Введение к работе
Актуальность проблемы. Хронический калькулезный холецистит (ХКХ) — обменно-воспалительное заболевание билиарной системы, характеризующееся образованием конкрементов в просвете жёлчного пузыря [Григорьев П.Я., 2001]. Среди болезней органов пищеварения ХКХ встречается достаточно часто: он составляет до 90% всех случаев желчнокаменной болезни (ЖКБ), заболеваемость которой в мире достигает 10% [Ивашкин В.Т., 2002; Полунина Т.Е.2005; Shaffer Е.А. 2006]. В России холецистэктомии по поводу ХКХ занимают второе место среди всех операций, ежегодно выполняемых населению. Соотношение заболеваемости мужчин и женщин составляет в среднем 1:5. При этом значительную долю заболевших составляет трудоспособное население [Дадвани С.А., 2000; Окороков А.Н., 2000].
Изучение факторов, определяющих формирование ХКХ, его клиническое течение, эффективность терапии является одной из важных задач для отечественных и зарубежных учёных [Мараховский Ю.Х., 2003; Григорьев П.Я., 2001; Ильченко А.А. 2004; Beckingham I.J., 2001; Bellows C.F., 2005; Grunhage F. et al., 2006]. Среди этих факторов, как свидетельствуют результаты ряда исследований [Tazuma S., 2006; Venneman N.G. et al., 2006; Hsing A.W., 2008], значимую роль играют генетические факторы. Показана роль отдельных генетических полиморфизмов, участвующих в регуляции воспаления, клеточной пролиферации, метаболизма липидов и жёлчных кислот в формировании ХКХ [Han Т. et al., 2000; Pullinger C.R. et al., 2002; Finzi L. et al, 2006].
Среди генов-кандидатов, регулирующих, преимущественно, процессы воспаления, важное значение имеют гены факторов некроза опухолей и их рецепторов [Gravestein L.A. et al., 1998; Majetschak M. et al., 2002]. Факторы некроза опухолей, взаимодействуя со специфическими рецепторами, являются одними их главных звеньев в воспалительном каскаде при ХКХ, изменяя интенсивность и длительность воспалительных, склеротических и литогенных процессов в жёлчном пузыре [Vishnoi М. et al., 2007].
Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХКХ, в России немногочисленны и затрагивают преимущественно гены, влияющие на метаболизм холестерина и жёлчных кислот [Григорьева И.Н., 2001; Маев И.В. и др., 2004; Колчанов Н.А. и др., 2006]. При этом исследования роли полиморфных маркеров генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в отношении ХКХ в нашей стране до сих пор не проведены.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (гос. контракт № П384 «Разработка молекулярно-генетических основ мультифакториальной патологии человека (на модели генов цитокинов)».
Цель и задачи исследования: изучить генетические полиморфизмы факторов некроза опухоли, их рецепторов и рассмотреть их клиническое значение при хроническом калькулёзном холецистите.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
-
Изучить распространённость полиморфных маркеров генов фактора некроза опухоли а (-308 G/A TNFa), лимфотоксина a (+250 A/G Lta), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36 A/G TNFR1), рецептора фактора некроза опухоли второго типа (-322 VNTR TNFR2) у больных хроническим калькулезным холециститом и в популяционном контроле.
-
Исследовать роль генетических маркеров в формировании хронического калькулезного холецистита.
-
Рассмотреть взаимосвязи генов-кандидатов с морфологическими характеристиками жёлчного пузыря при хроническом калькулёзном холецистите.
-
Оценить влияние генетических полиморфизмов на особенности клинического течения ХКХ.
-
Выявить молекулярно-генетические маркеры высокой степени операционно-анестезиологического риска
-
Провести анализ ассоциаций генетических вариантов факторов некроза опухоли и их рецепторов с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома.
Научная новизна работы. Впервые изучен генетический полиморфизм фактора некроза опухоли a (-308 G/A TNFa), лимфотоксина a (+250 A/G Lta), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36 A/G TNFR1) и рецептора фактора некроза опухоли второго типа (-322 VNTR TNFR2) у больных хроническим калькулезным холециститом, русской национальности, являющихся уроженцами Центрально-Чернозёмного района РФ.
Впервые определены генетические варианты фактора некроза опухоли а, опеределяющие риск развития хронического калькулезного холецистита.
Впервые установлены взаимосвязи генетических полиморфизмов с характером поражения жёлчного пузыря, особенностями клинического течения, эффективностью консервативной терапии и степенью операционно-анестезиологического риска при хроническом калькулёзном холецистите.
Впервые выявлены ассоциации молекулярно-генетических маркеров фактора некроза опухоли с послеоперационной гиперальгезией.
Научно-практическое значение. Результаты проведённого исследования расширяют представления о генетических детерминантах формирования и клинического течения хронического калькулезного холецистита. Полученные данные дают основание рекомендовать для определения индивидуумов с неблагоприятным клиническим течением ХКХ (перемежающееся течение, низкая эффективность консервативной терапии) проведение молекулярно-генетического тестирования генов фактора некроза опухоли а и лимфотоксина а. При оценке степени операционно-
анестезиологического риска, а также для прогнозирования развития послеоперационной гиперальгезии у пациентов с ХКХ могут быть использованы генетические полиморфизмы -308 G/A TNFa и +250 A/G Lta. Положения, выносимые на защиту.
