Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Кроветворная система: устройство и регуляция 9
Семейство ФНО: цитокины-лиганды и их рецепторы 16
Молекулярные механизмы передачи сигнала 19
Физиологическая роль ФНО в гемопоэзе 21
Изучение кроветворения у мышей, дефицитных по рецепторам ФНОР1 иФНОР2 27
Применение ФНО-блокаторов в медицине 28
Материалы и методы исследований
Мыши 31
Генетическое типирование мышей 32
Получение клеточных взвесей 33
Проточная цитометрия 34
Препаративная проточная цитометрия 35
Длительные культуры костного мозга 36
Культивирование клеток костного мозга в присутствии ростовых факторов 37
Метод экзогенных селезеночных колоний 37
Культуры клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и полипотентных миелоидных клеток-предшественников 38
Культуры эритроидных клеток-предшественников 39
Получение костно-мозговых химер для опыта по конкурентной репопуляции 39
Статистический анализ 40
Результаты и обсуждение
ФНО как ингибитор миелопоэза in vitro 41
Роль ФНО в регуляции пролиферации и дифференцировке тучных клеток 44
Минимальные аномалии в кроветворении у ФНО-дефицитных мышей 46
ФНО - ингибитор ранних (КОЕ-с) и коммитированных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-гм) in vivo 48
Нарушенная динамика гемопоэза у мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом 52
У мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом повышено количество СКК в костном мозге 58
Заключение 61
Выводы .62
Список литературы 64
Благодарности 76
- Семейство ФНО: цитокины-лиганды и их рецепторы
- Изучение кроветворения у мышей, дефицитных по рецепторам ФНОР1 иФНОР2
- Культуры клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и полипотентных миелоидных клеток-предшественников
- ФНО - ингибитор ранних (КОЕ-с) и коммитированных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-гм) in vivo
Введение к работе
Изучение молекулярных основ процессов, связанных с регуляцией гемопоэза, является одним из важнейших вопросов современной молекулярной биомедицины. Процессы регуляции кроветворения чрезвычайно сложны, т.к. должны обеспечивать адекватный ответ на потребности организма в различных клеточных элементах на протяжении всей его жизни. Гемопоэтическая система представляет собой совокупность клеточных популяций от наиболее примитивных плюрипотентных стволовых кроветворных клеток до зрелых клеток крови, каждая из которых обладает определенным пролиферативным потенциалом и выполняет специализированные функции. Стабильное кроветворение обеспечивается за счет постоянной продукции зрелых клеток крови. Известно, что ежедневный оборот клеток в кроветворной системе взрослого человека составляет около 1x10 клеток. Такая количественная регуляция гемопоэза осуществляется на уровне коммитированных, т.е. «определившихся» в типе дифференцировки, клеток-предшественников, утративших способность к длительному самоподдержанию и полипотентность. Регуляция отдела плюрипотентных стволовых кроветворных клеток, обеспечивающих неистощаемость кроветворения на протяжении всей жизни организма, осуществляется локально стромальным микроокружением. Тем самым, регуляция гемопоэза у млекопитающих осуществляется на двух принципиально разных уровнях. В настоящее время охарактеризовано большое количество сигнальных молекул, действующих через клеточные рецепторы и участвующих в регуляции пролиферации и дифференцировки коммитированных кроветворных клеток-предшественников соответствующих рядов кроветворения, т.