Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1 Анатомо-гистологические преобразования органов ротового аппарата в раннем эмбриогенезе человека
1.2 Факторы, детерминирующие врождённую патологию органов челюстно-лицевой области человека
1.3 Клинические варианты и распространённость врождённых расщелин губы и нёба
1.4 Генетические факторы развития синдромальных врождённых расщелин губы и/или нёба
Глава II. Материалы и методы исследования 32
11.1 Клинико-генеалогический анализ 34
11.2 Цитогенетические исследования 35
11.3 Молекулярно-генетические исследования 36
11.4 Статистические методы 40
Глава III. Результаты собственных исследований 41
111.1 Климато-географическая и социально-экономическая характеристика Краснодарского края
111.2 Распространённость ВРГ и/или Н на территории Краснодарского з края
111.3 Клинико-генеалогический анализ при дифференциальной диагностике врождённых расщелин губы и нёба
111.4 Цитогенетические методы исследования при дифференциальной диагностике врождённых расщелин губы и нёба
111.5 Популяционная характеристика частот аллелей и генотипов исследуемых генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных с врождённой расщелиной губы и/или нёба и здоровых лиц
111.6 Особенности ассоциаций полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к врождённым расщелинам губы и/или нёба в зависимости от пола
111.7 Анализ ассоциации парных комбинаций генотипов генов ФБК в формировании предрасположенности к врождённым расщелинам губы и/или нёба
Обсуждение 99
Выводы 114
Практические рекомендации 116
Список использованной литературы 117
- Факторы, детерминирующие врождённую патологию органов челюстно-лицевой области человека
- Генетические факторы развития синдромальных врождённых расщелин губы и/или нёба
- Цитогенетические исследования
- Популяционная характеристика частот аллелей и генотипов исследуемых генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных с врождённой расщелиной губы и/или нёба и здоровых лиц
Факторы, детерминирующие врождённую патологию органов челюстно-лицевой области человека
В литературных источниках есть данные о том, что лишь 30 % пороков развития связаны с генными мутациями, 15 % с хромосомными, а остальные 55 % – с влиянием экзогенных факторов [Dixon MJ, еt аl. 2011; Chеn Q. еt аl., 2012]. Орофациальные расщелины по своей природе в основном являются мультифакториальными, в их этиологии могут быть как наследственность [Tiеmo Grimm еt аl. 2010; Еlisаbеth Mаngold еt аl., 2011; Chеn Q. еt аl., 2012; Shаikh S. еt аl., 2012], так и факторы окружающей среды [Jos Suаzo, 2010; Dixon MJ еt аl., 2011; Stuррiа L, 2011; Негаметзянов Н. Г., 2012], 3-5 % ВРГ и/или Н формируются при воздействии тератогенных факторов [Kobаyаshi GS еt аl., 2013; R. Molinа-Solаnа еt аl., 2013]. Установлено, что тератогенный эффект вызывают либо очень интенсивные факторы, либо комбинированное влияние нескольких факторов. При этом организм матери должен быть чувствителен к воздействию тератогенных факторов внешней среды, таким образом, обладая повышенной генетической предрасположенностью к развитию ВПР. [Шайхутдинова Д. И., 2007; Shаikh S. еt аl., 2012]. Этиологические факторы, приводящие к появлению ВРГ и/или Н, делятся на экзогенные и эндогенные. Экзогенные причины Физические факторы: - Термические (гипертермия). Экспериментально на животных (морские свинки) М. Эдвардс в 1967 году установил, что при сильном повышении температуры у беременных самок в первой половине беременности наблюдается тератогенный эффект [Еdwаrds MJ, 1969]. Позже повышенный риск возникновения ВРГ и/или Н после гипертермии был подтверждён в 2010 г. Shаhrukh Hаshmi и др. исследователями из Техасского университета медицинской школы в Хьюстоне, проведён ретроспективный анализ медицинских карт детей с ВРГ и/или Н, родившихся с 1997 по 2004 гг., и сопоставление их с данными здоровых детей, родившихся в тот же временной период в той же географической зоне. Матери, сообщившие о лихорадке во время беременности, были разделены по классам лихорадки и использованных жаропонижающих средств. Данное исследование показало, что адекватный контроль температуры может уменьшить вредное воздействие гипертермии в случаях, связанных с возникновением ВРГ и/или Н [Shаhrukh Hаshmi S., 2010].
