Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10-27
1.1. Молекулярные основы этиопатогенеза первичной открытоугольной глаукомы 10-15
1.2. Материалы по молекулярно-генетическим и медико-биологическим характеристикам факторов некроза опухолей и их рецепторов 15-20
1.3. Генетические исследования первичной открытоугольной глаукомы 20-27
Глава 2. Материалы и методы исследования 28-36
2.1. Клиническая характеристика обследованных групп 28-31
2.2. Молекулярно-генетические методы 31-34
2.3. Методы генетического анализа 35-36
Глава 3. Изучение ассоциаций генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов с формированием и клиническими особенностями первичной открытоугольной глаукомы 37-76
3.1. Анализ связей молекулярно-генетических маркеров с возникновением первичной открытоугольной глаукомы 37-44
3.2. Гены-кандидаты и стадии ПОУГ 44-53
3.3. Исследование роли генетических полиморфизмов цитокинов в формировании ПОУГ в зависимости от сопутствующей патологии глаз 54-61
3.4. Изучение вовлеченности генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование ПОУГ в группе больных с некомпенсированным ВГД на фоне консервативного лечения 61-67
3.5. Прогнозирование риска развития ПОУГ с использованием генетических данных 67-76
Обсуждение .77-88
Выводы .89-90
Практические рекомендации 91
Список используемой литературы 92-119
Приложение 120-124
- Материалы по молекулярно-генетическим и медико-биологическим характеристикам факторов некроза опухолей и их рецепторов
- Генетические исследования первичной открытоугольной глаукомы
- Гены-кандидаты и стадии ПОУГ
- Изучение вовлеченности генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование ПОУГ в группе больных с некомпенсированным ВГД на фоне консервативного лечения
Введение к работе
Актуальность проблемы. Глаукома – одна из наиболее тяжелых форм
офтальмопатологии, имеющая большое медико-социальное значение ввиду
высокой распространенности, постоянного роста заболеваемости и тяжести
исходов заболевания, ведущего к слепоте и инвалидности. По данным ВОЗ,
число больных глаукомой в мире превысило 100 млн. человек. В России в
2011 году общее количество больных глаукомой составило более 1,1 млн., а
уровень заболеваемости с 2005 по 2011г. вырос с 1,021 до 1,091 на 1 тысячу
взрослого населения ]. Среди клинических форм
заболевания наиболее распространенной является первичная
открытоугольная глаукома (ПОУГ), на долю которой приходится от 72,3 до 96,1% [Егоров Е.А., 2013] всех форм глауком. ПОУГ - мультифакториальное заболевание глаз, характеризующееся повышением внутриглазного давления за пределы толерантного для зрительного нерва уровня, глаукомной оптической нейропатией и типичным снижением зрительных функций [Нестеров А.П., 2008]. Установлено, что в возрастной группе до 59 лет распространенность ПОУГ составляет 0,88 случая на 1000 человек, от 60 до 70 – 6,44 на 1000 человек, среди лиц старше 75 лет глаукома встречается с частотой 17,3 на 1000 населения [Егоров Е.А., 2013].
Несмотря на достаточно многочисленные данные научных
исследований по проблеме глаукомы, представленные в литературе [Leite M.T. et al., 2009; Kang J.H. et al., 2010; Mookherjee S. et al., 2012; Jonas J.B. et al., 2014], многие аспекты этиопатогенеза ПОУГ являются дискуссионными и продолжают оставаться в центре внимания отечественных и зарубежных исследователей [Волков В.В., 2008; Нестеров А.П., 2008]. В настоящее время важное этиопатогенетическое значение при ПОУГ придается нарушениям в системе апоптоза [Алексеев В.Н. и др., 2005]. Одно из центральных звеньев в этом процессе занимают факторы некроза опухолей и их рецепторы [Agarwal R. et al., 2012]. Обладая множеством медико-биологических эффектов, эти цитокины могут влиять на развитие и прогрессирование ПОУГ [Tezel G., 2008; Fan B.J. et al., 2010; Al-Dabbagh N.M. et al., 2011].
Проведенные молекулярно-генетические исследования ПОУГ выявили 4 причинных и 70 генов-кандидатов, ассоциированных с развитием ПОУГ [Киселева О.А. и др., 2011]. Однако, следует отметить, что подавляющее число работ по исследованию роли различных генов-кандидатов в развитии ПОУГ проведены зарубежом и при этом полученные результаты разными группами исследователей противоречивы [Guo Y. et al., 2012; Huang W. et al., 2013; Huo Y. et al., 2013; Xin X. et al., 2013]. В Российской Федерации лишь несколько работ посвящено молекулярно-генетическим аспектам ПОУГ [Рахманов В.В., 2006; Белоусова А.И., 2010]. Роль генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формировании и клиническом течении ПОУГ в нашей стране изучена крайне слабо, что диктует необходимость проведения данных исследований в Российской Федерации.
