14
1.1.2. Нейрогормоналъная стресс-реакция 15
1.1.3. Стресс-реакция личинок насекомых. 16
1.1.4. Стресс-реакция имаго насекомых 18
1.2. Гонадотропины насекомых 21
1.2.1. 20-гидроксиэкдизон 21
1.2.1.1. Источники и природа 20Э 21
1.2.1.2. Регуляция титра 20Э 23
1.2.1.3. Механизм действия 20Э 25
1.2.2. Ювенилъный гормон 26
1.2.2.1. Структура и источники ЮГ 26
1.2.2.2 Механизм действия ЮГ 28
1.2.2.3. Регуляция титра ЮГ 29
1.3. Биогенные амины насекомых 31
1.4. Регуляция оогенеза гонадотропинами у насекомых 36
1.4.1. Оогенез Drosophila 36
1.4.2. Роль 20Э в размножении насекомых 39
1.4.3. Роль ЮГ в размножении насекомых 42
1.4.4. Взаимодействие гонадотропинов в регуляции репродуктивной функции Drosophila 44
Резюме: 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1. Экспериментальные насекомые 48
2.2. Условия стрессирования 50
2.2.1.. Тепловое стрессирование . 50
2.2.2. Стрессирование голоданием 50
2.3. Биохимические методики 51
2.3.1. Измерение уровня содержания дофамина 57
2.3.2. Измерение гидролиза ювенилъного гормона 52
2.3.3. Измерение содержания 20-гидроксиэкдизона 53
2.3.4. Аппликация ювенилъного гормона 54
2.3.5. Кормление 2О-гидроксиэкдизоном 55
2.4. Анализ плодовитости 55
2.5. Приготовление препаратов яичников, окрашивание по хечсту .56
2.6. Статистическая обработка результатов 57
ГЛАВА 3. Результаты 59
3.1. Исследование роли ювенильного гормона в регуляции оогенеза d. virilisb нормальных условиях и при голодании 59
3.1.1. Влияние голодания на метаболизм ЮГ у 3-дневных самок линий 101ul47D.virilis 60
3.1.2. Изучение динамики деградации ЮГ у самок линии дикого типа (101) D. virilis при экспериментальном повышении титра ЮГ. 61
3.1.3. Влияние голодания на течение оогенеза у самок линий 101 и 147 D. virilis 63
3.1.4. Влияние голодания на откладку ягщ и плодовитость 3-
суточных'самок линии дикого типа D. virilis 72
3.1.5. Влияние голодания на плодовитость 6-суточных самок линий 101 и 147 D. virilis 76
3.1.6. Влияние аппликации ЮГ на плодовитость и откладку яиц у самок линии дикого типа (101) D. virilis в норме и при 24 час голодании 77
3.1.7. Влияние теплового стресса (38 С) различной продолжительности на деградацию ЮГ у 6-дневных самок линий 147 и 101 D. virilis uuxFl (101 х 147) гибридов 79
3.1.8. Влияние теплового стресса (38 С) различной продолжительности на плодовитость самок линий 147 и 101 D. virilis uuxFl (101 х 147) гибридов 83
3.2. Исследование роли 20-гидроксиэкдизона в контроле плодовитости d. virilis в нормальных условиях и при стрессе. 87
3.2.1. Влияние длительного кормления 203 на плодовитость линии дикого типа 101 D. virilis 87
3.2.2. Влияние краткосрочного кормления 203 на плодовитость самок линии 101 D. virilis в норме и при 24 час голодовом стрессе..88
3.2.3. Влияние краткосрочного кормления 203 на плодовитость самок линии 147 D. virilis в норме и при 24 час голодовом стрессе..92
3.3. Исследование роли 20-гидроксиэкдизона в развитии неирогормональнои стресс реакции drosophila и его взаимодействие с ювенильным гормоном и биогенными аминами 93
3.3.1. Воздействие длительного кормления 203 на метаболизм ЮГ и
содержание ДА у 3-суточных самок линии 101 D. virilis 93