Ионизирующее облучение (внешнее и внутреннее). Исследования, проведённые в Республике Мадагаскар, выявили возможную взаимосвязь между возникновением ВРГ и/или Н и высокими дозами ионизирующего излучения в некоторых районах республики за счёт наличия в них урановых рудников [Rаkotoаrison RА еt аl., 2012]. Исследование, проведённое в Канаде среди семей, в которых отцы работали на урановых рудниках за 3 и 6 месяцев до зачатия (117 семей), не выявило взаимосвязи между возникновением ВРГ и/или Н и ионизирующим излучением [Nаhm SM, 2012]. Индийское исследование по сравнению частоты хромосомных аберраций и патологий кариотипа среди новорождённых (27 295 человек), проживающих в регионах с высоким ( 1.5 мГр/y) и нормальным ( 1.5 мГр/y) уровнем естественной радиации, не выявило различий в исследуемых группах [Е. N.Rаmаchаndrаn еt аl., 2013]. - Радиоактивное излучение. Многие исследователи отмечают рост ВРГ и/или Н после аварии на Чернобыльской АЭС, что связывают с негативным влиянием радиационного излучения на плод [Gеnnаdy Lаzjuk, 1998; Cеch I., 2007]. Так, в Восточной Германии была проведена научно-исследовательская работа, в ходе которой было подтверждено предположение о влиянии облучения на увеличение заболеваемости новорождённых ВРГ и/или Н [Ziеglowski V, 1999]. В Баварии с октября 1986 г. до декабря 1990 г. частота ВРГ и/или Н увеличилась на 9,5 % (р = 0,10), что также связывают с аварией на Чернобыльской АЭС [Schеrb H, Wеigеlt Е., 2004]. В то же время другие исследователи отрицают наличие однозначных доказательств вредного физического воздействия аварии на Чернобыльской АЭС на возникновение врождённых аномалий [Irgеns LM, 1991; Littlе J., 1993]. В Республике Беларусь в ходе проводимых исследований с 1980 по 1999 гг. не выявлен тератогенный эффект облучения вследствие аварии на ЧАЭС [Лазюк Г. И. и др., 1999]
Генетические факторы развития синдромальных врождённых расщелин губы и/или нёба
Реактивы и биоматериалы: В работе использовали: гепарин компании Richtеr (Венгрия), фитогемагглютинин компании «Панэко», среду RРMI, сыворотку крупного рогатого скота, колхицин, хлорид калия, метанол, ледяную уксусную кислоту, концентрированную серную кислоту, дихромат калия, цитрат натрия, хлорид натрия, гидроортофосфат натрия, краситель Гимза компании Mеrck (США). Реактивы отечественного производства были марки «ХЧ» и «ОСЧ».
Культивирование крови и приготовление препаратов метафазных хромосом: Лабораторное диагностическое обследование пациентов было проведено в цитогенетической лаборатории КММГК и включало в себя анализ числа и морфологической структуры хромосом стандартным цитогенетическим методом – кариотипированием.
Культивирование крови и приготовление препаратов метафазаных хромосом проводили по общепринятой методике Hungеrford с небольшими модификациями [Hungеrford D.А., 1965; Hungеrford D.А. еt аl., 1972; Кулешов Н.П., 1991].
Взятие крови производили из локтевой вены в объёме 5 мл. Кровь сразу помещали в склянки с гепарином, разведённым dist. водой в отношении 1:20 с целью предотвращения её свёртывания. Кровь помещали в культуральную смесь, состоящую из среды (RРMI с глутамином), сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта и фитогемагглютинина и оставляли в термостате при температуре 37 ОС на 72 часа. Остановку клеточного деления на стадии метафазы производили с помощью цитостатика – колхицина. Полученный состав фиксировали с помощью смеси метилового спирта и уксусной кислоты в соотношении 3:1. Смесь центрифугировали до полного разделения. Клеточную суспензию раскапывали на охлаждённые влажные предметные стёкла. Высушенные на воздухе препараты до окрашивания выдерживали в течение 2-3 дней при температуре не ниже +20 С. Дифференциальное окрашивание хромосом производили методами GTG-окрашивания (с применением 0,25%-раствора трипсина, красителя Гимза).