Цель: Изучить вовлеченность генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование и клиническое течение ПОУГ.
Задачи:
-
Изучить распространнность полиморфных вариантов генов фактора некроза опухоли (-308G/A TNFa), лимфотоксина (+250A/G Ltd), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36A/G TNFR1), рецептора фактора некроза опухоли второго типа (+1663A/G TNFR2) у больных ПОУГ и в контрольной группе.
-
Исследовать роль генетических вариантов цитокинов и их комбинаций в формировании ПОУГ.
-
Оценить влияние генетических полиморфизмов на возраст манифестации и клиническое течение ПОУГ.
-
Проанализировать роль генов-кандидатов в формирование ПОУГ в группе больных с некомпенсированным внутриглазным давлением на фоне консервативной терапии.
-
Определить предикторы развития ПОУГ и разработать математическую модель прогноза развития данного заболевания с учетом генетических данных.
Научная новизна. Впервые установлено важное клиническое значение генетических полиморфизмов -308G/A TNFa, +250A/G Lta, +36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2 у больных ПОУГ русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ.
Впервые установлены генетические маркеры предрасположенности к формированию ПОУГ. Выявлены молекулярно-генетические маркеры ранней манифестации заболевания и различных стадий ПОУГ. Показаны различия в подверженности к ПОУГ у индивидуумов в зависимости от сопутствующей патологии глаз. Установлена вовлеченность генов-кандидатов в формирование ПОУГ с некомпенсированным внутриглазным давлением на фоне консервативной терапии.
Научно-практическое значение. Результаты проведенных исследований расширяют представления о молекулярно-генетических детерминантах ПОУГ. Генетический полиморфизм -308G/A TNFa может быть рекомендован для тестирования с целью выделения группы риска по формированию ПОУГ. Разработанная математическая модель прогнозирования риска развития ПОУГ, а также ПОУГ с некомпенсированным внутриглазным давлением может быть использована в практической офтальмологии с целью формирования групп риска по развитию этого заболевания.
Результаты исследования используются в практической деятельности врачей-офтальмологов ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» и в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и
обсуждены на: 5-ой юбилейной международной научно-практической
конференции «Геронтологические чтения - 2012» (Белгород, 2012), VII
международной Пироговской научной медицинской конференции студентов
и молодых ученых (Москва, 2012), 77-й Всероссийской научной
конференции студентов и молодых ученых с международным участием
«Молодежная наука и современность» (Курск, 2012), 40-й конференции
молодых ученых и 64-й студенческой научной конференции Смоленской
государственной медицинской академии (с международным участием), V
Съезде Межрегиональной общественной организации «Федерация
представителей молодежных научных обществ медицинских вузов» (Смоленск, 2012), XIII-ой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», посвященной 25-летию Кировской государственной медицинской академии (Киров, 2012), 66-й итоговой научной конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2012), X научно-практической конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвященной 10-летию Института последипломного медицинского образования (Белгород, 2012), IV Международной научной конференции «Science4health 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2012), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), научно-практической конференции по офтальмохирургии с международным участием (Уфа, 2013), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013).
Личный вклад автора. Автор лично принимал участие в выполнении всех этапов работы: анализе сведений литературы по изучаемой проблеме, определении цели и задач исследования, разработке методических подходов для их решения, проведении клинического обследования больных ПОУГ и контрольной группы, молекулярно-генетическом исследовании образцов ДНК, обработке и обобщении полученных результатов. Соискателем написана и оформлена рукопись, проведена подготовка основных публикаций и апробация выполненной работы.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 в журналах из перечня ВАК.
Положения, выносимые на защиту:
-
Генетические варианты факторов некроза опухолей и их сочетания ассоциированы с развитием ПОУГ.
-
Полиморфизмы генов цитокинов влияют на возраст манифестации заболевания и клиническое течение ПОУГ.
3. Вовлеченность генетических полиморфизмов в развитие ПОУГ
различается у индивидуумов в зависимости от сопутствующей патологии
глаз.
4. Гены-кандидаты ассоциированы с офтальмологическими
показателями у больных ПОУГ с некомпенсированным внутриглазным
давлением на фоне консервативного лечения.