3.3.3. Воздействие длительного кормления 203 на метаболизм ЮГ и содержание ДА у 7-суточных самок линии 101 D. virilis 96
3.3.4. Деградация ЮГ у 5-суточных самок линий ecdysoneless и Canton S D. melanogaster при пермиссивной и рестриктивной температурах и под воздействием теплового стресса 96
3.3.5. Содержание ДА у 5-суточных самок линий ecdysoneless и Canton S D. melanogaster при пермиссивной и рестриктивной температурах и под воздействием теплового стресса 100
3.3.6. Стресс-реактивность систем метаболизма ЮГ и ДА у самок линий ecdysoneless и Canton S D. melanogaster при пермиссивной и рестриктивной температурах 100
3.3.7. Деградация ЮГ и содержание ДА у 1-суточных самок линий ecdysoneless и Canton S D. melanogaster при пермиссивной и рестриктивной температурах и под воздействием теплового стресса 102
ГЛАВА 4. Обсуждение 107
4.1. Роль экдистероидов в регуляции развития стресс-реакции у drosophila 107
4.2. Роль ювенильного гормона и 20-гидроксиэкдизона в регуляции оогенеза d. Virilis в нормальных условиях и при голодании 108
4.3. Роль ювенильного гормона и 20-гидроксиэкдизона в регуляции плодовитости d. Virilis в нормальных условиях и при голодании .111
4.4. Взаимодействие 20-гидроксиэкдизона с ювенильным гормоном и биогенными аминами у drosophila 116
Выводы 121
Список литературы
- Нейрогормоналъная стресс-реакция
- Тепловое стрессирование
- Влияние голодания на метаболизм ЮГ у 3-дневных самок линий 101ul47D.virilis
- Роль ювенильного гормона и 20-гидроксиэкдизона в регуляции оогенеза d. Virilis в нормальных условиях и при голодании
Введение к работе
Введение в проблему
Непрерывный рост социально-экологической напряженности на планете привлекает всё большее внимание исследователей к проблеме стресса. Эффективным способом защиты от неблагоприятных факторов среды является нейроэндокринная стресс-реакция, свойственная всем представителям царства животных. Она позволяет им либо адаптироваться к неблагоприятным условиям, либо свести к минимуму повреждающее воздействие стрессора, если первое невозможно (обзоры: Jancovic-Hladni, 1991; Rauschenbach, 1991; Раушенбах, 1997; Грунтенко, Раушенбах, 2004). Таким образом, изучение адаптационных механизмов, обеспечивающих стресс-устойчивость, является одной из важнейших задач современной биологии.
У насекомых, как и у млекопитающих, при стрессе изменяется уровень гонадотропинов, играющих центральную роль в контроле репродуктивной функции, и биогенных аминов, являющихся нейротрансмиттерами, нейромодуляторами и нейрогормонами, задействованными в контроле многих жизненно важных функций у представителей обоих таксонов (обзоры: Jancovic-Hladni, 1991; Cymborowski, 1991; Rauschenbach, 1991; Tilbrook et al, 2002; Torner, Neumann, 2002). В связи с высокой эволюционной консервативностью стресс-реакции, некоторые элементы которой являются общими у столь далеко отстоящих таксонов, как насекомые и млекопитающие (Neckameyer, Weinstein, 2005), изучение механизмов взаимодействия стресс-индуцируемых гормонов насекомых и их генетической компоненты может оказаться полезным для выявления подобных закономерностей у млекопитающих.