-
Полиморфные варианты гена фактора некроза опухоли a (-308 G/A TNFa) определяют риск формирования хронического калькулёзного холецистита.
-
Характер поражения жёлчного пузыря при ХКХ взаимосвязан с определёнными генетическими маркерами.
-
Молекулярно-генетические факторы влияют на особенности клинического течения ХКХ и эффективность его консервативной терапии.
-
Операционно-анестезиологический риск у больных ХКХ ассоциирован с генетическими полиморфизмами.
5. Генетические детерминанты послеоперационной гиперальгезии.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и
обсуждены на: межрегиональной научно-практической конференции «Социальная экология в изменяющейся России: проблемы и перспективы» (Белгород, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), III Международной Пироговской научной медицинской конференции, (Москва, 2008), I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине», (Курск, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, (Москва, 2009), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), 63-й Итоговой научной конференции молодых учёных Ростовского государственного медицинского университета с международным участием, (Ростов-на-Дону, 2009), 43-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2009), IX окружной конференции молодых ученых «Наука и инновации XXI века», (Сургут, 2009), V Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов - на-Дону, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 в журналах из перечня ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения.
Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и содержат 26 таблиц и 26 рисунков. Библиографический указатель содержит 212 наименований, из которых 133 зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клиническая характеристика исследованных больных
Группу исследования составили 551 человек: 253 больных хроническим калькулёзным холециститом и 298 человек популяционного контроля. В неё включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой. Среди 253 больных ХКХ мужчин было 42 человека (16,60%), женщин - 211 (83,40%). В популяционной выборке (п=298) распределение по полу было аналогичным: мужчины - 50 человек (16,78%), женщины - 248 (83,22%) (р>0,05). Средний возраст больных составил 54,66±13,08 лет (варьировал от 23 до 85 лет), популяционной выборки -48,20+6,28 лет (варьировал от 18 до 79 лет) (р>0,05).
Клинико-лабораторное обследование пациентов проводилось на базе Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Клинические характеристики ХКХ определялись путём тщательного сбора анамнеза и физикапьного исследования, с выделением основных форм заболевания (по Ногаллеру: тяжелый, средней тяжести, лёгкого течения; монотонный, рецидивирующий, перемежающийся ХКХ) [Окороков А.Н., 2000; Мараховский Ю.Х., 2003; Маев И.В. и др., 2004].
Для диагностики ХКХ у всех обследованных применяли ультразвуковое сканирование. Оценивались следующие морфологические показатели жёлчного пузыря: толщина стенки, объём жёлчного пузыря, средний диаметр и объём желчных камней [Палмер П.Е.С., 2000; Блок Б., 2007]. Всем больным в плановом порядке была выполнена видеолапароскопическая холецистэктомия (ВЛХЭ). Оценка состояния пациентов перед операцией ВЛХЭ основывалась на классификации операционно-анестезиологического риска по МНОАР [Полушин Ю.С., 2004]. Оценка послеоперационного болевого синдрома осуществлялась с помощью визуально-аналоговых и цифровых шкал боли каждые 4 часа в первые и вторые сутки после операции [Корячкин В.А., Страшнов В.И., 2004].
Всем больным с ХКХ и индивидуумам популяционной выборки проводилось типирование четырех молекулярно-генетических маркеров: диаллельные локусы генов фактора некроза опухоли a (-308G/A TNFa), лимфотоксина a (+250 A/G Lta), рецепторов фактора некроза опухоли первого (+36 A/G TNFR1) и второго типов (-322 VNTR TNFR2). Генотипирование осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного университета.
Молекулярно-генетические методы
Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4-5 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).
Выделение геномной ДНК из периферической крови проведено методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew С.С., 1984]. Анализ
всех локусов (-308G/A TNFa, +250A/G Lta, +36A/G TNFR1, -322VNTR TNFR2) осуществлялся методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР локусов -308G/A TNFa, +250A/G Lta, -322VNTR TNFR2 проводилась на амплификаторе «Терцик-МС4» производства компании «ДНК-технология», а локуса +36A/G TNFR1 - на аппарате IQ5 (Bio-Rad) для ПЦР в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол».
Генотіширование ДНК-маркеров производилось следующими методами: анализ дискриминации аллелей методом Taq Man зондов (+36 A/G TNFR1); анализ полиморфизма длины амплифицируемых фрагментов (-322 VNTR TNFR2); анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск) (-308 G/A TNFa, +250A/G Lta). Визуализация фореграмм осуществлялась в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). Статистические методы
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.1». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами [Животовский Л.А., 1983]. Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий х2 [Вейр Б., 1995].
Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с формированием ХКХ, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2x2 с расчетом критерия у? с поправкой Иетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Schlesselman J., 1982]. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [Реброва О.Ю., 2006]. При изучении взаимосвязей генетических полиморфизмов с клинически значимыми количественными признаками ХКХ, в связи с тем, что их распределение отличалось от нормального, для описания признаков использовали медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а для сравнительного анализа применяли критерий Манна-Уитни [Реброва О.Ю., 2006].
