Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Факторы трансляции и их участие в регуляции синтеза белков 10
1.1. Общая характеристика факторов инициации 10
1.2. Участие факторов инициации в сборке инициаторного комплекса 13
1.3. Роль факторов инициации в регуляции ранних этапов инициации трансляции 18
1.4. Роль факторов инициации в регуляции связывания различных клеточных мРНК преишщиаторным комплексом 23
Глава 2. Регуляция синтеза бедка в метках при инфекции 28
2.1. Подавление синтеза клеточных белков при пикорнавирусной инфекции 30
2.2. Кандидаты на роль вирус-специфического ингибитора трансляции 36
2.3. Нарушение активности кэп-связывающих белков в системах "пикорнавирус-клетка" с кинетикой угнетения синтеза белка по типу I 39
2.4. Конкуренция вирусных и клеточных мРНК в системах "пикорнавирус-клетка" с кинетикой угнетения синтеза белка по типу II 44
2.5. Ионные условия в клетке и подавление синтеза клеточных белков 47
2.6. Общее угнетение синтеза белка на поздних стадиях инфекции 48
Глава 3. Материалы и методы 51
3.1. Реактивы и биоматериалы 51
3.2. Буферные растворы 52
3.3. Пассирование клеток Кребс-2 53
3.4. Выращивание вируса ЭМК 54
3.5. Выделение белков, меченных радиоактивными аминокислотами 55
3.6. Определение радиоактивности в кислото-растворимой и кислотонерастворимой фракциях из клеток Кребс-2 56
3.7. Очистка вируса ЭМК и выделение вирионной РНК 57
3.8. Выделение цитоплазматической поли(А)-содержащей РНК из клеток Кребс-2 58
3.9. Выделение инициаторной тНЖ~ из клеток Кребс-2 60
3.10. Аминоацилирование тРНК 3Н-метионином 61
3.11. Выделение суммарных факторов инициации из клеток Кребс-2 и ретикулоцитов кролика 63
3.12. Бесклеточная белок-синтезирующая система из клеток Кребс-2 66
3.13. Анализ комплекса / 3Н-мет-тРНКф-40 S субчастица рибосомы / 67
3.14. Тестирование комплекса /3Н-мет-тРНКй« еП-2'ГТФ/ на нитроцеллюлозных фильтрах 69
3.15. Электрофорез белков в ПААГ с ДСН и радиоавтография 70
Глава 4. Изучение ранних этапов инициации трансляции в клетках кребс-2, зараженных вирусом 72
4.1. Изучение образования 40 5 преинициаторного комплекса i 75
4.2. Изучение активности факторов инициации, участвующих в образовании преинициаторного комплекса 85
Глава 5. Активность факторов инициации в зараженбых клетках и влияние факторов на относительную эффективность трансляции клеточных и вирусных мРНК 92
5.1. Влияние суммарных факторов инициации из зараженных клеток на трансляцию клеточных мРНК и РНК вируса ЭМК 92
5.2. Влияние факторов инициации на трансляционную конкуренцию клеточных мРНК
и РНК вируса ЭМК 97
Выводы 128
Список цитированной литературы 130
- Роль факторов инициации в регуляции связывания различных клеточных мРНК преишщиаторным комплексом
- Нарушение активности кэп-связывающих белков в системах "пикорнавирус-клетка" с кинетикой угнетения синтеза белка по типу I
- Выделение суммарных факторов инициации из клеток Кребс-2 и ретикулоцитов кролика
- Изучение активности факторов инициации, участвующих в образовании преинициаторного комплекса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Белковые факторы инициации играют важную роль в регуляции трансляции у эукариот, контролируя интенсивность синтеза белка на уровне образования 40 S преиници-аторного комплекса /40 S субчастица рибосомы'мет-тРИК^/, и относительную эффективность трансляции различных мРНК на уровне связывания мРНК с 40 S преишщиаторным комплексом /108 , 20/. Одной из моделей для изучения регуляторной роли факторов инициации служат клетки млекопитающих, зараженные пикорнавируса-ми / 71 , 142 /.