Показано, что центральными звеньями нейроэндокринной стресс-реакции имаго насекомых являются биогенные амины, ювенильный гормон (ЮГ) и экдистероиды.(Огспага et al, 1981; Davenport, Evans, 1984; Hirashima et al, 1993, 2000b,c; Rauschenbach et al, 1993,1995a, Раушенбах и др., 2000a). Однако до сих пор остаётся неясным существует ли компонент стресс-реакции (триггер), запускающий каскад изменений в остальных компонентах или эти системы отвечают на неблагоприятные условия независимо друг от друга? Ранее в нашей лаборатории на роль триггера стресс-реакции были протестированы ДА и октопамин (ОА), белки теплового шока, и ЮГ (Rauschenbach et al, 1993, 1995а, 1996, Раушенбах и др., 2001, Gruntenko et al, 1999, 2003b). Однако, как оказалось, ни один из этих важнейших компонентов стресс-реакции не является пусковым. В настоящей работе мы пытались прояснить роль 20-гидроксиэкдизона (20Э) в развитии стресс-реакции.
Известно, что 20Э играет чрезвычайно важную роль в развитии, размножении и других жизненно важных функциях насекомых. Совместно с ювенильным гормоном он контролирует переход от одной онтогенетической стадии к другой: при высоком титре ЮГ происходит личиночно-личиночная линька, при снижении титра ЮГ и резком повышении содержания 20Э наступает метаморфоз, а в отсутствие ЮГ осуществляется линька в имаго (обзоры: Hammock, 1985; Zdarek, 1985; Riddiford, 1994). Также являясь гонадотропином насекомых, 20Э регулирует репродуктивную функцию самок Drosophila, инициируя синтез желточных белков (ЖБ) в жировом теле после вылета имаго, поддерживая затем его на определенном уровне и контролируя поглощение ЖБ ооцитами. Однако у исследователей в этой области до сих пор не существует единого мнения о роли стероидных гормонов в регуляции репродуктивной функции насекомых (вителлогенеза, в частности). В настоящей работе предлагается рассмотреть эту проблему, а также впервые обсуждаются механизмы, посредством которых экдистероиды регулируют репродуктивную функцию в условиях стресса.
В конце 1999 года Баунс с соавторами (Bownes et al., 1999) на основании результатов экспериментов по обработке самок D. melanogaster экзогенными ЮГ и 20Э впервые выдвинули гипотезу о том, что нормальный ход репродукции насекомых, определяется балансом 20Э и ЮГ. Эта гипотеза получила подтверждение в исследовании влияния теплового стресса на оогенез D. virilis (Gruntenko et al, 2003a). Одной из задач настоящей работы является проверка этой гипотезы, а такаже выяснения вопроса о том, какие изменения в балансе гонадотропинов происходят при ином виде стресса, голодании.
Многочисленные исследования указывают на существование гормонального контроля баланса 20Э и ЮГ. Показано, что метаболизм ЮГ подвергается регуляции гормонами мозга, в частности — биогенными аминами. Так, группами исследователей в США и Японии установлено in vitro, что у разных видов насекомых ДА и ОА влияют на синтез и деградацию ЮГ (Granger et al, 1996, Hirashima et al, 1999). Изучая метаболизм эндогенного ЮГ у линий Drosophila melanogaster с резко измененным уровнем ДА и ОА, Грунтенко и соавторы (Gruntenko et al, 2000а) показали in vivo, что и у Drosophila биогенные амины в норме и при стрессе регулируют титр ЮГ. В опытах на Manduca sexta было показано, что повышение титра экдистероидов, 20Э в частности, в пределах физиологических концентраций приводит к стимуляции синтеза ЮГ-кислот (Watson et al., 1986; Granger et al., 1987; Whisenton et al., 1987). В своих исследованиях Ричард с соавторами (Richard et al., 1998), продемонстрировали возрастание биосинтеза экдистероидов при инкубации яичников молодых самок (в течение первых 18 часов после вылета) с ЮГБ3, что свидетельствует о ЮГ-стимуляции синтеза экдистероидов в яичниках. Однако остается открытым вопрос, каков механизм взаимодействия 20Э и ЮГ у дрозофилы, и какую роль в этом взаимодействии играют биогенные амины (ДА и ОА). Прояснить эти вопросы является одной из задач данной работы.
