Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
I. Мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) 7
1. История открытия и номенклатура семейства Y-бокс-связывающих белков 7
2. Свойства и структурно-функциональная организация Y-бокс-связывающих белков 9
2.1. Общие свойства Y-бокс-связывающих белков 9
2.2. Свойства Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1) 11
2.2.1. Взаимодействие YB-1 с белками 12
2.2.2. Особенности взаимодействия YB-1 с ДНК и РНК 12
3. Функции YB-1 в ядре 14
3.1. Участие YB-1 в транскрипции 14
3.2. Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК 16
3.3. Участие YB-1 в сплайсинге мРНК 16
4. Функции YB-1 в цитоплазме 17
5. Перераспределение YB-1 между ядром и цитоплазмой 21
6. Участие YB-1 в эмбриональном развитии 23
7. YB-1 и раковая трансформация клеток 24
8. Структура гена YB-1 и регуляция его экспрессии 26
II. Роль 3' НТО мРНК в регуляции трансляции 27
1. Регуляция с участием белков, взаимодействующих с 3' НТО 29
2. Регуляция трансляции микрорегуляторными РНК, специфически связывающимися с 3' НТО 39
Материалы и методы 44
1. Использованные в работе плазмиды. Получение конструкций, содержащих ген YB-1 с мутациями в регуляторной последовательности 44
2. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК 46
3. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli 46
4. Обработка плазмиды рестриктазой 47
5. Лигирование Т4-ДНК-лигазой 48
6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 48
8. Выделение рекомбинантного РАВР 51
9. Выделение рекомбинантного YB-1 52
10. Бесклеточная система трансляции (БСТ) из ретикулоцитов кролика 53
11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 53
12. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы 54
13. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины 54
14. Метод замедления подвижности РНК-белковых комплексов в геле (Gel-shift assay) 55
15. РНК-белковые сшивки под действием ультрафиолетового облучения 55
16. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы 56
17. Получение суммарной РНК из лизата ретикулоцитов кролика 56
18. Получение меченого фрагмента кДНК (ДНК-зонда) 56
19. Детекция мРНК YB-1 при помощи радиоактивного зонда (Northern-dot анализ) .56
20. Дефосфрилирование фрагмента РНК 57
21. Мечение фрагмента РНК по 5' концу 58
22. Картирование сайтов связывания белков с фрагментом РНК 58
23.БиотинилированиеРНК 59
24. Выделение белков лизата ретикулоцитов кролика с использованием биотинилированной РНК 60
25. Иммунологический анализ белковых препаратов (иммуноблоттинг) 60
РЕЗУЛЬТАТЫ 62
1. YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК на стадии инициации, подавляя присоединение к мРНК 43S преинициаторного комплекса 62
2. РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, стимулируя присоединение к мРНК 43S преинициаторного комплекса 64
3. Локализация сайтов связывания YB-1 и РАВР в регуляторной . последовательности мРНК YB-1 методом футпринтинга 66
4. Подтверждение специфичности взаимодействия YB-1 и РАВР с сайтами их связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1, идентифицированными методом футпринтинга 68
5. РАВР и YB-1 способны вытеснять друг друга из комплекса с регуляторной последовательностью мРНК YB-1 71
6. Влияние мутаций в YB-1- и РАВР-связывающих сайтах мРНК YB-1 на её трансляцию 73
7. РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1 74
8. Влияние полиаденилирования на трансляцию мРНК YB-1 75
Обсуждение 78
1. Регуляция трансляции мРНК YB-1 и её место в общей регуляции белкового синтеза 78
2. Возможные механизмы влияния YB-1 и РАВР на трансляцию мРНК YB-1 79
3. Специфическое взаимодействие YB-1 с РНК 81
4. Негативный эффект полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляцию как новый способ регуляции синтеза YB-1 82
Выводы 84
Список литературы 85
- Свойства и структурно-функциональная организация Y-бокс-связывающих белков
- Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК
- Обработка плазмиды рестриктазой
- Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
Введение к работе
Мультифункциональный ядерно-цитоплазматический Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) входит в обширную группу белков, содержащих домен холодового шока. Этот ДНК- и РНК-связывающий белок участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей приводит к серьезным нарушениям эмбрионального развития и к ранней (пренатальной) гибели животных. YB-1 обладает онкогенной и антионкогенной активностью, повышает устойчивость клеток к ксенобиотикам и ионизирующей радиации и является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости.