В клетках млекопитающих при пикорнавирусной инфекции происходят глубокие качественные и количественные изменения в работе белок-синтезирующего аппарата. В первой половине инфекционного цикла развивается избирательное подавление синтеза белков клетки-хозяина на фоне нарастающего синтеза вирусных белков. На более поздних стадиях происходит общее неизбирательное угнетение синтеза клеточных и вирусных белков. Причины общего подавления белок-синтезирующей активности зараженных клеток изучены недостаточно. Имеется мало данных об эффективности отдельных этапов инициации на разных стадиях инфекции, в том числе об эффективности образования 40 S преинициаторного комплекса , и о функциональном состоянии факторов инициации, обеспечивающих его образование. Значительно лучше изучен механизм избирательного угнетения синтеза клеточных белков, однако имеющиеся в литературе данные относятся главным образом к системе "клетки Hela-вирус полиомиелита". Показано, что в зараженных полиовирусом клетках инактивируется один из факторов инициации, в результате чего прекращается инициация синтеза белка на кле-
точных, но не на вирусных матрицах /75 , 97 ,116/.
Вместе с тем, ряд фактов указывает на то, что в других системах "пикорнавирус-клетка" избирательное подавление синтеза клеточных белков может происходить в результате конкуренции между вирусными и клеточными мРНК за фактор (факторы) инициации / 86 , 181 , 221 / Данные о возможной природе дискриминирующего фактора противоречивы / 86 ,181 /.
Все это свидетельствует об актуальности темы данной работы, посвященной выяснению роли факторов инициации трансляции в регуляции синтеза белков в клетках Кребс-2, зараженных вирусом энцефаломиокардита (ЭМК).
Актуальность проблемы определяется также и тем, что к группе пикорнавирусов принадлежат возбудители инфекционных заболеваний человека и животных. Поэтому выявление специфических особенностей трансляции вирусных и клеточных мРНК при пикорна-вирусной инфекции может способствовать выработке стратегии избирательного воздействия на репликацию вируса в зараженной клетке.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение влияния инфекции на функциональное состояние факторов инициации трансляции, осуществляющих образование 40S преинициа-торного комплекса, и факторов инициации, регулирующих эффективность трансляции клеточных мРНК и РНК вируса ЭМК, а также выявление тех фракций факторов инициации, которые способны воздействовать на трансляционную конкуренцию вирусных и клеточных мРНК. В связи с этим перед нами стояли следующие задачи: разработка способа тестирования 40 S преинициаторного комплекса в зараженных клетках; сравнение эффективности образования 40 $ преинициаторного .комплекса на разных стадиях инфекции; изуче-
- 8 -ниє влияния инфекции на активность фактора еІЕ-2, играющего ключевую роль в образовании преинициаторного комплекса /120, 188 /; сравнение способности факторов инициации из зараженных и незараженных клеток поддерживать трансляцию клеточных мРНК in viiro ; исследование влияния различных факторов и фракций факторов инициации на конкуренцию между вирусными и клеточными мРНК в нефракционированной белок-синтезирующей системе из клеток Кребс-2.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучена эффективность протекания ранних стадий инициации в клетках Кребс-2, зараженных вирусом ЭМК. Впервые показано, что общее неизбирательное подавление синтеза белков в зараженных клетках коррелирует с нарушением образования 40 S преинициа-торного комплекса. Обнаружено, что фактор eIF-2 и другие макро-молекулярные компоненты, участвующие в образовании 40 S комплекса, выделенные из зараженных клеток, сохраняют функциональную активность in vitro . Показано, что в клетках Кребс-2, зараженных вирусом ЭМК, инфекция не вызывает инактивации факторов инициации, необходимых для трансляции клеточных мРНК. Впервые показано, что конкуренция между РНК вируса ЭМК и клеточными мРНК, приводящая к избирательному вытеснению клеточных матриц из транслирующего аппарата, происходит за функционально немодифивдрованные факторы инициации. Установлено, что факторы eIF-2, -3 и -4В не снимают конкуренцию между РНК вируса ЭМК и клеточными мРНК в нефракционированной бесклеточной системе из клеток Кребс-2, то есть эти факторы не лимитируют их совместную трансляцию. Впервые обнаружено, что способность препаратов суммарных факторов инициации восстанавливать трансляцию клеточных мРНК, подавляемую в присутствии вирусных РНК, складыва-
ется из действия компонентов, разнохарактерных по своему влиянию на конкуренцию матриц. Полученные данные имеют значение для понимания механизмов регуляции трансляции у эукариот.
Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела взаимодействия вируса и клетки Межфакультетской проблемной НИЛ им. А.Н.Белозерского МГУ 14 декабря 1984 г. Материалы работы доложены на международном симпозиуме "Стратегия генома РНК-со-держащих вирусов животных" (Москва,1980), на втором советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Пущино, 1980), 16-й конференции ФЕБ0(Москва,1984)
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из разделов: оглавление, введение, обзор литературы (2 главы), собственные исследования (3 главы), обсуждение, выводы, список цитирован-ной литературы. Работа содержит 25 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 234 наименований.
Все экспериментальные данные получены самостоятельно.
Роль факторов инициации в регуляции связывания различных клеточных мРНК преишщиаторным комплексом
Помимо интенсивности трансляции, на уровне инициации регулируется также эффективность трансляции отдельных мРНК, в частности относительный уровень синтеза oL- и j$ -цепей глобина в ретикулоцитах. Несмотря на то, что в клетках скорость синтеза и содержание мРНК, кодирующих о -цепь глобина в 1,5 раза выше, чем мРНК для J -цепи, соответствующие полипептиды синтезируются в эквимолярных количествах / 138, 139/. При трансляции эквимолярных количеств обеих мРНК относительная эффективность синтеза oi -глобина зависит от общей концентрации мРНК в бесклеточной системе таким образом, что при её увеличении до насыщения системы матрицами отношение синтеза С -глобина к синтезу jb -глобина снижается. В этом случае в составе 40 $ комплекса обнаруживаются преимущественно мРНК А цепи / I40, 215/. Эти факты свидетельствуют о существовании конкуренции мРНК за связывание с преинициаторным 40 5 комплексом. Самые разные эукариотические мРНК способны конкурировать между собой
В нескольких лабораториях были получены многочисленные данные о том, что процесс конкуренции между мРНК можно регулировать, варьируя концентрации факторов инициации в бесклеточной системе. Так, в случае конкуренции oi- и fi-глобиновых мРНК Кэбэт и Чапель идентифицировали дискриминирующий фактор инициации как еЗЗ?-4В / 5/. Однако в лаборатории Кэмпфера было продемонстрировано ослабление конкуренции со стороны fi -глобиновых мРНК при внесении в бесклеточную систему препарата eIF-2, свободного от еВ?-4В. При этом было показано, что активность, восстанавливающая трансляцию мРНК о -глобина ко-мигрирует с активностью eIF-2 на последней стадии очистки этого фактора / 63 /. В соответствии с другими данными /164 ,17 конкуренция между эукариотическими мРНК может происходить за факторы ЄІЗГ-4А и eIF-43?. Наконец, при трансляции мРНК миозина в бесклеточной системе из зародышей пшеницы относительная эффективность использования этой матрицы по сравнению с другими кэпированными мРНК возрастала при добавлении фактора eIF-З в комплексе с каким-то дополнительным компонентом, предположительно КСБ-І/ 91 /.
Все факторы инициации, выдвигаемые на роль дискриминирующих могут образовывать комплекс с мРНК. Факторы eIF-2, -3, -4В обладают свойствами РНК-связывающих белков, то есть в отсутствие 40 субчастицы образуют с РНК относительно стабильные ) комплекса / 23 ,229 /. По-видимому, факторы могут "узнавать" структурные элементы эукариотических мРНК. Так eIF-2 более активно связывает мРНК, чем нематричные РНК /182/, то же справедливо и для фактора eIF-4B /23 /. Фактор eIF-2 связывается с внутренними участками мРНК, в том числе с инициаторной последовательностью /35 ,117/. Кроме того еІГ-2 обладает сродством к кэпу на 5 -конце мРНК, поскольку связывание фактора с глобиновой мРНК угнетается в присутствии аналогов кэш /118/. Поэтому можно думать, что наряду со своей "канонической" функцией в образовании 40 преинициаторного комплекса, eIF-2 участвует также в узнавании мРНК при её присоединении к 40 5 комплексу и в выборе инициаторного сигнала на мРНК. Факторы ЄІГ-4В, -4А, -4Е (последние - возможно в составе eIF-4F) непосредственно взаимодействуют с 5 -концом мРНК в процессе АТФ-зависимого связывания мРНК /89 /.