е. обеспечивающих количественную регуляцию гемопоэза. Однако молекулярные механизмы процессов, связанных с регуляцией стволовых кроветворных клеток, до сих пор остаются мало изученными. В течение многих лет исследователи занимаются изучением физиологической роли цитокинов, участвующих в регуляции жизненно важных для организма процессов, таких как иммунный ответ, гомеостаз, морфогенез и гемопоэз. Известно, что цитокины являются медиаторами этих процессов и на молекулярном уровне обеспечивают взаимодействие клеток различных тканей и органов между собой, что является неотъемлемым условием функционирования целого организма. Одним из таких цитокинов является фактор некроза опухолей (ФНО), который был впервые описан как белковый фактор, вырабатываемый макрофагами в ответ на стимуляцию бактериальным эндотоксином, активность которого способна приводить к геморрагическому некрозу опухолей на экспериментальных моделях (Carswell et al. 1975; Old 1988). Однако дальнейшие исследования показали, что ФНО обладает множеством физиологических активностей. Такая плейотропность ФНО, в первую очередь, связана с тем, что спектр клеток организма, способных экспрессировать ФНО или его рецепторы ФНОР1/р55 и ФНОР2/р75, а также родственные им молекулы (лиганды ЛТа, ЛТр, LIGHT и рецептор ЛТрР), чрезвычайно широк. Изучение мышей с генетической инактивацией ФНО убедительно продемонстрировало исключительную важность ФНО для защиты организма. В частности, стало ясно, что ФНО является важнейшим медиатором иммунного ответа и воспаления, а также участвует в формировании и поддержании структуры вторичных лимфоидных органов. Известно, что повышенный уровень ФНО в сыворотке крови часто ассоциируется с патофизиологией некоторых инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также септического шока. В настоящее время препараты, системно блокирующие действие ФНО, широко применяются в лечении ревматоидного артрита, болезни Крона, анкилозирующего спондилеза (окостеняющего воспаления позвоночника) и некоторых других аутоиммунных заболеваний. В последние годы активно разрабатываются клинические протоколы по применению ФНО-блокаторов при лечении миелодисплазий. Однако у небольшой части пациентов, находящихся на анти-ФНО терапии, наблюдаются серьезные побочные эффекты, связанные с подавлением функций иммунной системы. В связи с этим, актуальным остается вопрос об установлении всех физиологических функций ФНО в контексте целого организма.
Большой интерес представляет изучение роли ФНО в регуляции гемопоэза. Известно, что некоторые цитокины способны оказывать преимущественно стимулирующее или ингибирующее воздействие на определенную популяцию кроветворных клеток. Как оказалось, плейотропность ФНО определяет более сложный характер его воздействия на гемопоэтические клетки. В частности, исследования в культуре с добавлением экзогенного ФНО продемонстрировали его роль в качестве бифункционального регулятора гемопоэза in vitro. При этом характер воздействия ФНО на гемопоэтические клетки in vitro обусловлен стадией дифференцировки клеток в культуре, наличием таких ростовых факторов как ИЛ-3, ФСК, ГМ-КСФ и др., а также количественным содержанием самого ФНО. Однако результаты таких исследований позволили лишь косвенно судить о физиологической роли ФНО в гемопоэзе in vivo, вследствие чего и возникла необходимость проведения дополнительных исследований на генетически модифицированных мышах. Исследования с культурами костного мозга, полученного от ФНО-дефицитных мышей, свидетельствуют об ингибируїощей роли ФНО в миелопоэзе как на уровне гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников так и на уровне зрелых клеток в культуре (Дризе и др. 2000; Друцкая и др. 2001; Drutskaya et al. 2005). Одним из механизмов такого ингибирования предположительно является опосредованная ФНО через ФНОР1 индукция апоптоза (Нифонтова и др. 2003).
Целью данного исследования было выявление физиологической роли ФНО в гемопоэзе in vivo и in vitro, а также решение вопроса о возможной «вырожденности» гемопоэтических функций ФНО и ЛТос за счет передачи сигнала через одни и те же рецепторы. Для разрешения этого вопроса исследования проводили на уникальной панели мышей, дефицитных («нокуатных») по генам ФНО и ЛТ, созданных в нашей лаборатории.