Цель и задачи исследования:
Цель: Установить, какую роль играет 20-гидроксиэкдизон в развитии нейрогормональной стресс-реакции Drosophila и в контроле репродуктивной функции самок в условиях стресса.
Задачи:
1. Исследовать влияние мутации ecdysoneless , нарушающей синтез 20-гидроксиэкдизона, на развитие стресс-реакции Drosophila и выяснить, является ли 20-гидроксиэкдизон запускающим звеном реакции.
2. Исследовать влияние пищевого стресса на оогенез и плодовитость линий D. virilis дикого типа и мутантной, с изменённым уровнем 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона.
3. Изучить воздействие экзогенных 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона на плодовитость D. virilis дикого типа в нормальных условиях и при пищевом стрессе.
4. Изучить механизм взаимодействия 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона в контроле репродуктивной функции Drosophila.
Научная новизна:
Впервые проанализировано развитие стресс-реакции у самок линии ecd, несущих рецессивную температурочувствительную мутацию ecdysoneless1 - она прерывает синтез 20Э при рестриктивной температуре.
Установлено, что отсутствие 20Э не препятствует инициации стресс-реакции, хотя значительно изменяет ее интенсивность, т.е. 20Э является важным, но не пусковым звеном стресс-реакции дрозофилы.
Впервые обнаружено, что пищевой стресс вызывает у самок дрозофилы нарушения в ходе оогенеза: деградацию части ранних вителлогенических ооцитов, задержку их созревания и накопление зрелых ооцитов. Продемонстрировано, что эти изменения являются следствием изменений в метаболизме ЮГ и 20Э в ответ на действие стрессора, причем 20Э контролирует вителлогенические стадии оогенеза, а ЮГ — созревание и откладку яиц.
Впервые in vivo показано, что у самок дрозофилы существует механизм взаиморегуляции ЮГ и 20Э, опосредованной через систему метаболизма ДА.
Впервые установлено, что экспериментальное увеличение титра 20Э или ЮГ в нормальных условиях приводит к различным изменениям в репродуктивной функции самок дрозофилы: повышение титра 20Э снижает уровень плодовитости, не останавливая откладку яиц, а увеличение титра ЮГ вызывает прекращение откладки яиц, не влияя на уровень плодовитости.
Вклад автора
Основная часть экспериментов проведена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории генетики стресса Института цитологии и генетики СО РАН Адоньевой Н.В., Фаддеевой Н.В., Ченцовой Н.А., Богомоловой Е.В, Сапрыкиной З.А., а также доктору Иване Газиовой, Университет Южной Богемии, Чехия, за любезно предоставленную линию ecd . Особую благодарность автор выражает своему руководителю — к.б.н. Н.Е. Грунтенко и заведующей лабораторией д.б.н. И.Ю. Раушенбах.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 18 работ в том числе 7 статей в российских и международных журналах.
Структура и объем работы
Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы, который состоит из 256 наименований. Работа изложена на 159 страницах, содержит 25 рисунков и 3 таблицы.
Апробация работы
Результаты исследования были представлены на IV Европейском симпозиуме по экофизиологии беспозвоночных (Санкт-Петербург, 2001), на конференции «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на III Международной научной конференции молодых ученых (Алматы, Казахстан, 2003), на 18ой Европейской конференции по исследованиям на дрозофиле (Геттинген, Германия, 2003), на IV конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву (Новосибирск, 2004), на III съезде ВОГИС (Москва, 2004), на VIII Международной конференции по ювенильному гормону (Кингз Бич, 2004), на XVI Международном симпозиуме по экдизону (Гент 2006), на XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на IX Международной конференции по ювенильным гормонам (Иорк, 2007) и на 2 Международном конгрессе по исследованию стресса (Будапешт, 2007).