Таким образом, все перечисленные факторы в принципе могут претендовать на роль дискриминирующих, поскольку они способны в той или иной степени непосредственно взаимодействовать с мРНК и специфическими элементами её структуры.
Для объяснения механизма конкуренции Лодиш предложил кинетическую модель, основанную на предположении о различном сродстве мРНК к нативной 40 субчастице рибосомы, то есть к 40 $ субчастице, несущей все необходимые для присоединения мРНК и мет-тШКф факторы инициации /140/. При этом процесс присоединения мРНК для упрощения рассматривался в виде одностадийного процесса, лимитируемого концентрацией активного 40 комплекса, несущего мет-тРНКф. Из расчета такой модели вытекало утверждение, что при любом воздействии, приводящем к снижению концентрации 40 преинициаторного комплекса, а следовательно, к об-щему снижению эффективности инициации, должны преимущественно транслироваться те мРНК, которые имеют относительно более высокое сродство к нативной 40 $ субчастице / 140/.
Более поздние исследования механизма конкуренции, проведенные в группе Тэча / 32, 231/, показали, что относительно более высокая конкурентоспособность одних эукариотических мРНК по сравнению с другими коррелирует с их относительно более эффективной трансляцией в условиях, когда концентрация 40 пре-инициаторного комплекса не лимитирует трансляцию. Для описания механизма конкуренции Тэч и соавторы предложили кинетическую модель инициации, в соответствии с которой ключевым моментом в дискриминации между матрицами является образование свободного промежуточного комплекса /мРЖ дискриминирующий фактор/ / 84 /. Одним из допущений, сделанных при построении модели, являлось различное сродство мРНК к фактору, участвующему в связывании мРНК с 40 $ преинициаторным комплексом. При этом предполагается, что последующее связывание комплекса /мРНК фактор/ с 40 $ субчастицей происходит с одинаковой эффективностью, независимо от типа мРНК. В соответствии с предложенной кинетической моделью различные мРНК, обладающие разным сродством к дискриминирующему фактору, должны обладать разной эффективностью трансляции и в отсутствии конкуренции. При лимитирующих количествах этого фактора должны преимущественно транслироваться мРНК с повышенным сродством к фактору. Концентрация 40 $ преинища-торного комплекса не оказывает существенного влияния на относительную эффективность трансляции таких мРНК и может определять только общий уровень синтеза белка в системе с конкурирующими мРНК / 84 /. Модель Тэча хорошо согласуется с данными по конкуренции кэпированных клеточных и вирусных мРНК in vivo и in vitro /l78» 231/.
Нарушение активности кэп-связывающих белков в системах "пикорнавирус-клетка" с кинетикой угнетения синтеза белка по типу I
В 1976 году Кауфман и соавторы Діб / показали, что на полисомах, выделенных из зараженных клеток в период угнетения синтеза клеточных белков, эффективность инициации значительно снижена, в то время как в период более позднего синтеза вирус-специфических белков она протекает с нормальной интенсивностью. При этом активность фракций промытых 0,5 М КСІ рибосом, факторов элонгации и аминоавдл-тРНК-синтетаз не отличалась от контрольного уровня. Дефектными оказались суммарные факторы инициации, получаемые при промывке рибосом 0,5 М КС2 / 103,116 / и осаждаемые при 25-40$ насыщения сульфата аммония /104 /. Эта фракция не активна в инициации трансляции не только мРНК из зараженных клеток, но и вообще кэпированных мРНК, в частности, мРНК вируса везикулярного стоматита (ВВС). При одновременном заражении клеток ВВС и вирусом полиомиелита подавляется размножение ВВС. Причиной этому служит избирательное угнетение трансляции кэпированных мРНК ВВС, причем кинетика подавления синтеза белков ВВС аналогична той, которая наблюдается при подавлении клеточной трансляции /64 /. Так же, как и в случае с клеточными мРНК, мРНК ВВС сохраняют нормальные размеры, поли(А) на 3 -конце, кэп - на 5 -конце, однако их связывание с рибосомами в суперинфицированных полиовирусом клетках нарушено / 69/. Препараты суммарных факторов инициации еІЕ из зараженных ВВС клеток эффективно стимулируют трансляцию мРНК ВВС и РНК полио-вируса в бесклеточной системе, но еЩ из зараженных полиовирусом клеток стимулируют трансляцию РНК полиовируса, но не трансляцию мРНК ВВС /33 /. Вследствие этого угнетение трансляции мРНК ВВС в клетках, суперинфицированных полиовирусом, служит удобной и адекватной моделью для изучения механизма подавления инициации клеточных мРНК.