Семейство ФНО: цитокины-лиганды и их рецепторы
В настоящий момент в литературе описано около пятидесяти молекул, лигандов и рецепторов, относящихся к суперсемейству ФНО (Недоспасов 2003; Locksley et al. 2001; Fu and Chaplin 1999; Aggarwal 2003). С одной стороны, лиганды суперсемейства ФНО, передавая сигнал через свои рецепторы, участвуют в поддержании нормальных функций организма, таких как иммунный ответ, гемопоэз и морфогенез. С другой - доказано участие этих молекул в развитии онкологических и аутоиммунных заболеваний, отторжении ткани при трансплантации, резорбции кости, септическом шоке и вирусной репликации. На клеточном уровне взаимодействие лигандов и рецепторов этого суперсемейства может индуцировать пролиферацию, дифференцировку, выживание или же апоптоз. При этом передача сигнала внутри клетки осуществляется через активацию различных сигнальных каскадов при участии молекул NF-кВ, Jun/Fos, р38 МАРК and ERK1/ERK2.
Подсемейство ФНО входит в состав суперсемейства и включает близкородственные лиганды: ФНО, ЛТа, ЛТр и LIGHT, и их рецепторы: ФНОР1, ФНОР2, ЛТрР, HVEM (рецептор герпес-вируса) и DcR3 (рецептор-приманка или «пустышка» 3). Характерной особенностью взаимодействия лигандов и рецепторов подсемейства ФНО является избыточность сигнала, при которой лиганд может взаимодействовать сразу с несколькими рецепторами, а рецептор принимать сигнал от нескольких лигандов (Рис. 3).
Это обстоятельство усложняет задачу исследователей по выявлению физиологической роли отдельных лигандов и рецепторов подсемейства ФНО. Первые подходы к изучению структуры ФНО, механизма и характера его воздействий были сделаны после клонирования кДНК ФНО (Pennica et al. 1984; Wang et al. 1985). ФНО и наиболее близкородственный ему цитокин, лимфотоксин а (ЛТ) (Kolb and Granger 1968; Ruddle and Waksman 1967), были первыми представителями быстро растущего семейства ФНО лигандов. Гены, кодирующие данные цитокины, а также ЛТр, тесно генетически сцеплены и расположены в пределах 15Кб в локусе ФНО внутри локуса (Рис. 4), кодирующего гены главного комплекса гистосовместимости на хромосоме 17 мыши и хромосоме 6 человека (Nedospasov et al. 1986; Browning and French 2002; Murphy et al. 1998). В биологически активной форме лиганды подсемейства ФНО образуют тримеры, которые, в свою очередь, способствуют тримеризации соответствующих рецепторных молекул на поверхности клетки и последующей передаче внутриклеточного сигнала.
При этом цитокины-лиганды подсемейства ФНО могут функционировать как в растворимой, так и в мембранно-связанной форме, в виде трансмембранных белков И-го типа. Так, ФНО и ЛТа являются растворимыми гомотримерами и взаимодействуют с рецепторами ФНОР1 и ФНОР2, которые также называют исходя из молекулярной массы этих белков: 55кЭа и 75кЭа, соответственно р55 и р75 (Ware et al. 1995). Что касается ФНО, то он преимущественно существует в растворимой форме, хотя его мембранно-связанная форма также биологически активна (Grell et al. 1995; Grell et al. 1998a; Kinkhabwala et al 1990). Лимфотоксин P преимущественно функционирует в виде мембранного комплекса с лимфотоксином а (ЛТщЛТрг). Такой гетеротример взаимодействует со специфичным для него ЛТр рецептором, экспрессия которого наблюдается преимущественно среди клеток нелимфоидного происхождения (Crowe et al. 1994). В отличие от ЛТ, который продуцируется клетками лимфоидного происхождения: Т и В лимфоцитами и NK клетками (Ware et al. 1992), ФНО экспрессируют многие клетки организма, в том числе макрофаги, активированные лимфоциты, нейтрофилы, дендритные и эндотелиальные клетки, фибробласты и многие другие типы клеток как гемопоэтической, так и не-костномозговой природы (Pfeffer 2003; Cuturi et al. 1987; Keiker et al. 1985). Основной рецептор ФНО, ФНОР1, экспрессируется большинством клеток организма, а ФНОР2 - преимущественно клетками иммунной системы и эндотелия. Такой характер экспрессии указывает на роль лигандов и рецепторов ФНО в передаче сигналов между клетками иммунной системы, но, помимо этого, обеспечивает взаимодействие клеток иммунной системы с клетками других тканей и органов, что, в конечном итоге, обеспечивает поддержание гомеостаза целого организма.
