Введение к работе
Актуальность проблемы. Адаптация растений к неблагоприятным условиям окружающей среды требует реализации сложных генетических программ, в которых задействована скоординированная экспрессия больших генных ансамблей, исследование которых необходимо для понимания молекулярных механизмов стрессоустоичивости. В частности, в ответ на стресс изменяется уровень экспрессии генов, контролирующих метаболизм некоторых аминокислот (Martinelli et al, 2007). К их числу относится ген дельта-орнитинаминотрансферазы (ОАТ, ЕС 2.6.1.13), кодирующий фермент, катализирующий перенос дельта-аминогруппы орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием пирролин-5-карбоксилата (П5К) и глутамата (Stranska et al, 2008). Эта реакция является частью системы взаимопревращений таких аминокислот, как аргинин, орнитин, глутамат и пролин. Метаболизм этих аминокислот связан с фиксацией, запасанием и ремобилизацией азота, формированием и прорастанием семян, устойчивостью к различным абиотическим стрессам, регуляцией процессов развития (Funck et al., 2008; Canas et al., 2008; Mattioli et al., 2009). Согласно литературным данным, ген ОАТ принимает участие в ответе на стресс, однако его конкретная биологическая роль остается неясной и является предметом обсуждения (Stranska et al., 2008). Долгое время считалось, что ОАТ участвует в синтезе пролина при стрессе (Roosens et al., 1998, 2002), однако ряд исследователей опровергают это утверждение и постулируют, что ген ОАТ регулирует деградацию орнитина и связан с системой рециркуляции азота (Funck et al., 2008). Отдельные данные указывают на участие гена ОАТ в ряде других жизненно-важных клеточных процессов (Boon et al., 1999; Slocum, 2005; Page et al., 2010). Потенциально, OAT может являться важным регулятором клеточного метаболизма, поскольку реакция, катализируемая этим ферментом, связывает несколько биохимических систем: цикл мочевины, цикл накопления и деградации пролина и путь биосинтеза полиаминов. Транскрипционная регуляция этого гена не изучена, а его роль в процессах развития и ответе на стресс не определена. Изучение транскрипционной регуляции гена ОАТ и его роли в развитии и стрессоустоичивости необходимо для расширения современных представлений о регуляции клеточного метаболизма, а также для разработки новых способов получения устойчивых форм растений.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование роли гена дельта-орнитинаминотрансферазы (ОАТ) в развитии и стрессоустоичивости растений.
Были поставлены следующие задачи:
-
Разработка и создание генетических конструкций для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях и получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, несущих эти конструкции.
-
Оценка содержания свободного пролина в тканях трансгенных растений с измененной экспрессией гена ОАТ в нормальных условиях и в. условиях солевого стресса
-
Анализ солеустойчивости трансгенных растений с измененной экспрессией гена ОАТ.
-
Разработка и создание репортерной генетической конструкции для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Получение трансгенных растений табака, несущих эту конструкцию. Анализ экспрессии репортерной конструкции в трансгенных растениях Nicotiana tabacum на разных стадиях развития.
-
Оценка уровня экспрессии гена ОАТ Nicotiana tabacum в разных тканях и органах на разных стадиях развития растений.
Научная новизна. Создана новая генетическая модель для изучения функций и транскрипционной регуляции гена ОАТ, которая включает в себя генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ, а также репортерную конструкцию для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Впервые показано, что растения с увеличенным уровнем экспрессии гена ОАТ обладают в нормальных условиях большей корневой массой, чем контрольные растения. Впервые показано, что введение антисмыслового супрессора гена ОАТ не влияет на рост растений в нормальных условиях, но существенно снижает формирование корней в условиях солевого стресса. Показано, что изменение уровня экспрессии гена ОАТ не влияет на содержание свободного пролина ни в норме, ни при солевом стрессе. Впервые показано, что активность промотора гена ОАТ и повышенный уровень мРНК ОАТ в норме ассоциированы с зонами инициации роста.
Полученные результаты не подтверждают существующую гипотезу об участии ОАТ в накоплении пролина при стрессе, однако позволяют выдвинуть альтернативную гипотезу о его участии в поддержании ростовых процессов в норме и при стрессе.
Практическая ценность. Показано, что искусственное повышение экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях усиливает их ростовые характеристики и повышает солеустойчивость. Создана генетическая конструкция, эффективно повышающая экспрессию гена ОАТ в трансгенных растениях, которая может быть использована для трансформации разных видов растений. Создана репортерная генетическая конструкция, которая может быть использована для анализа транскрипционной активности гена ОАТ.
Положения, выносимые на защиту.
-
Индуцированное трансгенезом увеличение экспрессии гена ОАТ в растениях табака приводит к повышенному формированию корней в норме и позволяет преодолеть ингибирующее действие солевого стресса на рост побегов.
-
Повышенная транскрипционная активность гена ОАТ характерна для зон роста растений.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2008 г.); на отчетной конференции программы фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (Москва, 2008 г.), на 13-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2009 г.), на Германо - Российском биотехнологическом форуме (Новосибирск, 2009 г.), на международной конференции «Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology» (Новосибирск, 2010 г.), на Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ПО страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 135 источников.