Участие YB-1 в широком спектре внутриклеточных процессов объясняется, прежде всего, его почти уникальной способностью взаимодействовать как с ДНК, так и с РНК, а также со многими клеточными белками. В ядре он участвует в регуляции транскрипции многих генов, вовлечен в процессы репликации и репарации ДНК, а также сплайсинга пре-мРНК. В цитоплазме YB-1 упаковывает мРНК в мРНП, стабилизирует мРНК и регулирует их трансляцию.
Характер действия YB-1 на клеточные процессы зависит от его содержания в клетке и от его распределения между ядром и цитоплазмой. YB-1 может переходить в клеточное ядро под действием ксенобиотиков, повреждающих ДНК, и ультрафиолетового облучения, а также в определённый период митотического цикла или при активации некоторых сигнальных путей клетки. Содержание YB-1 в клетке зависит от скорости его синтеза и распада, а скорость синтеза определяется как эффективностью транскрипции гена YB-I, так и эффективностью трансляции его мРНК.
Ранее в нашей лаборатории было установлено, что регуляция синтеза YB-1 осуществляется при участии ~ 80-нуклеотидной регуляторной последовательности, находящейся в 3' нетранслируемой области (3' НТО) мРНК YB-1. С этой последовательностью специфически взаимодействуют два мажорных белка цитоплазматических мРНП - сам YB-1 и поли(А)-связывающий белок (poly(A)-binding protein, РАВР). Было выяснено, что РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 даже в отсутствие 3'-концевой поли(А)-последовательности у мРНК (Skabkina et al, 2003), a YB-1 её избирательно ингибирует при относительно
низких концентрациях, которые оптимальны для трансляции других клеточных мРНК (Скабкина и др., 2004).
Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению молекулярных механизмов, регулирующих трансляцию мРНК YB-1. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) определить стадию трансляции, на которой YB-1 ингибирует, а РАВР стимулирует синтез YB-1; 2) локализовать сайты специфического связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1; 3) установить, конкурируют или не конкурируют белки YB-1 и РАВР за места своего специфического связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1; 4) исследовать влияние 3'-концевого полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляционную активность в бесклеточной системе белкового синтеза.
Свойства и структурно-функциональная организация Y-бокс-связывающих белков
Белок YB-1 принадлежит семейству Y-бокс-связывающих белков. Первичные структуры белков этого семейства были определены при идентификации факторов, специфически связывающихся с так называемыми Y-бокс мотивами, содержащимися в промоторных участках генов главного комплекса гистосовместимости класса II (Major Histocompatibility Complex II, МНС II) (Didier et al., 1988). Именно поэтому появился термин «Y-бокс-связывающие белки» (Y-box binding proteins). Практически в то же время было обнаружено, что с энхансерной областью гена, кодирующего рецептор эпидермального фактора роста человека, связываются два белка, названных dbpB (DNA-binding protein В) и dbpA ( DNA-binding protein A) (Sakura et al., 1988). Оказалось, что dbpB полностью идентичен YB-1, a dbpA гомологичен примерно на 46%. Позднее анализ аминокислотных последовательностей мажорных белков цитоплазматических мРНП шпорцевой лягушки Xenopus laevis (Murray et al., 1992), мыши (Tafuri et al., 1993) и кролика (Evdokimova et al., 1995) показал их высокую гомологию белку YB-1. Оказалось также, что некоторые свойства белков этого семейства были описаны ранее при изучении компонентов мРНП из ретикулоцитов млекопитающих (Blobel, 1972), птиц (Morel et al., 1973; Morel et al., 1971), ооцитов амфибий (Darnbrough and Ford, 1981) и различных типов эукариотических клеток (см. обзор Скабкин и др., 2004).