Все рецепторы семейства ФНО по структуре своего цитоплазматического домена могут быть разбиты на две подгруппы: содержащие и не содержащие так называемый «домен смерти». Изначально предполагали, что ингибирующее воздействие ФНО на клеточную пролиферацию, а точнее передача апоптотических сигналов, происходит при участии ФНОР1, в то время как все активационные сигналы передаются через ФНОР2, который не содержит «домена смерти». Однако дальнейшие исследования усложнили картину, показав, что оба рецептора способны передавать сигналы как на клеточную активацию, так и на апоптоз. Еще в 90-х годах было обнаружено, что помимо цитотоксической активности ФНО, передаваемой через ФНОР1 и индуцирующей клеточную гибель, ФНОР1 также может передавать активирующий сигнал на пролиферацию фибробластов и синтез простагландина (Engelmann et al. 1990; Espevik et al. 1990). С другой стороны было показано, что ФНОР2 отвечает за передачу активирующего сигнала на пролиферацию Т- лимфоцитов (Grell et al. 1998a; Tartaglia et al. 1993a) и синтез ГМ-КСФ in vitro (Vandenabeele et al. 1992), а также ингибирует пролиферацию ранних гемопоэтических клеток-предшественников in vitro (Jacobsen et al 1995) и передает сигнал на апоптоз зрелым Т-лимфоцитам (Zheng et al. 1995). В отличие от ФНОР2, молекулярный механизм передачи сигнала через ФНОР1 является изучен достаточно полно. Характерной особенностью этого рецептора является наличие «домена смерти», что в классификации ФНО рецепторов позволяет относить его к группе «рецепторов смерти», к которой также принадлежит и Fas рецептор. Однако в отличие от Fas рецептора, ФНОР1 способен при участии целого ряда адаптериых молекул одновременно запускать каскады, приводящие к противоположным по результату сигналам, а именно активации нескольких ключевых транскрипционных факторов, таких как NFKB и АРІ, фосфорилированию многих клеточных субстратов соответствующими протеинкиназами, активации каспаз и, как следствие, программированной клеточной смерти (Рис. 5) (Wallach et al. 1999; Micheau and Tschopp 2003; Shaulian and Karin 2002; Karin and Lin 2002).
Изучение кроветворения у мышей, дефицитных по рецепторам ФНОР1 иФНОР2
Анализ популяций стволовых кроветворных клеток и кроветворных клеток-предшественников костного мозга КО мышей и мышей ДТ показал, что у мышей, дефицитных по ФНОР1, наблюдается значительное увеличение в количестве этих клеток по сравнению с контрольной группой и мышами, дефицитными по ФНОР2 (Zhang et al. 1995). Эти результаты могут свидетельствовать об ингибирующем воздействии ФНО на пролиферацию и дифференцировку ранних кроветворных клеток-предшественников in vivo, причем эта регуляция осуществляется, главным образом, через ФНОР1. Через несколько лет были опубликованы еще более интригующие результаты, свидетельствующие об участии ФНОР1 в передаче регуляторных сигналов стволовым кроветворным клеткам костного мозга. Было показано, что при анализе клеток костного мозга стареющих мышей ( 6 мес), дефицитных по ФНОР1, наблюдаются существенные нарушения в динамике кроветворения по многим параметрам по сравнению с мышами ДТ (Rebel et al. 1999). В первую очередь, у таких стареющих мышей популяция стволовых кроветворных клеток костного мозга значительно меньше, чем у мышей ДТ. Во-вторых, у КО мышей со временем происходит увеличение как общего количества клеток костного мозга, так и количества коммитированных клеток-предшественников миелоидного типа дифференцировки и зрелых клеток периферической крови. Эти данные абсолютно не противоречат ранее полученным результатам Zhang et al. (1995).