5. Генетические варианты по локусу +1663A/G TNFR2, возраст,
наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического
артериального давления, уровень диастолического артериального давления,
наличие ПОУГ среди родственников, наличие сопутствующей патологии
глаз, микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз, состояние
радужной оболочки, степень пигментации угла передней камеры являются
прогностически значимыми факторами развития ПОУГ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из
Материалы по молекулярно-генетическим и медико-биологическим характеристикам факторов некроза опухолей и их рецепторов
Фактор некроза опухоли (англ. tumor necrosis factor, TNFa) является плейотропным цитокином, который вовлечен в процессы воспаления, иммунные реакции, регуляцию функциональной активности разных систем организма [Ройт А., 2000; Хаитов Р.M., 2006]. Эти медико-биологические эффекты фактора некроза опухоли обуславливают их участие в развитии множественных патологических процессов и состояний в организме [Bazzoni F. et al., 1996; Aggarwal B.B., 2000; Locksley R.M. et al, 2001]. TNFa продуцируется различными клетками организма (моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, базофилами, Т- и В-лимфоцитами, эозинофилами, фибробластами, остеобластами, астроцитами, зернистыми клетками и другими) [Aggarwal В.В. et al, 1996; Bazzoni F. et al, 1996; Ярилин А.А., 1997]. Синтез TNFa осуществляется в виде предшественника, содержащего 233 остатка аминокислот [Black R.A. et al, 1997]. Впоследствии на процитокин TNFa воздействует специфическая металлопротеаза (фактор некроза опухоли-конвертирующий фермент, АDАM 17) [Idriss Н.Т. et al, 2000]. В результате этого процесса образуется растворимый биологический активный цитокин, имеющий 157 аминокислотных остатка и включающий три полипептидные цепи [Black R.A. et al., 1997]. TNFa - многофункциональный цитокин, обеспечивающий широкий спектр биологических сигналов. TNFa усиливает пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, фагоцитоз, запускает цитокиновый каскад в очаге воспаления, повышает продукцию интерлейкина-1, интерлейкина-2, интерлейкина-6, индуцирует синтез хемоаттрактантов, адгезивных молекул, эйкозаноидов, острофазных белков. Он стимулирует прокоагулянтную активность эндотелиальньгх клеток, активирует внешний путь свертывания крови и способствует образованию фибрина, одновременно усиливает продукцию ингибитора активатора плазминогена I, подавляющий фибринолиз. Результатом этого являются гемостаз и локальное диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, что способствует ограничению распространения инфекции и локализации воспалительного процесса.
Данный фактор участвует в репарации повреждений воспалительной и иммунной этиологии, активируя рост фибробластов и синтез коллагена [Papadakis К.А. et al., 2000; Shu К.Н. et al, 2000; Pandey M. et al, 2003; Van Amersfoort E.S. et al, 2003; Коршунова Е.Ю. и др., 2009;]. Участвует в регуляции обменных процессов [Cai D. et al, 2005; Гончаров, Н.П., 2009]. TNFa оказывает цитотоксическое действие на опухоли, инициирует их апоптоз [Ярилин А.А. и др., 2000]. Синтезируемый клетками ЦНС (олигодедроцитами, астроцитами и др.), TNFa влияет на продукцию нейромедиаторов и активность ионных каналов [Wang C.X. et al, 2002; Вастьянов Р.С. и др., 2007]. Установлена вовлеченность TNFa в астроглиоз (связан с усилением пролиферации астроцитов) [Barna B.P et al, 1990]. Данный фактор является модулятором ангиогенеза. TNFa опосредованная регуляция роста микрососудов является дозозависимой: при пониженных концентрациях TNFa усиливает ангиогенез, а при повышенных - угнетает его [Fajardo L.R et al, 1992]. Ген, кодирующий белок TNFa, включает 4 экзона и 3 интрона, имеет размер 2762 п.н. и картируется в геноме человека на коротком плече шестой хромосомы (6p21.3), располагаясь рядом с генами главного комплекса гистосовместимости [Seidemann К. et al, 2005; Байнак О.В. и др., 2005]. Самым распространенным видом мутаций гена TNFa являются однонуклеотидные замены в промоторном регионе. Известно более 30 полиморфных вариантов этого гена, но только около половины из них влияют на экспрессию TNFa in vivo. Для большинства из них установлено влияние на уровень транскрипционной активности промотора гена TNF, а, следовательно, и на продукцию самого цитокина [Hollegaard M.V. et al., 2006; Коненков В.