К настоящему времени определены аминокислотные последовательности и выяснены функции около двух десятков Y-бокс-связывающих белков. Хотя многие из них имеют собственные названия, все они могут быть разделены на три подсемейства (Таблица 1).
В первое подсемейство - YB-1 - входят собственно белок YB-1 человека (см. другие названия в Таблице 1), белок р50 кролика, chkYB-1 курицы, EF-1A быка, FRGY-1 из X. laevis, MSY-1 мыши и некоторые другие. Эти белки, как правило, специфичны для соматических клеток и выполняют самые разнообразные функции. Они наиболее изучены, и именно им будет посвящена большая часть первого раздела главы «Обзор литературы». Таблица 1. Y-бокс-связывающие белки YB-1 YB-2 YB-3 Homo sapiens YB-1 (Y-box binding protein 1) -Y-бокс-связывающий белок 1;NSEBP 1 (Nucleasesensitive element bindingprotein 1);EFI-A (Enhancer factor Isubunit A);dbpB (DNA-bindingprotein B) YB-2 (Y-box binding protein 2,Germ cell-specific Y-box binding protein) - Y-бокс-связывающий белок 2;Contrin;dbpC(DNA-binding protein C) dbpA (DNA-binding protein A);csdA (Cold shock domain protein A); (Single-strand DNA binding protein NF-GMB).
Mus mus cuius MSY-1 (mouse Y-boxprotein 1);dbpB MSY-2 (mouse Y-box protein 2) MSY-3/4 (mouse Y-box protein 3/4); dbpA; csdA .
Rattus norvegicus RYB-a (Rat Y-boxbinding protein-a);YB-1 Oryctolagus cuniculus p50; YB-1 Bos taurus EFI-A; YB-1 Gallus gallus Chk-YB-l(chicken Y-box protein 1) Chk-YB-2(chicken Y-box protein 2) Xenopus laevis FRGY-1 (frog Y-box protein 1) FRGY-2(frog Y-box protein 2); p54/p56; mRNP4 YB-3 Danio rerio YB-1 Chironomus teutons Ct-p50/p40 Drosophila melanogaster Yps, Y-box binding protein Ко второму подсемейству - YB-2 - относятся белки FR.GY2 (р54/р56) из X. laevis, MSY2 мыши. Белки этого подсемейства у человека получили несколько названий: YB-2, dbpC, contrin. Характерная особенность этих белков состоит в том, что они специфичны для половых клеток. И наконец, в подсемейство YB-3 входят белки dbpA (csdA) человека, MSY-3 мыши, FRGY-3 X laevis. Считается, что белки этого подсемейства синтезируются в период эмбрионального развития и к моменту рождения исчезают (Lu et al., 2006), однако мРНК YB-3 может детектироваться в некоторых тканях взрослого организма (Mastrangelo and Kleene, 2000). По аминокислотной последовательности белки Ct-p50/p40 Chironomus tentans и Yps Drosophila melanogaster трудно отнести к какому-либо подсемейству Y-бокс-связывающих белков, так как их сходство с белками подсемейств YB-1, YB-2 и YB-3 ограничивается только высокой гомологией доменов холодового шока и особенностями строения С-концевого домена.
1 Важно отметить, что семейство Y-бокс-связывающих белков относится к более обширной группе белков, содержащих домен холодового шока. Другие представители этой группы могут состоять из одного (бактериальные белки CspA, CspB, CspE, CspD) или из нескольких (белок UNR (Upstream of N-Ras) млекопитающих) доменов холодового шока, иметь, помимо CSD, дополнительные домены и структурные особенности, такие как zink finger domain (белок lin-28 С. elegans) или глицин-богатые (Gly-rich) последовательности (белок lin-28 С. elegans, белок RBP16 Trypanosoma brucei, белок GRP2 Arabidopsis thaliana). Сравнение аминокислотных последовательностей белков разных подсемейств показало, что их домены холодового шока идентичны более чем на 90% (Рис. 1Б). В остальной части первичной структуры заметной гомологии не наблюдается, но при этом чередование кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков в С-концевом домене и преобладание аланина и пролина в N-концевом домене сохраняется.