Нейрогормоналъная стресс-реакция
Изменения, происходящие при стрессе в синтетическом аппарате клетки и ее метаболизме в целом, получили название «реакции теплового шока» - это тонко отлаженный механизм, который защищает клетку от неблагоприятных воздействий, за счет индукции мощного синтеза небольшого набора определенных белковых молекул, называемых белками теплового шока (БТШ), и прекращения синтеза прочих клеточных белков (обзоры: Lindquist, Craig, 1988; Feder, Hofmann, 1999). Эта реакция крайне неспецифична и характерна практически для всех типов клеток (Lindquist, 1986) и живых организмов (обз.: Feder et ai, 1995) от Е. coli до млекопитающих. При стрессе, по-видимому, БТШ связываются с белками и прикрывают их активные домены, и тем самым предотвращают случайные ассоциации между белками и формирование нефункциональных агрегатов (Ellis, van der Vies, 1991). Для большинства организмов ответ клетки оказывается не единственным способом защиты от стрессирующего воздействия. С появлением нервной и эндокринной систем, регулирующих функции организма как единого целого, открываются и новые возможности в адаптации к неблагоприятным условиям.
Ответом организма на стрессирующее воздействие на физиологическом и биохимическом уровнях является неспецифическая адаптивная нейрогормональная стресс-реакция (Selye, 1973). Такая реакция была обнаружена и у насекомых (Rauschenbach et al., 1987; Cymborowski, 1991; Jankovic-Hladni, 1991; Chernysh, 1991). Еще раньше было показано, что помещение личинок насекомых в неблагоприятные условия различной природы (высокая и низкая температура, высокая плотность, неблагоприятные влажность, атмосфера, питательная среда) вызывают у них либо задержку метаморфоза, либо его предотвращение посредством сверхчисленных линек (Mellanby, 1954; Cymborowcki, Bogus, 1976). Задержка метаморфоза наблюдается у насекомых со строго фиксированным числом личиночных возрастов, а блокирование - у насекомых с нефиксированным. И та и другая стратегии выживания, направленные на "пережидание" этих условий имеют под собой гормональную основу (Rauschenbach et al., 1987; Cymborowski, 1991).
Известно, что в нормальных условиях в конце последнего личиночного возраста нейросекреторные клетки мозга синтезируют проторакотропный гормон, который стимулирует перитрахеальную железу к синтезу экдизона. Экдизон вызывает переключение программы развития с личиночной на куколочную при условии резкого снижения титра ЮГ, которое осуществляется ЮГ-эстеразой (ЮГЭ) (Rauschenbach et al., 1987; Раушенбах, 1990). Стрессирующие условия вызывают ингибирование секреции проторакотропного гормона и фактора, активирующего ЮГЭ. Прекращение секреции гормона задерживает метаморфоз, позволяя личинкам «переждать» неблагоприятные воздействия. Если стрессирующие условия сохраняются длительное время, стимуляцию перитрахеальнои железы к синтезу экдизона осуществляет ЮГ, разрушение которого замедляется из-за отсутствия активной формы ЮГЭ, а необходимая для переключения программы инактивация ЮГ осуществляется эпоксидгидразой непосредственно в тканях (Rauschenbach et al., 1987; Раушенбах, 1990).
Тепловое стрессирование
При стрессировании голоданием мух в возрасте 1, 3 и 6 суток после вылета имаго помещали в стаканы с обедненной питательной средой (20г агара и 4г сахарозы на 1 литр воды, 5 особей в стакане) на 24 часа. Контрольных особей содержали при 25С на стандартной питательной среде. Как контрольных, так и подвергшихся голодовому воздействию особей замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -20С до проведения соответствующих измерений. В экспериментах по определению содержания ДА мух гомогенизировали на льду, супернатанты отбирали и хранили в жидком азоте. В экспериментах по определению плодовитости мух после 24-часового голодания переносили в свежие стаканы со стандартной питательной средой.