И. и др., 2008]. Так замена гуанина на аденин в положении -308 приводит к появлению редкого аллеля TNF2 с более высокой способностью к образованию TNFa [Brinkman В.М. et al, 1996; Abraham L.J. et al, 1999; Kroeger K.M. et al, 2000; Hajeer A.H. et al, 2001; Majetschak M. et al, 2002]. Также аллельный вариант -238A TNFa (локус -238G/A TNFa) связан со сниженной продукцией TNFa [Плоткин В.Я. и др., 2007; Trajkov D. et al., 2008]. В настоящее время выявлены ассоциации генетического полиморфизма TNFa с различными заболеваниями: хроническим гломерулонефритом [Некипелова Е.В., 2007], хроническим калькулезным холециститом [Дмин С.С., 2011], миомой матки и генитальным эндометриозом [Алтухова О.Б., 2010; Конева О.А., 2011], хронической обструктивной болезнью легких [Keatings V.M. et al, 2000; Chung K.R, 2001; Sakao S. et al, 2001, 2002; Янбаева Д.Г. и др., 2004], системной красной волчанкой [Lee YH. et al, 2006], псориатическим артритом [Balding J. et al, 2003], сепсисом [Mira J.P et al, 1999; Hedberg C.L. et al, 2004], сахарным диабетом I типа [Krikovszky D. et al., 2002] и многими другими [Boyman О. et al, 1999; Somoskovi A. et al, 1999; Szalai С et al., 2001; Rainero I. et al, 2004]. TNFP (лимфотоксин-, Ltd) представляет собой гликопротеид, содержащий 171 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу около 33 кДа. Продуцируется стимулированными Т-лимфоцитами и лейкоцитами, эпителиоцитами, эндотелиоцитами, фибробластами, миеломными клетками и астроцитами [Кетлинский С.А. и др., 1995; Титов В.Н., 2003]. Ген Lta расположен на шестой хромосоме (6р21.3), находясь в 1100 полинуклеотидных оснований от гена TNFa. Экзон-интронная структура генов лимфотоксина и фактора некроза опухоли имеет сходную аминокислотную гомологию на 30%. [Nedospasov S.A., 1986]. Таким образом, Lta проявляет, подобные TNFa, медико-биологические эффекты [Hollegaard M.V. et al, 2006; Brian E.C., 2009], связываясь с теми же рецепторами, что и TNFa [Suzuki J. et al, 1994; MentulaR, 2005; Кетлинский С.С. и др. 2008].
Генетический полиморфизм Lta имеет серьезное клиническое течение: так замена гуанин на аденин в позиции 252 приводит к образованию высокопродуктивного аллеляґсс 2 [Jacob С.О. et al., 1990]. Факторы некроза опухолей (TNFa, Lta) проявляют свои действия, связываясь с высокоаффинными рецепторами на поверхности клетки [Saklatvala J. et al., 1996; Gravestein L.A. et al, 1998]. В настоящее время идентифицированы два типа рецепторов TNFa: TNFR1 и TNFR2. TNFR1 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 55 кДа и состоящий из 435 аминокислот, а TNFR2 - гликопротеин, имеющий молекулярную массу 75 кДа и включающий 440 аминокислот У человека ген TNFR1 находится на хромосоме 12p13 [Idriss H.T. et al, 2000; Brian E.C., 2009], а ген TNFR2 расположен на хромосоме 1p36.2 (включает 10 экзонов). TNFR1 экспрессируется во всех клетках организма, тогда как TNFR2 образуется в основном в эндотелиальных клетках и клетках гемопоэтического ряда [Барштейн Ю.А. и др., 1990]. Следует отметить, что TNFa участвует в регуляции экспрессии своих собственных рецепторов. Показано, что обработка ряда клеток данным фактором индуцирует экспрессию TNFR1 на мембранах клеток и обуславливает повышенную продукцию растворимой формы TNFR2 в окружающую среду [Higuchi M. et al, 1994].
TNFR1 содержит 190 аминокислот в экстраклеточном домене, 25 аминокислот - в трансмембранном и 220 - в цитоплазматическом домене. В TNFR2 входят 240 аминокислот экстраклеточного домена, 27 -трансмембранного и 173 аминокислоты цитоплазматического домена [Gruss H.J. et al, 1995]. Следует отметить, что внутриклеточные зоны TNFR1 и TNFR2 являются индивидуальными, при схожести их внеклеточных областей [Nаgаtа S., 1997; Kееn L.J., 2002; Pоllоck J. et al., 2002; Оkuse K., 2007; Briаn E.C., 2009], поэтому эти различия обуславливают разные пути передачи сигналов этих рецепторов, а также их различные медико-биологические эффекты [Grell М. et al, 1998; Eissner G. et al, 2004].