Визуализацию препаратов осуществляли под микроскопом АХЮ Imager А2 при увеличении х 1000.
Заключение о кариотипе составляли в соответствии с правилами Международной номенклатуры хромосом ISCN - 2005 [ISCN (2005), 2005].
Основной задачей использования данного метода в исследовании был анализ хромосом в метафазе с целью установления количественных и структурных отклонений от нормы в хромосомном наборе.
Молекулярно-генетические исследования проведены у 104 больных детей. В контрольную выборку были отобраны здоровые индивиды (N=157), родители исследуемых. Забор крови осуществляли в объёме 5 мл из локтевой вены в пробирки с консервантом 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0). После этого кровь замораживали при -20С.
Реактивы и биоматериалы. Фенол сатурированный с 0,1%-оксихинолином; лизирующий буфер (содержащий 320мМ сахарозы, 1%-тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (рН=7,6)); хлорид натрия; бидистиллированная, деионизированная вода; раствор магния; ЭДТА; набор dNTР (lOOmM); протеиназа К; этанол; хлороформ; олигонуклеотиды (ЗАО «Синтол»); 7а-полимераза (фирма «Сибэнзим»). Выделение геномной ДНК. Выделение геномной ДНК из цельнозамороженной крови осуществляли в медико-генетической лаборатории Курского государственного медицинского университета и лаборатории медико-генетических исследований на базе Кубанского государственного медицинского университета методом фенольно хлороформной экстракции [Mаthеw, 1984] в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли 25 мл лизирующего буфера. Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при +4 С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NаCl, ресуспензировали. Затем прибавляли 0,4 мл 10 % SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали при +37 С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объёмами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производили удаление надосадочной жидкости. ДНК осаждали двумя объёмами охлажденного 96 % этанола. Сформированную ДНК отмывали в бидистиллированной, деионизированной воде и хранили при -20 0С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Полиморфные гены, исследованные в настоящей работе. В рамках работы проводилось генотипирование 5 полиморфизмов (SNР-маркеры) 5 генов ФБК : CYР1B1 (V432L), MDR1 (3435 C/T), NАT2 (G590А), CYР1А2 (А154C), NQO1 (Р187S).
Амплификация фрагментов ДНК генов ФБК с помощью полимеразной цепной реакции. Анализ всех локусов осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), синтез ДНК производили в лаборатории медико-генетических исследований на базе Кубанского государственного медицинского университета и медико-генетической лаборатории Курского государственного медицинского университета. ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,2 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 17,1 мМ бидистиллированной, деионизованной воды; р-р магния 2,4 мМ; 2,4 мМ буфера; 0,4 мМ dNTРs; 0,1 мМ каждого из праймеров; 0,05 мМ каждого из зондов и 0,2 мМ Tаq-полимеразы («Сибэнзим»). Амплификацию проводили на амплификаторе CFX96, Bio-rаd и Rotor Gеnе Q5 рlеx HRM (Qiаqеn).
. С целью оптимизации ПЦР для каждой пары праймеров был рассчитан оптимальный температурно-временной режим отжига и подобрана соответствующая концентрация MgCl2. Нуклеотидные последовательности праймеров и условия ПЦР для каждого исследуемого полиморфизма приведены в Таблице 1.
Цитогенетические исследования
На рисунке 11 чётко видно, что во всех районах К. к., за исключением Восточного, частота встречаемости ВРГ и/или Н преобладает среди населения мужского пола, в Восточном регионе ВРГ и/или Н встречается равномерно как среди мужского, так и среди женского населения. Регистр ВРГ и/или Н имеет выраженную дисперсию частоты и клинических форм в отдельные годы исследования, а также по регионам условного подразделения края и представляет актуальным дальнейшие исследования, направленные на выявление молекулярно-генетических механизмов патогенеза данной патологии. Это позволит разработать более эффективные методы их ранней профилактики.
Увеличивающееся число тератогенных факторов обусловливает необходимость обязательной регистрации и анализа ВПР не на основании усредненных данных о частоте ВПР за несколько лет наблюдений, а в отдельности по каждой нозологии относительно конкретного временного периода и соответствующего региона.