Исходя из двух вышеперечисленных исследований можно предположить, что передача сигнала через ФНОР1 играет важную роль в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток костного мозга. Более того, отсутствие этого сигнала нарушает строгий баланс между процессами пролиферации (самообновлением) и дифференцировки п-СКК, в результате чего происходит ускоренное истощение популяции п-СКК и увеличение количества коммитированных клеток-предшественников. Однако следует отметить, что эти данные могут лишь косвенно свидетельствовать об участии ФНО в регуляции п-СКК in vivo, т.к. известно, что помимо ФНО передачу сигнала через ФНОР1 осуществляет родственный ему цитокин, лимфотоксин а (ЛТа). Именно поэтому изучение динамики кроветворения и регуляции стволовых кроветворных клеток у мышей, дефицитных по ФНО, должно было прояснить физиологическую роль ФНО в гемопоэзе in vivo. Помимо этого, был исследован вопрос и о возможной избыточности сигнала передаваемого ФНО и ЛТ через ФНОР1 и ФНОР2 в регуляции гемопоэза in vivo. Для этого некоторые исследования проводили с использованием мышей, дефицитных как по ФНО, так и по ЛТ.
Еще в 80-х годах было сформулировано представление о «хорошем» и «плохом» ФНО, который помимо вышеописанных нормальных физиологических функций может являться и медиатором разрушительных для организма процессов. Известно, что повышенный уровень ФНО в сыворотке больных часто ассоциируется с развитием некоторых инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также септического шока. В настоящий момент роль ФНО в патофизиологии целого ряда аутоиммунных заболеваний является неоспоримым фактом. В первую очередь речь идет о ревматоидном артрите и других типах артрита (Feldmann and Maini 2001; Kavanaugh et al. 2000; Fleischmann 2003), болезни Крона (Beutler 2001; Baert et al. 1999), анколизирующем спондилезе (Braun et al. 2003), псориазе (Mease and Goffe 2005) и др. Применение блокаторов, таких как Infliximab (сделанного на основе моноклонального антитела, специфически распознающего и нейтрализующего ФИО человека) и Etanercept (генно-инженерный вариант растворимого рецептора ФНОР2, который может нейтрализовать как ФНО, так и растворимый ЛТа), способных биохимически подавлять функции ФНО in vivo является чрезвычайно перспективным направлением в лечении многих аутоиммунных заболеваний (Hochberg et al. 2003; Haraoui 2005; Scallon et al. 2002).
В последние годы особый интерес вызывает возможность применения ФНО-блокаторов при лечении различного рода миелодисплазий (Deeg et al. 2002; Deeg et al. 2004; Maciejewski et al. 2002). Синдром миелодисплазий (СМД) включает в себя целую группу гематологических заболеваний, связанных с нарушениями в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток, что в некоторых случаях приводит к развитию у пациентов лейкемий. Однако почти половина летальных исходов от этого заболевания связаны не с клеточной трансформацией, а с клеточной недостаточностью в крови (анемия, нейтропения, тромбоцитопения) (Mangi and Mufti 1992; Molldrem et al. 2002). При этом, характерной особенностью СМД является повышенная клеточность костного мозга, связанная с увеличением числа CD34+ клеток, фенотип характерный для кроветворных клеток-предшественников (Raza et al. 1996). Исследования показали, что одной из причин нарушений в регуляции гемопоэза у больных СМД является повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов, в частности ФНО, что приводит к увеличению клеточного апоптоза как в костном мозге, так и в крови (Gersuk et al. 1998; Mundle et al. 1999a; Mundle et al. 1999b; Zang et al. 2001). Первые клинические испытания заключались в попытке подавить функцию Т-лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные цитокины, с помощью анти-тимоцит глобулина (АТГ) (Steensma et al. 2003; Molldrem et al. 2002). Однако в настоящее время активно изучается вопрос о целесообразности применения как АТГ, так и ФНО-блокаторов при терапии СМД (Deeg et al. 2004).