Внутри подсемейств гомология довольно высокая. Например, белок YB-1 человека на 96% идентичен белку MSY-1 мыши, на 80% белку FRGY-1 X. laevis и на 67% белку YB-1 Danio rerio.
CSD Y-бокс-связывающих белков млекопитающих на 43% идентичен белку холодового шока CspA Е. coli (Goldstein et al., 1990). Структура CspA была расшифрована методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) относительно давно (Newkirk et al., 1994; Schindelin et al., 1994), но только спустя почти десять лет методом ЯМР была установлена структура CSD YB-1 человека (Kloks et al., 2002). Пространственные структуры CSD и CspA очень сходны, как можно было предположить, исходя из высокой гомологии этих белков. Домен состоит из пяти (3-тяжей, уложенных антипараллельно в (3-баррель, на торцах которого располагаются петли, соединяющие (5-тяжи. CSD содержит так называемые консенсусные последовательности РНП-1 (K/N-G-F/Y-G-F-I/V) и РНП-2 (V-F-V-H-F) (Landsman, 1992), благодаря которым он способен специфично и неспецифично связывать ДНК (Tafari and Wolffe, 1992) и РНК (Bouvet et al., 1995; Ladomery and Sommerville, 1994). Стоит отметить, что существуют данные, согласно которым домен холодового шока в Y-бокс-связывающих белках является довольно нестабильным, и при комнатной температуре около 30% молекул белка находятся в неупорядоченном состоянии (С.Г. Гурьянов и В.В. Филимонов, личное сообщение).
Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК
Было обнаружено, что YB-1 может присоединяться к транскрипционному комплексу за счёт взаимодействия с протоонкобелком TLS (Chansky et al., 2001; Rapp et al., 2002). TLS находится в транскрипционном комплексе и обеспечивает сопряжение процессов транскрипции и сплайсинга путем одновременного взаимодействия с РНК-полимеразой II и факторами сплайсинга. Привлекая белок YB-1 в этот комплекс, TLS способствует его вовлечению в последующий сплайсинг мРНК. Кроме того, было показано участие YB-1 в регуляции альтернативного сплайсинга in vivo. YB-1 может специфически связываться с АСЕ-последовательностями (A/C-rich exon enhancers) в альтернативном экзоне (v4) гена CD44, способствуя вырезанию этого экзона (Stickeler et al., 2001). В других исследованиях было выяснено, что YB-1 взаимодействует с белками SRrp86 (Li et al., 2003) и SRp30c (Raffetseder et al., 2003), участвующими в альтернативном сплайсинге пре-мРНК, что свидетельствует о возможном участии YB-1 в выборе альтернативного сайта сплайсинга.
Стоит также отметить, что с развитием новых методов идентификации белков, в частности масс-спектрометрии, стало возможным определить белковый состав многокомпонентных комплексов, осуществляющих сплайсинг пре-мРНК, -сплайсосом. Среди белков, входящих в состав сплайсосомы, был обнаружен и YB-1 (Deckert et al., 2006; Hartmuth et al., 2002). Какую функцию выполняет YB-1 в сплайсосоме ещё не выяснено, но можно предположить, что она связана со способностью YB-1 изменять структуру нуклеиновых кислот.
Основными функциями YB-1 в цитоплазме являются стабилизация мРНК и регуляция её трансляции, а таюке упаковка мРНК в мРНП. Важно отметить, что перечисленные функции YB-1 взаимосвязаны и практичесіш неотделимы друг от друга.