Содержание дофамина измеряли, используя флюориметрический метод Кудрявцевой и Бакштановской (1989), объединивших и модифицировавших варианты, изложенные в работах Майкеля с соавторами (Maickel et al, 1968) и Шлюмпфа с соавторами (Schlumpf et al, 1974). Чувствительность метода приблизительно равна 0.2 мг в мкл (Maickel et al, 1968). Мух, предварительно взвесив, гомогенизировали на льду в 0.1N НСЮ4 (1 особь в 0.3 мл) соласно методике, адаптированной ранее для мухи (Rauschenbach et al, 1993). Гомогенаты центрифугировались в течение 10 мин при 12.000 об/мин. В 0.1 мл супернатанта определяли содержание дофамина.
Метод определения ДА основан на способности аминов к специфическому свечению при окислении их йодом. К 0.1 мл супернатанта последовательно добавляли 0.05 мл 0.4 N НС1, 0.1 мл ЭДТА (рН 7.0) (необходимой для стабилизации флуорофора и поддержания рН в качестве буферного раствора) и 0.1 мл спиртового раствора йода. Инкубировали минуты при комнатной температуре, затем добавляли 0.1 мл щелочного сульфита Na, который приостанавливает окисление аминов йодом. Через 1.5 минуты добавляли 0.1 мл 10 N уксусной кислоты и встряхивали. Пробы нагревали на водяной бане при 96С в течение 6 минут и сразу же охлаждали в ледяной воде. Затем добавляли 1 мл бидистилированной воды и производили измерения. Измерения проводились на флюориметре "Hitachi" (Япония). Для ДА длины волн возбуждающего и испускаемого света - 330 нм и 370 нм, соответственно.
Для измерения гидролиза ЮГ использовали метод, предложенный Хэммоком и Спарксом (Hammock, Sparks, 1977) и модифицированный Раушенбах с соавторами (Rauschenbach et al, 1991). Мух индивидуально гомогенизировали на льду в 30 мкл 0.1 М Na-фосфатного буфера, рН 7.4, содержащего 0.5 мМ фенилтиомочевины. Гомогенаты центрифугировали 5 минут при 12.000 об/мин., и аликвоты супернатанта (Юмкл) использовали для проведения реакции. Время реакции, экспериментально определенное ранее - 30 минут (Раушенбах и др., 1995). В качестве субстрата использовали смесь (12.500 имп./мин.) меченного тритием по С-10 ЮГ-Ш (удельная активность 11.9 Ки/моль, "NEN Research Products") и 0.1 мкг немеченого ЮГ-III ("Sigma" или "Fluka"). Реакцию проводили в 100 мкл инкубационной смеси при 38С. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл раствора, содержащего 5% аммиак и 50% метанол (V:V). Негидролизованный ЮГ экстрагировали гептаном (250 мкл). Пробирки трясли на шейкере 10 мин и центрифугировали 5 минут при 12.000 об/мин. Аликвоты (100 мкл) водной и гептановой фаз помещали в виалы с диоксановым сцинтиллятором и радиоактивность измеряли на счетчике "Rackbeta 1209".
Влияние голодания на метаболизм ЮГ у 3-дневных самок линий 101ul47D.virilis
Ранее в нашей лаборатории было выдвинуто предположение, что синтез и деградация ЮГ у Drosophila находятся под общим контролем, и что повышение синтеза гормона сопровождается снижением его деградации. Действительно, синтез и деградация ЮГ у Drosophila находятся в противофазе и под общим контролем: (1) деградация ЮГ у молодых самок D. melanogaster (Canton S в том числе) существенно ниже, чем у половозрелых (Gruntenko et al., 1999, 2000а), а уровень синтеза ЮГ у молодых самок Canton S существенно выше, чем у половозрелых (Altaratz et al, 1991); (2) мутация apterous56 приводит у самок D. melanogaster как к значительному повышению деградации гормона (Gruntenko et al., 2003b), так и резкому сниженнию синтеза ЮГ (Altaratz et al., 1991).