На этой модели показано, что способность экстрактов из зараженных полиовирусом клеток Hela транслировать мРНК ВВС можно восстановить добавлением препарата фактора ЄІГ-4В, выделенного из ретикулоцитов /180/, то есть, можно было предполагать, что именно этот фактор инициации инактивируется в зараженных полиовирусом клетках /180/. Однако, при выделении факторов инициации непосредственно из зараженных клеток HeZa, наряду с некоторым снижением активности препарата фактора eIF-4B, наблюдалось преимущественное падение активности препаратов еЗТ-3 / Ю4/.
Как оказалось ясным в результате дальнейших исследований, нарушение активности препаратов этих факторов инициации явилось следствием инактивации кэп-связывающего белка, контаминирующего ЄІГ-4В и eIF-З. Процесс избирательного нарушения трансляции кэ-пированных матриц удалось смоделировать в бесклеточной системе, используя антитела против КСБ. Антитела, добавленные в бесклеточную систему из незараженных клеток, специфически блокировали трансляцию клеточных мРНК, не влияя на трансляцию пикорнавирус-ных РНК /202/. Траксель и соавторы наблюдали повышение уровня трансляции клеточных мРНК в экстрактах из зараженных клеток, добавляя в них препарат КСБ /219/.
Существенно, что механизм угнетения инициации трансляции клеточных матриц при полиовирусной инфекции не связан с прямым нарушением способности КСБ-І взаимодействовать с кэпированными мРНК, поскольку специфическое связывание КСБ-І с кэпом в составе мРНК после химической модификации мРНК периодатом (см. раздел 1.2) происходит одинаково эффективно во фракциях факторов инициации, выделенных из зараженных и контрольных клеток /96 /.
В клетках КСБ-І присутствует как в свободном виде, так и в составе более тяжелых комплексов с коэффициентом седиментации 8-Ю $ , содержащих кроме КСБ-І дополнительные полипептиды /214/. В зараженных клетках инактивируется только самый тяжелый комплекс, содержащий КСБ-І, но именно этот комплекс (КСБ-ІІ или ЄІГ-4Г) необходим для эффективной трансляции кэпированных мРНК /214/- eIF-4F эффективно стимулирует трансляцию мРНК глобина и других клеточных мРНК в экстрактах из зараженных полиовирусом клеток /90 , 201/. Инактивация eIF-4T при полиовирусной инфекции происходит, по-видимому, в результате протеолитического расщепления входящего в состав фактора полипептида с молекулярной массой 220000 / 75 /. В незараженных клетках КСБ-содернащий комплекс ассоциирован с фактором eIF-З, но в зараженных клетках эта ассоциация нарушается / 97 /. При этом другие факторы инициации, участвующие в связывании кэпированного конца мРНК -ЄІР-4В и ЄІГ-4А, а также факторы еГГ-2 и еІГ-3 при полиовирус-ной инфекции не отличаются по активности и структуре от соответствующих факторов, выделяемых из незараженных клеток / 65 /. Таким образом, имеются серьезные основания утверждать, что нарушение инициации трансляции клеточных мРНК при полиовирусной инфекции обусловлено в первую очередь инактивацией фактора инициации eIF-4 (КСБ-І и е1Г-4А-содержащего комплекса) в результате частичного протеолиза.