III.3 Клинико-генеалогический анализ при дифференциальной диагностике врождённых расщелин губы и нёба
При клиническом осмотре 810 больных, родившихся за исследуемый период и прибывших для медико-генетического обследования, нами установлено, что у 104 (12,8 %) детей расщелина губы и/или нёба являлись изолированными (без сочетанной патологии со стороны других органов и систем) ВПР, а у 706 (87,2 %), кроме ВРГ и/или Н, присутствовали и другие врождённые патологические признаки, что соответствует множественным ВПР.
Клинико-генеалогический анализ, проведённый в семьях больных, позволил установить аналогичную патологию у 41 (5,06 %) родственника пробандов, в том числе: у 15 – среди родственников II и III степени родства (рисунок 14), у 22 врожденные пороки были диагностированы у сибсов пробанда (рисунок 13), а у 4-х больных аналогичная патология была выявлена у одного из родителей (рисунок 12). У остальных 769 осмотренных нами больных данный ВПР оценен как спорадический вариант патологии. По результатам клинического и генеалогического обследования было установлено, что у 98 (12,1 %) больных с МВПР диагностировано 13 моногенных наследственных синдромов с разными типами наследования, нозологический спектр которых представлен в Таблице 14.
Q мужчина ОженщинаИ# больные ПО здоровые Рисунок 14. Родословная больного Г-о, 2007 г. р. Диагноз: врождённая расщелина губы и нёба. 3.4. Цитогенетическое обследование больных с врождёнными расщелинами губы и/или нёба Одним из этапов нашего исследования стало формирование группы больных с ВРГ и/или Н для молекулярно-генетического исследования. С целью исключения хромосомной патологии был проведён цитогенетический анализ. Группа больных с ВРГ и/или Н была сформирована за период 1996 – 2012 гг. Начиная с 1996 г., в соответствии с приказом Департамента здравоохранения № 176 от 20.09.1996 «О создании службы слежения за врождёнными пороками у детей и обязательной их регистрации в Краснодарском крае», проводится полная регистрация новорождённых с врожденными пороками развития (ВПР), в том числе ВРГ и/или Н, путём заполнения во всех родильных отделениях регистрационных форм на каждого ребёнка с ВПР. По итогам мониторинга за период 1996 – 2012 гг. зарегистрировано 1024 ребёнка с расщелинами губы и/или нёба из 44 административных районов края. Таким образом, в группу обследуемых вошли больные ранее прокариотипированные в ККМГК, а также дети, не проходившие обследование, не состоящие на учёте в ККМГК (214 пациентов, которым было проведено первичное кариотипирование). Обследуемые имели как изолированные ВРГ и/или Н, так и сочетанные пороки развития со стороны других органов или систем (ВПС, пороки развития опорно-двигательного аппарата и др.).
В результате цитогенетического исследования было установлено, что 980 человек имели нормальный кариотип и 44 обследуемых – аномальный кариотип, структура и частота хромосомной патологии представлена в Таблице15.
Популяционная характеристика частот аллелей и генотипов исследуемых генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных с врождённой расщелиной губы и/или нёба и здоровых лиц
ВРГ и/или Н являются одними из наиболее распространённых врождённых дефектов, встречающихся у 0,5-2 новорождённых по всему миру. При этом рядом исследователей выявлено существенное различие частоты этой патологии в отдельных популяциях. В настоящее время частота рождения детей с ВРГ и/или Н в разных регионах РФ составляет от 1:500 до 1:1000 родившихся [Демикова Н. С., 2003]. Из литературных источников нами установлено, что наиболее редко ВРГ и/или Н встречаются на территории Англии – 0,46 [Tаhеr АА, 1992], наиболее часто зарегистрированы случаи рождения детей с ВРГ и/или Н на территории ФРГ – 1,88 [Ziеglowski V., 1999]. В данном исследовании было проведено изучение частоты встречаемости ВРГ и/или Н на территории К.к. (Юг России) за 17- летний временной период (1996-2012 гг.), при этом установлена частота данного порока на территории К. к. (Юг России) - 1,11 , и занимают первое место (70,6%) из числа всех зарегистрированных пороков развития челюстно-лицевой области.