Генетические исследования первичной открытоугольной глаукомы
Проведен анализ результатов наблюдений 443 человек: 252 больных первичной открытоугольной глаукомой и 191 человек контрольной группы. Формирование выборок больных и контроля осуществлялись на базе отделения микрохирургии глаза Белгoрoдскoй oбластной клиническoй бoльницы Святителя Иоасафа. Критерии включения в исследуемые выборки: 1. Индивидуумы русскoй нaциoнaльности, рoдившиеся в Центрaльном Чернoземье РФ и не связaнные между сoбoй узaми рoдствa. 2. Пациенты, добровольно согласившиеся на проведение исследования. 3. В группу больных включались индивидуумы с впервые установленным или подтвержденным диагнозом глаукомы. Диагностика осуществлялась на основании стандартов по исследованию ДЗН и состоянию полей зрения с учетом данных офтальмотонометрии [Национальное руководство по глаукоме, 2011]. 4. В контрольную группу, включались индивидуумы, не имеющие острых заболеваний глаз на момент обследования, а также соматической патологии, приводящей к вторичному поражению глаз. Критерии исключения из исследуемых выборок: 1. Пациенты с вторичной глаукомой любой этиологии, а также пациенты с закрытым иридокорнеальным углом. 2. Больные, у которых глаукома сочеталась с другой глaзнoй пaтoлoгией или системным зaбoлеванием, влияющими на состояние поля зрения. 3. Пациенты с тяжелой соматической патологией (сердечная, дыхательная, почечная недостаточность). 4. Индивидуумы, отказавшиеся от проводимого исследования. Средний возраст больных ПОУГ составил 70,53±8,43 (варьировал от 46 до 89), контрольной группы – 69,24±10,14 (варьировал от 40 до 87) (р 0,05). Среди 252 больных первичной открытоугольной глаукомой мужчин было 125 (49,6%), женщин - 127 (50,4%). В контрольной выборке мужчин было 93 человека (48,7%), женщин - 98 (51,3%) (р 0,05).
Сбoр aнaмнeзa прoвoдился по специальнo рaзрaбoтaнной анкете (приложение). Изучаемые параметры включали возраст, пол, сведения о месте рождения, месте жительства. Выяснялось наличие вредных привычек, психо-эмоциональных перенапряжений, сопутствующих заболеваний и наследственной отягощенности по глаукоме. Определялись наличие жалоб со стороны органа зрения, время возникновения заболевания, динамика прогрессирования ПОУГ, анализировали тяжесть и характер течения заболевания, устанавливались сопутствующие заболевания глаз (для каждого глаза в отдельности).
Для верификации стадии глаукомы применяли классификацию, предложенную национальным руководством по глаукоме (Москва, 2011год). В исследуемой группе больных ПОУГ начальная стадия диагносцирована в 14,67% случаев (66 глаз), развитая стадия – 52,44% (236 глаз), далекозашедшая стадия в 21,56% (97 глаз) и терминальная стадия в 11,33% случаев (51 глаз). В группе больных ПОУГ двусторонний процесс выявлен у 198 человек (78,57%), односторонний процесс – у 54 человек (21,43%). Данные по сопутствующей соматопатологии в исследуемой группе больных ПОУГ и группе контроля представлены в таблице 2. Среди больных ПОУГ 233 пациента (92,46%) имели различную соматопатологию, тогда как среди группы контроля сопутствующая патология наблюдалась у 166 пациентов (86,91%) (р 0,05). Офтальмологическое обследование больных включало общепринятые методы исследования при ПОУГ [Национальное руководство по глаукоме, 2011]. Определение остроты зрения проводили с помощью визометрических таблиц С.С. Сивцева - Д.А. Головина. Рефракцию определяли субъективным способом с помощью набора пробных очковых стекол. Таблица 2 Характеристика сопутствующей соматопатологии в исследуемых группах соматопатология б о л ьные ПОУГ группа контроля x2 (p) n % n % отсутствие сопутствующих заболеваний 19 7,54 25 13,09 3,15(0,08) гипертоническая болезнь 162 64,29 120 62,83 0,05(0,83) артериальная гипотензия 8 3 ,1 7 10 5,24 0,71(0,40) атеросклеротическая болезнь сердца 55 21,83 41 21,47 0,01(1,00) ишемическая болезнь сердца 112 44,44 78 40,84 0,44(0,51) другая патология сердца 11 4,37 13 6,81 0,83(0,36) сахарный диабет: первый тип 2 0,79 1 0,52 0,01(1,00) второй тип 38 15,08 27 14,14 0,02(0,89) другие заб.эндокринной системы 13 5,16 7 3,66 0,27(0,60) патология нервной системы 21 8,33 24 12,57 1,69(0,19) патология почек 6 2,38 3 1,57 0,07(0,80) заболевания ЖКТ 25 9,92 13 6,81 0,98(0,32) заболевания дыхательной системы 9 3,57 3 1,57 0,98(0,32) заболевания крови 3 1,19 1 0,52 0,05(0,82) другая патология 32 12,70 32 16,75 1,14(0,29) Биомикроскопию проводили на щелевой лампе «Карл Цейсс-Йена». Гониоскопию проводили с помощью трехзеркальной линзы Гольдмана. Радужно-роговичный угол оценивали по его ширине (широкий, средней ширины, узкий), степени пигментации трабекулярного аппарата (в баллах от 0 до 4 по Нестерову А.П.), наличию псевдоэкфолиаций. При офтальмоскопии использовали электрический офтальмоскоп фирмы «HEINE» (Германия). При исследовании глазного дна оценивали ДЗН (цвет диска, глубину экскавации, величину Э/Д и разницу величины Э/Д между глазами, кровоизлияния на поверхности диска, наличие перипапиллярной атрофии).