При заражении клеток вирусом ЭМК (система с кинетикой угнетения белкового синтеза 1-го типа / ИЗ/), в период избирательного подавления синтеза клеточных белков происходит изменение компартментализации КСБ,в результате которой нарушается его ассоциация с полисомами и с быстроседиментирующим комплексом белков, подобно тому, как это случается при полиовирусной инфекции. Однако, в этом случае высвобождающийся комплекс с КСБ сохраняет способность стимулировать трансляцию кэпирован-ных мРНК in viito /из /. Таким образом, можно предполагать, что избирательное подавление трансляции клеточных мРНК во всех системах "пикорнавирус-клетка" 1-го типа опосредовано нарушением нормального функционирования КСБ-содержащего комплекса (eIF-4F). Изменение функционального состояния фактора касается его воздействия с другими компонентами, участвующими в инициации, а в случае полиовирусной инфекции - инактивации самого еГР-4Г.
Выделение суммарных факторов инициации из клеток Кребс-2 и ретикулоцитов кролика
Для определения радиоактивности в кислотонерастворимой фракции из инкубируемой суспензии меченых клеток отбирали аликвоты объемом 0,1 мл, добавляли 3 мл Ю$-ной ТХУ с 0,1#-ным гидролизатом казеина, прогревали в течение 10 мин в кипящей водяной бане и пропускали через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 2,5 мкм (Сынпор, ЧССР). Фильтры промывали трижды 5 -ной ТХУ с 0,1%-ЕШЧ гидролизатом казеина, дважды - этанолом и высушивали.
Для определения включения радиоактивного метионина в кис-лоторастворимую фракцию клетки преинкубировали в течение 5 мин при 37 со 100 мкг/мл ДШ и метили в течение 20 мин 3Н-метиони-ном. Аликвоты объемом 0,2 мл разбавляли 10 мл холодной среды Игла, клетки трижды отмывали центрифугированием при 1000 об/мин, 4, в течение 5 мин, суспендировали в 0,5 мл Н20 и осаждали кислотонерастворшлый материал добавлением равного объема 10%-ной ТХУ при 0. После выдерживания во льду в течение 2 час осадок удаляли центрифугированием, 0,5 мл надосадочной жидкости нейтрализовали Трисом до рН 5 и просчитывали радиоактивность.
Для просчета радиоактивности в осадках на фильтрах использовали толуольный сцинтиллятор ЖС-І06, для просчета радиоактивности в жидкости применяли сцинтиллятор ЖС-8 с добавлением Ю -ного этанола. Использовали жидкостные сцинтиллящ онные счетчики типа "Марк II" (США) и 1210-пУльтробета (ЛКБ, Швеция).
Очистку вируса проводили по методу /120/. Вирус-содержа-щую суспензию лизированных клеток осветляли центрифугированием при 10000 в течение 10 мин, 4. Основную массу балластного белка из надосадочной жидкости удаляли осаждением с помощью протаминсульфата. Для этого готовили непосредственно перед употреблением раствор (50 мг/мл) протаминсульфата, нейтрализо-вали до рН 7,6 Трисом и слегка подогревали до исчезновения молочно-белой опалесценции. Нейтрализованный раствор протаминсульфата добавляли по каплям при постоянном перемешивании к вирус-содержащей надосадочной жидкости до концентрации протаминсульфата 2 мг/мл. Суспензию охлаждали в течение 30 мин в ледяной бане и удаляли выпавший осадок центрифугированием при 10000g в течение 10 мин, 4. К супернатанту добавляли 30%-ный (вес/объем) водный раствор полиэтиленгликоля 6000 до конечной концентрации Ъ%. После 30 мин выдерживания в ледяной бане вы-павший осадок собирали центрифугированием в прежнем режиме. Осадок растворяли при комнатной температуре в буфере JS 5 из расчета 3 мл буфера на 100 мл исходной вирус-содержащей суспен-зии. К раствору добавляли 30 -ный раствор полиэтиленгликоля 6000 до конечной концентрации 5%. Суспензию выдерживали в течение 60 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 150009 в течение 10 мин при 18. Осадок суспендировали в буфере № 6, тщательно диспергировали в гомогенизаторе Даунса и добавляли ДСН до 1%. Для депротеинизации добавляли равный объем насыщенного буфером № 6 свежеперегнанного фенола и интенсивно встряхивали эмульсию при комнатной температуре в течение 5 мин. Охлажденную во льду эмульсию расслаивали центрифугированием при 3000 ? в течение 10 глин. Отбирали водную фазу и повторяли экстракцию фенолом. Водную фазу после второй депротеинизации отбирали, добавляли аС1 до 100 мМ и 3 объема перегнанного этанола. Выпавший осадок РНК выдерживали в течение ночи при -20 и собирали центрифугированием при 3000д в течение 30 мин. РНК растворяли в 100 мМ #аС1 и переосаждали этанолом. Процедуру переосаждения РНК повторяли дважды. Осадок РНК после последнего переосаждения этанолом собирали центрифугированием в прежнем режиме, высушивали под вакуумом до исчезновения запаха спирта и растворяли в воде. Окончательную очистку РНК проводили с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. С этой целью 0,2 мл раствора РНК наносили на линейный градиент 5-20%-ной сахарозы в буфере ЇЬ Б, приготовленном диффузионным способом / 207/, и центрифугировали при 50000 об/мин в течение 1,5 часа в роторе Ті 50 {Reckman) при 18. Собирали фракции, содержавшие пик 35$ РНК, и осаждали РНК 3 объемами этанола при -20. Осадок РНК собирали центрифугированием, промывали 70%-ным этанолом, высушивали до исчезновения запаха спирта и растворяли в воде. Раствор РНК хранили замороженным в виде аликвот при -60?
Клетки отмывали холодным раствором Эрла и дважды холодным буфером № I. Осадок клеток суспендировали в 10 объемах холодного буфера Ш I, добавляли Ю$-ный Тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1%, энергично перемешивали и немедленно центрифугировали лизат при 100009 в течение 10 мин, 4. Надосадочную жидкость отсасывали, добавляли к ней 1,0 М Трис-HCI (рН 9,0) до концентрации 0,1 М, Ю$-ный ДСН до конечной концентрации 0,152 и ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ, приливали равный объем водонасыщенного свежеперегнанного фенола. После интенсивного встряхивания в течение 30 мин эмульсию охлаждали в смеси льда с Л аСІ и расслаивали центрифугированием в течение 20 мин при 100009 .Водную фазу отсасывали и подвергали повторной двухкратной депротеинизации. РНК из водной фазы осаждали 3 объемами охлажденного до -20 этанола и оставляли на ночь при -20. Осадок РНК собирали центрифугированием при 3000 в течение 30 мин и дважды промывали 70%-явм этанолом с 50 мМ ЖаСІ в том же режиме.
Изучение активности факторов инициации, участвующих в образовании преинициаторного комплекса
Как уже отмечалось в разделе 2.4 , ряд косвенных данных свидетельствовал о том, что в клетках Кребс-2, зараженных вирусом ЭЖ, основным механизмом, приводящим к выключению клеточной трансляции, является не инактивация фактора инициации,, необходимого для трансляции мРНК клетки-хозяина, а конкуренция ме/кду вирусными и клеточными мРНК.
Мы провели прямые опыты по определению активности суммарных факторов инициации (elF ), выделенных из зараженных вирусом ЭЖ клеток. В качестве тест-системы использовали обработанную Са-зависимой нуклеазой фракцию 5зо из клеток Кребс-2, программируемую насыщающими количествами вирусных или клеточных мРНК.
На рис. 13 представлены данные по влиянию еВ? , выделенных из зараженных клеток через 4 часа после начала инфекции, на трансляцию поли(А)-содержащих РНК из клеток Крёбс-2 и РНК ЭЖ. Видно, что препараты elFg из незараженных и зараженных клеток одинаково эффективно стимулируют трансляцию клеточных мРНК и одинаково, но несколько менее эффективно - трансляцию РНК вируса эмк.
В аналогичных условиях elEg , выделенные из клеток, зараженных полиовирусом, не способны стимулировать трансляцию клеточных мРНК /133 , 104/ и стимулируют только трансляцию вирусных РНК. Следовательно, в отличие от клеток, зараженных полио-вирусом, в клетках Кребс-2, зараженных вирусом ЭМК, не происходит инактивации факторов (или фактора) инициации, необходимого для трансляции клеточных мРНК. Во всяком случае этот вывод справедлив в отношении факторов инициации, лжштирующих трансляцию в бесклеточной системе. Однако нельзя было исключить, что в клетках происходит такая модификация одного или нескольких факторов, которая увеличивает их сродство к вирусной РНК в условиях конкуренции с клеточными матрицами.