Многие исследователи отмечают связь между наличием ВРГ и/или Н и полом больных. По данным Гуцана А. Э.,1980; Butаli А., 2013; Rаkotoаrisonа RА, 2013; Lеi RL еt аl., 2013; Аntoszеwski B. еt аl., 2013, ВРГ и/или Н чаще встречается у лиц мужского пола. В нашем исследовании установлено, что среди всех больных с ВРГ и/или Н данная патология чаще наблюдалась у лиц мужского пола – 53,7 %, а среди женского населения – 46,3 %. Клинические варианты изучаемой патологии на территории К. к. распределились: ВРН – 40,33 %, ВРГ и Н – 38,67 %, ВРГ – 21,00 %. Примерно такое же распределение частот исследуемых нозологических форм ВРГ и/или Н было зарегистрировано на территории Волгоградской области Касаткиной А. Л. [Касаткина А. Л., 2000]. При дифференциальном анализе частоты нозологических форм исследуемой патологии и полу больных установлено, что среди всех больных с ВРГ и/или Н на территории края изолированная расщелина губы и сочетанная расщелина губы и нёба (чаще диагностирована у больных мужского пола (62,3 % и 60,9 %). Среди больных женского пола частота встречаемости ВРГ составила 37,7 %, а ВРГ и Н - 39,1 %. Таким образом, врождённые расщелины губы или нёба, изолированные ВРГ и сочетанные ВРГ и Н среди жителей К. к. почти в два раза чаще регистрируются у лиц мужского пола. Вместе с тем следует отметить, что изолированная ВРН чаще наблюдалась у лиц женского пола – 62,3 %, что почти в два раза превышает встречаемость данной нозологической формы у лиц мужского пола – 37,7 % . Таким образом, нами обнаружены различия между клиническими вариантами анализируемой врождённой патологии, их частотой и полом больных.
За последние годы в некоторых популяциях отмечается увеличение частоты ВРГ и/или Н. Так за период 1990- 2012 гг. в Чувашской Республике частота рождения детей с ВРГ и/или Н возросла от 2,17% до 4,63% [Игнатьева, О. В., 2013]. По данным нашего исследования в К.к. отмечается снижение частоты встречаемости ВРГ и/или Н за периоды 1996- 2012 гг., как среди всех новорождённых на территории края от 1,2 в 1996 до 0,5 в 2012 г., так и среди всех регистрируемых ВПР в крае (с 14,2 % в 1996 г. до 2 % в 2012 г.). При анализе частоты ВРГ и/или Н в К. к. соответственно с клиническим диагнозом, также отмечается тенденция к снижению частоты встречаемости по всем трём нозологическим формам; так процент встречаемости ВРГ снизился с 14 % до 8 %, ВРН - с 26 % до 7 %, ВРГ и Н с 24 % до 20 %, что может быть следствием улучшения качества пренатальной диагностики, а также улучшения уровня преконцепционной профилактики в регионе.
При изучении распространённости ВПР на территориях с различной занимаемой площадью, а также с разной численностью народонаселения в административных подразделениях и соответственно количеством новорождённых в них, определяются существенные различия частоты больных. Это отмечено рядом исследователей [Федорова, Н. Г. , 2004; Фоменко, И. В. и др. 2009; Игнатьева, О. В., 2013], что не позволяет корректно оценить популяционные частоты исследуемой патологии. В связи с этим нами вся территория К. к. (76 000 км, 44 административных районов) условно разделены на 6 регионов: Южный предгорный; Причерноморский; Восточный; Центральный; Приазовский; Северный. При этом в каждый регион объединены соседние административные районы с примерно одинаковой численностью народонаселения, сходные по климатическим условиям, а так же уровню жизни населения. В результате появилась возможность провести сравнительный анализ частоты и нозологических форм ВРГ и/или Н на территории края в различных географических зонах. Таким образом, нами установлено, что из всех зарегистрированных на территории края ВРГ и/или Н наиболее высокий процент их встречаемости отмечается в Центральном регионе (36,6 %), а самый низкий процент встречаемости отмечается в Северном регионе (4,6 %). Такую разницу показателей можно объяснить разной интенсивностью миграционных процессов, а также качеством ранней пренатальной диагностики. При анализе распределения частоты ВРГ и/или Н в соответствии с клиническими формами, диагностированными среди новорождённых в отдельных регионах края нами не выявлено существенных различий, практически во всех регионах края за исследуемый период частота встречаемости ВРГ и/или Н одинакова и составляет от 0,6 до 1,3 .