Исследование периферического поля зрения проводили на полусферическом периметре Гольдмана по общепринятой методике. Внутриглазное давление измеряли тонометром Маклакова (10,0 грамм). Гидродинамические показатели (истинное внутриглазное давление, скорость продукции ВЖ, коэффициент легкости оттока, коэффициент Беккера) определяли методом электронной тонографии. Всем пациентам проводилось необходимое лабораторное обследование, включающее в себя: общий анализ крови (эритроциты, гематокрит, гемоглобин, тромбоциты, цветовой показатель, лейкоциты, СОЭ); коагулограмма (фибриноген, ПТИ, АЧТВ, ТВ, этаноловая проба); анализ крови на сахар; липидный профиль.
Гены-кандидаты и стадии ПОУГ
Проведен анализ вовлеченности генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование определенных стадий заболевания. Следует отметить, что особенностью изучения вовлеченности генов в формирование глазной патологии связана с тем, что у человека два глаза, которые могут иметь различия по наличию патологии, стадии заболевания и других показателей. Поэтому данное исследование мы провели в двух направлениях. Во-первых, проанализировали ассоциации генов-кандидатов с развитием определенных стадий ПОУГ в группах, где единицей наблюдения является глаз [Еричев В.П. и др., 2005; Слепова О.С. и др., 2012]. Во-вторых, рассмотрели связь генетических вариантов с формированием ПОУГ в группах, где единицей наблюдения является больной ПОУГ [Рожко Ю.И. и др., 2009; Камненских Т.Г. и др., 2013]. Среди всех проанализированных глаз (п=450 глаз) у больных с ПОУГ I стадия заболевания наблюдалась в 14,7% случаев (66 глаз), II стадия в 52,4% (236 глаз), III и IV стадия в 32,9% (148 глаз) (таб.11). При изучении ассоциации генетических полиморфизмов с I стадией ПОУГ достоверных различий в концентрациях аллелей и генотипов между больными с I стадией ПОУГ и контрольной группой не обнаружено. Это может быть обусловлено небольшим объемом выборки больных с I стадией заболевания (п=66 глаз).
При II стадии заболевания наблюдается более высокая концентрация аллеля -308G TNFa (91,38%), чем в контроле (86,74%). Различия по этому показателю между контролем и индивидуумами со II стадией заболевания являются статистически достоверными (Х2=5,55, р=0,02, OR=l,62, 95%С1 1,08-2,44).
Установлено, что при II стадии заболевания концентрации генотипов -308АА TNFa (0%) и +1663АА TNFR2 (12,07%) статистически достоверно меньше по сравнению с группой контроля (3,31%, х2=6,26, р=0,01, рСОг=0,03, OR=0,01, 95%С1 0,001-0,66 и 20,57%, х2=6,50, р=0,01, рCOr=0,03, OR=0,53, 95%С1 0,32-0,87, соответственно). Выявлены различия в распространенности аллеля -308G TNFa (94,1%) и генотипа -308GG TNFa (88,19%) между больными с III-IV стадиями заболевания и контрольной выборкой: среди больных концентрации данных маркеров выше, чем в контрольной группе (86,74%, х2=Ю,51, р=0,002, OR=2,44, 95%С1 1,39-4,32 и 76,80%, х2=7,68, р=0,007, рCOr=0,02, OR=2,26, 95%С1 1,25-4,13, соответственно). При III-IV стадиях заболевания также наблюдается максимальная концентрация аллеля +250А Lta (78,13%) и генотипа +250АА Lta (61,81%), чем в контроле (69,34%, х2=7,44, р=0,007, OR=l,58, 95%С1 1,13-2,21 и Таблица 11
Следует отметить, что с увеличением степени тяжести течения ПОУГ (стадии заболевания) увеличивается концентрация генетических вариантов -308G TNFa (рис.9), -308GG TNFa (рис.10) и +250А Lta (рис.11). Так, частоты молекулярно-генетических маркеров -308G TNFa и -308GG TNFa возрастают от 86,74% и 76,80%, соответственно, в контроле до 89,84% и 79,69%, соответственно, у больных с I стадией заболевания, 91,38% и 82,76% - при II стадии и наибольшего значения они достигают у индивидуумов с III-IV стадиями ПОУГ - 94,1% и 88,19% соответственно. Также, концентрация генетического варианта +250А Lta увеличивается от 69,34% и 68,94% среди контроля и больных с I стадией ПОУГ до 72,01% при II стадии заболевания и 78,13% - при III-IV стадиях заболевания.