Однако системное ингибирование ФНО сопряжено с серьезными опасностями для организма, так как в его отсутствии изменяется структура лимфоидных органов и нарушается индукция многих механизмов антибактериальной защиты (Ehlers 2005). Так, например, у пациентов, страдающих ревматоидным артритом и находящихся на терапии с применением блокаторов ФНО, во много раз возрастает вероятность реактивации инфекционного туберкулеза (Fleischmann 2003; Wallis et al. 2004; Means et al. 2001; Wolfe et al. 2004; Gomez-Reino et al. 2003). В последние годы в литературе стали встречаться данные описывающие единичные случаи возникновения лимфом у пациентов, находящихся на анти-ФНО терапии (Brown et al. 2002; Broussais et al. 2005). С другой стороны, нельзя не упомянуть о клинических испытаниях анти-ФНО для лечения некоторых видов рака, поскольку для некоторых неоплазий ФНО - в явном несоответствии со своим названием - играет про-туморогенную роль (Szlosarek et al. 2006; Scott et al. 2003).
Культуры клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и полипотентных миелоидных клеток-предшественников
Физиологическая роль ФНО в процессах связанных с гемопоэзом носит многосторонний характер. Многочисленные данные о возможной роли ФНО в регуляции гемопоэза основываются преимущественно на проведенных in vitro исследованиях с использованием рекомбинантного ФНО. Известно, что ФНО может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на гемопоэтические клетки in vitro в зависимости от наличия других ростовых факторов в культуре, а также от количественного содержания самого ФНО (Jacobsen et al. 1995, Snoeck et al. 1996, Rusten et al. 1995, Dybedal et al. 2001 и др.). В связи с этим нам представлялось важным исследовать физиологическую роль ФНО в регуляции кроветворных клеток-предшественников in vitro. Для этого мы изучали гемопоэз на модели длительной культуры костного мозга (ДККМ) нокаутных мышей, что позволило получить новые сведения о роли ФНО в развитии кроветворной ткани и охарактеризовать динамику пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток с изначально нарушенным сигнальным каскадом, опосредованным ФНО. Мы установили, что в ФНО-дефицитных культурах происходит двукратное увеличение клеточной продукции по сравнению с культурами дикого типа (ДТ) (Друцкая и др. 2001, Drutskaya et al. 2005). Добавление рекомбинантного ФНО (10 нг/мл) в ДККМ, полученных из ФНО-дефицитных мышей, приводило к снижению общего числа клеток в культуре до уровня ДТ (Рис.7А).
Интересно, что достоверных отличий в количестве кроветворных клеток-предшественников, образующих смешанные колонии миелоидного типа в агаровых культурах (КОЕ-к) при стимуляции SCF(100 нг/мл) и IL-3 (30 нг/мл), в костном мозге мышей контрольной и исследуемой групп выявлено не было (день 0) (Рис.7В). Однако анализ количественного содержания КОЕ-к в длительных культурах костного мозга (ДККМ) показал, что в культурах, полученных из костного мозга нокаутных мышей, постепенно возрастало количество КОЕ-к в сравнении с ДТ (Рис.7В). При культивировании клеток костного мозга без стромы в присутствии гемопоэтических ростовых факторов, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток-предшественников миелоидного направления, мы также наблюдали увеличение клеточной продукции в ФНО-дефицитных культурах при сравнении с ДТ (Рис.8).
Эти результаты позволили предположить, что различия в характере кроветворения в культурах костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей и мышей ДТ, обусловлены ингибирующим воздействием ФНО на пролиферацию кроветворных клеток-предшественников в процессе миелопоэза in vitro.
