Введение к работе
Актуальность проблемы
Секреторные белковые медиаторы большинства важнейших процессов в организме человека и млекопитающих функционируют в очень низких физиологических концентрациях. При этом высокая биологическая активность ростовых факторов и цитокинов в отношении клеток организма, как правило, компенсируется их стремительной деградацией. Высокая скорость распада и синтеза ростовых факторов приводит к формированию квазистационарных концентрационных градиентов вблизи клеток-продуцентов, которые, по-видимому, возникают за счет распределения ростовых и сигнальных факторов в организме. Создание именно таких устойчивых во времени градиентов является желательным условием тестирования действия лимфокинов и ростовых факторов на животных моделях, однако эта задача не реализуема при введении испытуемых белков в систему в форме готовой субстанции.
Наиболее физиологичным методом доставки ростовых факторов представляется индуцированная экспрессия клеточных медиаторов собственными клетками организма in vivo, которая может быть достигнута при введении в отдельные клетки животного генной конструкции, несущей соответствующий структурный ген. В настоящее время многие проекты, направленные на создание средств борьбы с вирусными и онкологическими заболеваниями, включают введение в организм человека ДНК, несущей ген соответствующего цитокина [Bartlett et al., 2003]. В этом случае уровень экспрессии определяется, прежде всего, силой промотора, а также возможностью доставки ДНК к тканям-мишеням.
Доля клеток, непосредственно подвергающихся трансфекции в результате внутримышечной инъекции неупакованной ДНК, очень невелико (не более 10"5 в непосредственно вблизи точки инъекции), поэтому напрямую оценивать эффективность доставки конструкций по появлению белкового продукта или специфического транскрипта представляется затруднительным. В этой связи наиболее доступными являются косвенные методы оценки на основе измерения уровня продукции специфических антител в ответ на синтезированный in situ рекомбинантный белок. Выявление таких антител, легко доступное в техническом отношении, может служить доказательством факта доставки ДНК в заданный участок ткани-мишени.
Цель и задачи исследования
В качестве цели настоящей работы рассматривалась разработка генно-инженерных конструкций для доставки растворимого TNF-a1 человека в секреторной и внутриклеточной форме в клетки млекопитающих. Эффективность разработанных конструкций оценивалась по критерию появления в крови животного в результате парентерального введения плазмидной ДНК специфических поликлональных антител против TNF-a человека.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:
1) создание иммунохимической системы детекции TNF-a на основе антител, выработанных при иммунизации кролика гтч^ітипігптин Я"Т'^Ц"
' TNF-a - фактор некроза опухолей I "'"ОТЕКА I
-
получение биологически активного стандарта стандарта для разработки тест-системы;
-
характеристика специфичности аффинноочищенных антител против TNF-a человека;
4) создание конструкций для доставки TNF-a человека в клетки
млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме;
5) изучение свойств полученных конструкций в тестах на животных моделях.
Научная новизна работы
Впервые показана возможность доставки TNF-a человека на животной модели с помощью свободной ДНК. В нашем случае доставка TNF-a человека проведена параллельно на двух видах животных, причем сопоставлена эффективность действия секретируемого и несекретируемого вариантов белков.
Подтверждено ранее высказанное предположение [Chowdhury et аі., 2001; Gardsvoll et al., 2000] о значительных различиях характера ответа на антиген, доставляемый методом ДНК-иммунизации, в случае крысы и кролика. Это проявилось, в частности, в форме двухфазной динамики сероконверсии титра специфических антиткел у кролика.
Практическая ценность работы
В представляемой работе первая часть посвящена получению рекомбинантного TNF-a человека, необходимого в дальнейшей работе для иммунобиохимических тестов. Предложен оригинальный дизайн генной конструкции, приводящий к более высокому, по сравнению с ранее использовавшимися [Шингарова и др., 1997] уровню продукции целевого продукта (до 100 мг/л). Разработана оригинальная методика ренатурации TNF-a из телец включения. Факт приобретения TNF-a нативной конформации в результате ренатурации рекомбинантного белка подтвержден наличием связывания продукта ренатурации с экстраклеточным доменом рецептора TNF 1 типа в тесте in vitro. Нативный рецептор TNF получен экспрессией в клетках Drosophila melanogaster.
Вторая часть работы посвящена характеристике полученных аффинно очищенных поликлональных антител против TNF-a человека. Получены предварительные данные, подтверждающие перспективность использования этих антител при дифференциальной и уточняющей диагностике больных рассеянным склерозом.
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 3 печагные работы.
Структура и объем диссертации