Таким образом, в результате исследования выявлены аллели и генотипы изучаемых генов факторов некроза опухолей и их рецепторов, которые ассоциированы с определенными стадиями заболевания. Так, факторами риска развития II стадии ПОУГ следует считать аллель -308G TNFa (OR=1,62), а протективными факторами - генотипы -308АА TNFa и +1663АА TNFR2 (OR=0,01 и OR=0,53, соответственно). Развитие III-IV стадий ПОУГ маркируют генетические варианты: -308G TNFa (OR=2,44), +250А Lta (OR=l,58), -308GG TNFa (OR=2,26) и +250AA Lta (OR=l,83).
Далее, нами проведен анализ распределения частот генотипов и аллелей изучаемых генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в зависимости от стадии заболевания в исследуемых группах, где единицей наблюдения являлся больной ПОУГ (таб.12). Если у одного пациента были диагностированы разные стадии заболевания в парных глазах, то его относили в группу больных с более продвинутой стадией глаукомы.
Исследуемые группы ПОУГ с разными стадиями заболевания составили: I стадия - 20 человек (7,94%), II стадия - 106 больных (42,06%) и III-IV стадии - 126 человек (50,00%). Установлено, что среди больных ПОУГ с III-IV стадиями наблюдается более высокая концентрация аллелей -308G TNFa (93,55%) и +250А LTa (77,02%), чем в контроле (86,74%, х2=6,56, р=0,01, OR=2,22, 95%С1 1,19-4,18 и 69,34%, х2=3,97, р=0,05, OR=l,48, 95%С1 1,01-2,18, соответственно). Таким образом, аллели -308G TNFa и +250А LTa являются факторами риска развития III-IV стадий заболевания (OR=2,22 и OR=l,48, соответственно). Эти данные соответствуют результатам, полученным нами раннее при исследовании вовлеченности генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование определенных стадий заболеванияв группах, где единицей наблюдения являлся глаз.
Изучение вовлеченности генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование ПОУГ в группе больных с некомпенсированным ВГД на фоне консервативного лечения
Проведен анализ вовлеченности генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование заболевания в группе больных ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативной терапии. Консервативная терапия включала в себя назначение инстилляций различных групп препаратов (аналоги простагландинов, -блокаторы, ингибиторы карбоангидразы, агонисты 2-адренорецепторов) в виде монотерапии или их комбинаций. Некомпенсированным ВГД считался уровень офтальмотонуса выше толерантного давления (верхняя граница индивидуальной нормы ВГД) [Егоров Е.А., 2013]. Из 252 больных ПОУГ выборка пациентов с некомпенсированным ВГД на фоне консервативного лечения составила 162 человека (227 глаз), среди которых мужчин было 78 человек (48,15%), женщин - 84 человека (51,85%). Средний возраст больных составил 70,76±8,76 (варьировал от 46 до 89). Средний возраст манифестации заболевания составил 68,32 лет. I стадия заболевания наблюдалась в 14,10% случаев (32 глаза), II стадия в 49,34% (112 глаз), III-IV стадия в 36,56% (83 глаза).