Помимо повышенной пролиферативной активности в ДККМ, полученных из ФНО-дефицитных мышей, мы наблюдали и другие эффекты, свидетельствующие об участии ФНО в дифференцировке кроветворных клеток-предшественников в культуре. Так, морфологический анализ окрашенных Giemsa клеток в культуре костного мозга нокаутных мышей выявил повышенное содержание примитивных недифференцированных форм (миелобласты, промиелоциты) и уменьшение числа зрелых клеток, находящихся на терминальной стадии дифференцировки (сегментированные нейтрофилы) по сравнению с ДТ (Таблица 1).
Эти данные указывают на то, что недостаток экспрессии ФНО может приводить к задержке в дифференцировке клеток-предшественников. Ранее сообщалось, что у мышей, дефицитных по ФНО, наблюдается пониженная экспрессия ГМ-КСФ, необходимого для дифференцировки гранулоцитов и макрофагов (Marino et al, 1997), однако это наблюдение не было соотнесено с возможными дефектами в гемопоэзе. Роль ФНО в регуляции пролиферации и дифференцировке тучных клеток.
ФНО принимает участие в регуляции пролиферации и дифференцировки тучных клеток in vitro (Wright et al. 2006), предположительно образующихся из общего с гранулоцитами и макрофагами миелоидного предшественника (Akashi et al., 2006). Оказалось, что ФНО оказывает стимулирующее воздействие на пролиферацию и дифференцировку предшественников тучных клеток. При культивировании клеток костного мозга, полученных из ФНО-дефицитных мышей, в присутствии цитокинов, стимулирующих дифференцировку тучных клеток in vitro, наблюдается значительное снижение количества клеток в культуре по сравнению с ДТ. При этом наиболее заметные различия наблюдаются после второй недели культивирования (Рис.9А), вероятно потому, что к этому моменту в культуре истощается популяция гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников и культура становится более гомогенной. По всей видимости, ФНО участвует в регуляции миелопоэза на уровне именно тех кроветворных клеток-предшественников, которые способны дифференцироваться как в гранулоцитарно-макрофагальном направлении, так и в направлении предшественников тучных клеток. ФНО является положительным регулятором популяции предшественников тучных клеток и, наоборот, ингибирует миелопоэз на уровне гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников. Отметим, что у мышей, дефицитных по ФНО, снижено количество перитонеальных тучных клеток (Рис.9В), но увеличено общее количество гранулоцитарных клеток в крови (Таблица 3) и костном мозге (Таблица 2), а также гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников в костном мозге (Рис.12С), что корелирует с данными, полученными in vitro.
ФНО - ингибитор ранних (КОЕ-с) и коммитированных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-гм) in vivo
Проведенные ранее исследования показали, что у мышей, дефицитных по ФНОР1, наблюдается значительное увеличение в количестве Linne8cKitp0SScalpos клеток по сравнению с контрольной группой и мышами, дефицитными по ФНОР2 (Zhang et al. 1995). Более того, у стареющих мышей ( 6 мес), дефицитных по ФНОР1, происходит увеличение как общего количества клеток костного мозга, так и количества коммитированных клеток-предшественников миелоидного типа дифференцировки и зрелых клеток в крови. При этом у таких стареющих мышей количество стволовых кроветворных клеток костного мозга значительно меньше, чем у мышей ДТ (Rebel et al. 1999). Основываясь на этих двух исследованиях можно было предположить, что передача сигнала через ФНОР1 играет важную роль в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток костного мозга. Более того, отсутствие этого сигнала нарушает строгий баланс между процессами пролиферации (самообновлением) и дифференцировки СКК, в результате чего происходит ускоренное истощение популяции СКК и увеличение количества коммитированных клеток-предшественников. Следует отметить, что приведенные могут лишь косвенно свидетельствовать об участии ФНО в регуляции СКК in vivo, т.к. известно, что помимо ФНО передачу сигнала через ФНОР1 осуществляет родственный ему цитокин, ЛТа. Именно поэтому изучение динамики кроветворения и регуляции стволовых кроветворных клеток у мышей, дефицитных как по ФНО, так и по ФНО/ЛТа/ЛТР, представлял особый интерес.