В таком случае, повышение титра ЮГ должно быть сопряжено со снижением его деградации. Для того, чтобы проверить, действительно ли это так, мы оценили динамику деградации ЮГ у самок линии 101 после экспериментального повышения титра гормона - аппликации 2 мкг ЮГ-Ш, растворенного в ацетоне. Результаты показаны на рисунке 1. Ясно видно, что повышение титра ЮГ приводит к снижению его деградации (различия с контрольными самками, обработанными ацетоном, достоверны при р 0,001) и динамика этого процесса сходна с наблюдаемой при голодании (таблица 1): снижение через 6 часов после начала воздействия, и повышение через 24 часа (различия между 18 и 24 ч после аппликации ЮГ достоверны при р 0,001).
Если исходить из выдвинутой ранее (Gruntenko et al., 2003а) гипотезе о том, что накопление зрелых яиц при стрессе обусловлено именно повышением уровня ЮГ (снижением деградации гормона), можно ожидать, что у самок линии 147 (несущей термочувствительную мутацию, препятствующую ответу системы деградации ЮГ на тепловой стресс (Rauschenbach et al., 1996)), поздние стадии оогенеза, не меняющиеся при тепловом стрессе (Gruntenko et al., 2003a,b), изменятся при голодании.
Типичные яйцевые камеры 8-10 стадии развития ооцита 3-суточных особей дикого типа и мутантной линии D. virilis представлены на рисунке 2 ([А,Б] - в нормальных условиях развития и после 24 ч голодания [В,Г]). В целом период с 8 по 10 стадии развития характеризуется постепенным накоплением желтка и увеличением размеров ооцита, этот процесс хорошо заметен для обеих линий (рис.2). Также окрашивание по Хечсту позволяет увидеть ооциты с конденсирующимися и распадающимися ядрами, что является ранним признаком деградации клетки и это даёт возможность количественно оценить разрушение яйцевых камер. Таким образом, после суточного голодания в яичниках 3-суточных самок 101 линии встречаются дегенерирующие ооциты (рис. 2 [В,Г]), а у самок мутантной линии (147) деградация ооцитов наблюдается не только после голодания (рис. 2 [Д,Е]), но и в нормальных условиях (рис. 2 [Е,Ё]).
Ооциты 8-14 стадии были посчитаны в яичниках 3-дневных самок после голодания в течение 24 часов. Мухи, которые содержались все три дня на стандартной питательной среде, дополненной сухими пекарскими дрожжами, использовались в качестве контроля. Результаты представлены на рис. 3. Хорошо видно, что и в нормальных условиях, и после 24-часового голодания мутантные самки имеют значительно меньше яйцевых камер 8-14 стадий развития по сравнению с самками дикого типа (различия достоверны при р 0.01). После суточного голодания наблюдается значительное снижение общего количества ооцитов 8-14 стадии в яичниках самок обеих линий (различия достоверны при р 0.05).
Вклад каждой стадии развития ооцита в формирование общего пула яйцевых камер стадий 8-14 у особей 101 и 147 линий D. virilis в нормальных условиях и при голодании представлен на рис. 4 и 5. У самок дикого типа (рис. 4) после суточного голодания наблюдается значительное снижение доли ооцитов 9-13 стадии (различия достоверны при р 0.001 для всех стадий), сопровождающееся накапливанием зрелых яиц (14 стадии) (различия достоверны при р 0.001 для всех стадий).