В связи с этим мы сравнивали способность elFg из зараженных и незараженных клеток поддерживать трансляцию клеточных мРНК в условиях конкуренции с вирусными РНК. Полученные результаты представлены на рис. 14. Для того, чтобы избежать значительного перекрывания клеточных и вирусных продуктов трансляции на электрофореграмме, трансляцию проводили в условиях, ингиби-рующих разрезание высокомолекулярного предшественника капсид-ных белков вируса ЭМК (отсутствие ДТТ, 85 мМ KCI, 60 мин при 30). Вирус-специфические белки в этих условиях представлены главным образом полипептидом пре(Д) с молекулярной массой II2000. В меньших количествах образуется полипептид с молекулярной массой 100000 и полипептиды с более низкой молекулярной массой, по-видимому, недостроенные молекулы преА (рис. 14 б). Продукты трансляции клеточных мРНК гетерогенны по размеру, однако основная их часть мигрирует в области 20-50 кД (рис. 14 а), которая в значительной мере свободна от вирус-специфических продуктов трансляции. Поэтому можно раздельно оценить долю вирусных и клеточных белков среди продуктов совместной трансляции матриц. При совместной трансляции РНК обоих типов синтезируются почти исключительно вирус-специфические продукты (рис. 14 в). Это явление, обнаруженное ранее в нескольких лабораторріях / 7 ,132/, свидетельствует о конкурентном вытеснении клеточных матриц вирусными РНК. Конкурентное подавление трансляции клеточных мРНК наблюдается как в бесклеточной системе, содержащей вдтоплазматический экстракт из незараженных клеток, так и в бесклеточной системе, приготовленной из высокоочищенных когшонентов белок-синтезирующего аппарата /86 /. При внесении в бесклеточную систему препаратов еГЕ1 из клеток Кребс-2 восстанавливается трансляция клеточных мРНК (рис. 14 г)-. При этом ослабление конкуренции между вирусными и клеточными мРНК, при добавлении факторов из зараженных и незараженных клеток происходит одинаково эффективно (рис. 14 г,д).
Однако в присутствии факторов инициации из зараженных клеток меняется спектр вирус-специфических продуктов: исчезает полипептид преА и значительно возрастает количество полипептида А (рис. 14 е). Ранее было показано, что переход преА в А осуществляется под действием вирус-специфической протеазы, накапливающейся в зараженных клетках и в бесклеточной системе при трансляции РНК вируса ЗЖ / 87/. Из представленных данных можно сделать вывод, что протеаза ассоциирована с рибосомами зараженных клеток и при промывке их 0,5 М КСІ переходит во фракцию суммарных факторов инициации. Поскольку в наших условиях протеолиз ограничен переходом преА в А с образованием коротких полипептидов рІ2-рІ4 кД, можно утверждать, что продукты совместной трансляции, мигрирующие в области 20-50 кД, являются в основном клеточными. На основе оценки уровня их синтеза был сделан вывод об отсутстврш инактивации и функциональной модификации факторов инициации, ответственных за конкуренцию клеточных и вирусных мРНК. Этот вывод был подтвержден при изучении конкуренции индивидуальных мРНК: мРНК глобина мыши и РНК ЭМК (рис. 15). В присутствии РНК ЭМК происходит практически полное подавление трансляции глобиновои мРНК, а добавление факторов инициации из зараженных и незараженных клеток одинаково эффективно ослабляет конкуренцию и восстанавливает трансляцию глобиновои мРНК (рис. 15, 16).
Таким образом, показано, что в клетках Кребс-2, зараженных вирусом ЭМК, не происходит такой модификации факторов инициации, которая могла бы приводить к повышению относительной эффективности трансляции РНК вируса ЭМК в условиях конкуренции с клеточными мРНК.
Полученные данные подтверждают, что основой избирательного подавления синтеза клеточных белков при заражении клеток Кребс-2 вирусом ЭМК является конкуренция вирусных и клеточных мРНК. Эта конкуренция происходит за функционально не модифицированный фактор (факторы) инициации.