Следующий этап исследования физиологии кроветворения у мышей, дефицитных по ФНО, а также у мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса, заключался в анализе самых примитивных кроветворных клеток-предшественников -стволовых кроветворных клеток. Для этого оценивали способность СКК, полученных из костного мозга нокаутных мышей, репопулировать костный мозг облученных реципиентов наряду с СКК, полученных из костного мозга мышей ДТ (Рис. 15). В условиях конкурентной репопуляции, когда летально облученному реципиенту трансплантируют дифференциально маркированную смесь кроветворных клеток из двух источников: нормальных гемопоэтических клеток и клеток, полученных из ФНО или ФНО/ЛТсс/ЛТр-дефицитных мышей, можно судить о конкурентной способности примитивных стволовых кроветворных клеток нокаутных мышей репопулировать костный мозг наравне с СКК мышей ДТ, т.е. оценивать физиологические потенции этих клеток. Популяцию СКК различают по способности к кратковременной (через 2 месяца) и длительной (через 4-6 месяцев) репопуляции костного мозга облученных реципиентов. В наших экспериментах в качестве реципиентов использовали конгенных мышей, отличающихся от мышей линии С57В1/6 лишь экспрессией Ly5.2 маркера вместо LyS.l на поверхности большинства клеток организма, что позволило получить и различать три группы костномозговых химер. Первая группа (контрольная) после облучения была восстановлена смесью клеток костного мозга ДТ, полученного от двух конгенных доноров в соотношении Ly5.2 (ДТ) / Ly5.1 (ДТ) =10/1. Второю и третью группу мышей восстанавливали смесью клеток костного мозга мышей ДТ (Ly5.2) и нокаутных мышей Ly5.1 (ФНО/ЛТа/ЛТр-/- и ФНО-/-, соответственно) в том же соотношении: Ly5.2 (ДТ) / Ly5.1 (КО) =10/1. Способность СКК, полученных из нокаутных мышей, репопулировать костный мозг облученных реципиентов оценивали через 4-6 месяцев после трансплантации. Для этого сравнивали экспрессию Ly5.1 миелоидными клетками (Gr-1+ клетки) и В-лимфоцитами (В220+ клетки) в костном мозге и Т-лимфоцитами (CD3e+ клетки) в селезенке мышей в трех группах.
Неожиданные результаты были получены в обеих исследуемых группах. С одной стороны, клетки костного мозга, полученные из мышей, дефицитных по ФНО/ЛТа/ЛТр, репопулируют костный мозг облученных реципиентов с большей эффективностью, чем клетки-предшественники костного мозга мышей ДТ. С другой - способность клеток костного мозга ФНО-дефицитных мышей к длительной репопуляции костного мозга несколько снижена по сравнению с контрольной группой. Как уже обсуждалось, у мышей с тройным нокаутом увеличена популяция LinnegcKitposScalpos клеток в костном мозге (Рис.12А). По всей видимости, это происходит за счет увеличения как мультипотентных кроветворных клеток предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с; Рис. 12В), так и за счет увеличения популяции самых ранних кроветворных клеток-предшественников - СКК, способных к длительной репопуляции костного мозга облученных реципиентов.
В данной работе показано, что ФНО и ЛТ, играющие важную роль в иммунном ответе и воспалении, важны также для регуляции кроветворной системы через сложную систему сигналов, регулирующих пролиферацию, апоптоз и взаимодействие со стромальным микроокружением. Дальнейшее изучение роли этих цитокинов в кроветворении и установление тонких молекулярных механизмов передачи сигнала, в частности, разграничение функций ФНО и ЛТос, может открыть новые перспективы в понимании регуляции гемопоэза на молекулярном уровне, а также в более глубоком понимании возможностей и ограничений при терапии заболеваний с применением цитокинов или их блокаторов. На основе наших данных можно считать, что при терапевтическом блокировании ФНО для подавления воспалительного процесса при лечении аутоиммунных заболеваний и других патологий человека не стоит ожидать сильных побочных эффектов, связанных с нарушением в регуляции кроветворения.