Проведен сравнительный анализ распределения рассматриваемых генетических полиморфизмов в исследуемой выборке и группе контроля (таб.19). Единицей исследования при данном анализе являлся больной ПОУГ. Установлена более высокая концентрация аллеля -308G TNFa (92,14%) у больных с ПОУГ по сравнению с контрольной группой, где анализируемый показатель составил 86,74% (х2=4,60, р=0,03, OR=1,79 95% CI 1,05-3,08). Выявленная повышенная концентрация аллеля -308G TNFa характерна как для больных ПОУГ с некомпенсированным давлением на фоне консервативной терапии, так и для всей выборки больных с ПОУГ. При проведении комплексного анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов установлено, что концентрация сочетания генетических вариантов +1663АА TNFR2 с +250G Lta среди контрольной группы (17,81%) выше, чем среди больных ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативной терапии (6,71%, p=0,007, pcor=0,04) (таб.20). Данное сочетание является протективным фактором развития ПОУГ с некомпенсированным давлением на фоне консервативной терапии (ОR=0,38, 95%CI 0,18-0,81). Следует отметить, что эта комбинация генетических вариантов является маркером как развития ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативной терапии, так и маркером развития ПОУГ в целом. На следующем этапе работы мы провели изучение колличественных клинических характеристик при ПОУГ в зависимости от генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов. Нами оценивались такие клинические показатели, как ВГД и гидродинамические показатели глаз (истинное ВГД, коэффициент легкости оттока ВЖ, коэффициент Беккера). Единицей исследования при данном анализе являлся глаз [Слепова О.С. и др., 2012]. Следует отметить, что распределение исследуемых колличественных клинических признаков ПОУГ отличается от нормального (критерий Шапиро-Уилка, р 0,05) и поэтому для их описания использовали медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а для сравнительного анализа применяли критерий Манна-Уитни [Реброва О.Ю., 2006]. При проведении анализа в данном разделе работы группу гетерозигот объединяли с той группой гомозигот, у которой отсутствовали отличия значений медиан и интерквартильных интервалов от гетерозиготных носителей или они были наименьшие. Установлено, что ВГД в исследуемой группе больных составило Ме = 27 мм.рт.ст. (Q25-Q75 = 25-31 мм.рт.ст.), а истинное внутриглазное давление составило Ме = 23,95 мм.рт.ст. (Q25-Q75 = 21,3-26,9 мм.рт.ст.). Получено, что индивидуумы с генотипом -308GG TNFa имели более высокий уровень ВГД (Ме = 27 мм.рт.ст., Q25-Q75 = 25-31 мм.рт.ст) по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с генотипами -308GA TNFa (Ме = 26 мм.рт.ст., Q25-Q75 = 24-29 мм.рт.ст., р=0,02) (рис.12). Выявлены ассоциации истинного внутриглазного давления (р0) с генетическими полиморфизмами +250A/G Lta и +1663A/G TNFR2. Индивидуумы с генотипами +250АА Lta и +250AG Lta имели более высокий уровень ро (Ме = 24,2 мм.рт.ст., Q25 - 21,5 мм.рт.ст., Q75 - 27,3 мм.рт.ст.) по сравнению с пациентами с генотипом +250GG Lta (Ме = 22,4 мм.рт.ст, Q25 -20,6 мм.рт.ст, Q75 - 24,5 мм.рт.ст.) (рис.13). Данные различия являются статистически достоверными (р=0,02). Также установлено, что значение истинного внутриглазного давление было выше у индивидуумов с генотипами +1663GG TNFR2 и +1663AG TNFR2 (Ме = 24,6 мм.рт.ст, Q25 - 22,1, Q75 - 27,3 мм.рт.ст.) по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с генотипом +1663АА TNFR2 (Ме = 22,75 мм.рт.ст, Q25 - 20,6, Q75 - 24,4 мм.рт.ст, р=0,01) (рис.14).
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что генетический вариант -308G TNFa является фактором риска формирования ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативной терапии (OR=1,79), а сочетание генетических вариантов +1663АА TNFR2 с +250G Lta является протективным фактором развития данной патологии (OR=0,38). Генотип -308GG TNFa ассоциирован с более высоким уровнем ВГД, а генетические варианты +250АА и +250AG Lta, +1663AG и +1663GG TNFR2 связаны с более высоким уровнем истинного внутриглазного давления у больных ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативной терапии.
Важной задачей работы явилось выделение критериев индивидуального прогноза риска развития ПОУГ на основании исследованных полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей и их рецепторов и других возможных факторов риска с целью выявления больных, предрасположенных к глаукоме. Для решения этой задачи нами использованы методы многомерной статистики: логистический регрессионный анализ и дискриминантный анализ [Реброва О.Ю., 2006].
На первом этапе данного исследования методом дискриминантного анализа проведено изучение исследуемых групп - больных с ПОУГ и контрольной группы с учетом более двадцати признаков, характеризующих медико-биологический статус пациентов (возраст, пол, семейный анамнез, отягощенность соматопатологией, наличие вредных привычек и др.), состояние глаз (наличие сопутствующей патологии глаз, наличие микрососудистых нарушений в переднем отрезке глаз, степень пигментации угла передней камеры и др.) и генетические характеристики по исследуемым локусам фактора некроза опухоли (-308G/A TNFa), лимфотоксина (+250A/G Lta), рецепторов фактора некроза опухоли первого и второго типов (+36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2). Получены две дискриминантные функции (таб.21).