Роль ювенильного гормона и 20-гидроксиэкдизона в регуляции оогенеза d. Virilis в нормальных условиях и при голодании
Ранее в нашей лаборатории было показано, что тепловой стресс (38С, 4 ч) вызывает у самок дикого типа (101) D. virilis накопление зрелых ооцитов, 24 ч задержку в откладке яиц, деградацию вителлогенических ооцитов и снижение плодовитости в течение нескольких суток; деградация ооцитов и снижение плодовитости наблюдались и у самок мутантной линии (147), однако накопления зрелых яиц и прекращения их откладки у мутантных самок зафиксировано не было (Rauschenbach et al., 1996; Gruntenko et al., 2003a). Исходя из этих результатов Грунтенко с соавторами (Gruntenko et al., 2003а) предположили, что деградация вителлогенических ооцитов у D. virilis происходит под влиянием 20Э, титр которого возрастает у самок обеих линий (Раушенбах и др., 2000а; Gruntenko et aL, 2003а); накопление же ооцитов на 14-ой стадии развития у самок дикого типа происходит в ответ на увеличение титра ЮГ при тепловом стрессировании, а мутантные самки не накапливают зрелые яйца, так как их система метаболизмы ЮГ не отвечает изменениями на тепловой стресс (Rauschenbach et aL, 1995а; Gruntenko et aL, 2003a). Поскольку мутация 147-ой линии изначально была обнаружена, как температурочувствительная личиночная леталь (Raushenbach et aL, 1984), можно было ожидать, что при стрессирующих воздействиях иной природы (например, при голодании), реакция системы метаболизма ЮГ у самок 147 линии окажется подобной той, которая наблюдается у самок дикого типа. Для проверки этой гипотезы мы исследовали ЮГ деградацию и оогенез у самок обеих линий под воздействием голодания. Действительно, как оказалось, мутация 147-ой линии не мешает отвечать на голодание системе метаболизма ЮГ: деградация гормона у мутантных самок снижается, как и у дикого типа (см. табл. 1).
Как уже упоминалось, в процессе изучения роли ЮГ в развитии стресс-реакции Раушенбах с соавторами (2002) выдвинули предположение о том, что синтез и деградация ЮГ у Drosophila находятся под общим контролем и возрастание синтеза ЮГ обусловлено снижением его деградации. Эта идея получила подтверждение при исследовании метаболизма ЮГ у самок ЮГ-дефицитной линии apterous f D. melanogaster — несмотря на резко сниженный синтез ЮГ (Altaratz et aL, 1991), ар f самки имеют резко повышенную активность ферментов деградации ЮГ (Gruntenko et aL, 2003b). Также Ренучи с соавторами (Renucci et aL, 1990) показали, что овариектомия у самок Acheta domesticus приводит к значительному снижению синтеза ЮГ и увеличению активности ЮГ-эстеразы — фермента, деградирующего ЮГ. Таким образом, наблюдаемое снижение деградации ЮГ под воздействием голодания у D. virilis (см. табл. 1) должно привести к увеличению титра ЮГ. Чтобы убедиться в этом, мы провели серию опытов по изучению динамики деградации ЮГ у самок линии дикого типа (101) D. virilis при воздействии экзогенного ЮГ. Результаты, представленные на рисунке 1, свидетельствуют о том, что повышение титра ЮГ приводит к резкому снижению деградации гормона и динамика этого процесса аналогична той, что наблюдается при голодании (см. табл. 1).
Как и ожидалось, мутация 147 линии не мешает отвечать ей на голодание снижением деградации (повышением уровня) ЮГ (см. табл. 1) и если накопление зрелых яиц при стрессе обусловлено именно повышением уровня ЮГ, то можно ожидать изменения на поздних стадиях оогенеза у самок линии 147 при голодании, которые отсутствуют при тепловом стрессе (Gruntenko et aL, 2003а). Действительно, данные по распределению ооцитов по стадиям 3-суточных самок линий 147 и 101 D. virilis при голодании аналогичны (см. рис.3-5) и, как уже упоминалось, похожие результаты были получены при тепловом стрессировании линии дикого типа (Gruntenko et aL, 2003а).