YB-1 и его гомологи являются универсальными коровыми белками цитоплазматических мРНП. Поэтому эти белки рассматривались как наиболее подходящие кандидаты на роль основных структурных белков мРНП (Evdokimova et al., 1998). Исследование комплексов YB-1 и мРНК показали, что одного этого белка достаточно для образования частиц, полностью соответствующих по плавучей плотности и коэффициенту седиментации природным мРНП (Skabkin et al., 2004). Анализ содержания YB-1 в природных мРНП показал, что полирибосомные мРНП содержат в два раза меньшее количество YB-1 на моль мРНК, чем свободные мРНП (Davydova et al., 1997; Minich and Ovchinnikov, 1992). При относительно низком соотношении YB-1/мРНК, характерном для полисомных транслируемых мРНП, YB-1 связан с мРНК в виде мономеров обоими РНК-связывающими доменами — CSD и С-доменом. Это приводит к разворачиванию мРНП, что, возможно, делает содержащуюся в них мРНК доступной для взаимодействия с различными белками, с другими РНК, а также с рибосомными субчастицами. При высоком соотношении YB-1/мРНК, характерном для свободных нетранс л ируемых мРНП, молекулы YB-1 взаимодействуют с мРНК только посредством CSD, а С-домены вытесняются с мРНК, тем самым способствуя олигомеризации YB-1 и формированию крупного мультимерного комплекса, состоящего примерно из 15-18 молекул белка. Такие мультимеры имеют диаметр примерно 20 нм, высоту - 7 нм и упаковывают на своей поверхности отрезок мРНК длиной около 600-700 н. В таком комплексе мРНК, вероятно, становится недоступной для взаимодействия с белками аппарата инициации трансляции и экзонуклеазами (Skabkin et al., 2004). Таким образом, упаковывая мРНК, YB-1 может влиять на её трансляционный статус и время жизни в клетке. При этом влияние на трансляцию может быть как позитивным, так и негативным, в зависимости от соотношения YB-1/мРНК.
Более детальные исследования влияния YB-1 на трансляцию показали, что повышение соотношения YB-1/мРНК в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика или зародышей пшеницы приводит к сильному ингибированию инициации трансляции (Evdokimova et al., 1998; Minich and Ovchinnikov, 1992). Предполагается, что подавление белком YB-1 инициации трансляции обусловлено вытеснением фактора eIF4G С-концевым доменом YB-1 (Nekrasov et al., 2003). Репрессорная роль YB-1 в процессе белкового синтеза была подтверждена также в экспериментах in vivo. Увеличение содержания YB-1 в COS-1 клетках в 2-3 раза приводит к существенному подавлению синтеза белка с репортерного гена (Davydova et al., 1997).
Многие данные указывают на то, что YB-1 может стимулировать инициацию трансляции. Во-первых, YB-1 восстанавливает трансляцию в бесклеточных системах, подавленную избытком мРНК, что говорит о том, что оптимальная трансляция мРНК достигается при определённом соотношении YB-1/мРНК (Minich and Ovchinnikov, 1992). Во-вторых, удаление YB-1 из ретикулоцитных лизатов приводит к инактивации трансляции на стадии инициации и накоплению мРНК в виде 48S преинициаторных комплексов (Evdokimova et al., 1998). Добавление YB-1 восстанавливает трансляцию в таких системах. Кроме того, в модельной системе из очищенных компонентов аппарата трансляции с ограниченным количеством факторов инициации YB-1 многократно стимулировал образование 48S преинициаторного комплекса на инициирующем кодоне (3-глобиновой мРНК (Pisarev et al., 2002).
Обработка плазмиды рестриктазой
К лизату ретикулоцитов кролика добавляли четыре объёма буфера для депротеинизации: 500 мМ Трис-HCl (рЫ 9,0), 500 мМ NaCl, 5 % SDS, и тщательно перемешивали. К образцам добавляли равный объём смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (в соотношении 25/24/1), перемешивали и центрифугировали при 12000 g в течение 5 мин, после чего отбирали верхнюю водную фазу. Эту процедуру повторяли со смесью хлороформ/изоамиловый спирт (в соотношении 24/1). К водной фазе добавляли ацетат натрия (рН 5,2) до конечной концентрации 0,3 М и 3 объёма 96 % этанола и инкубировали в течение 2 часов при -70С. РНК осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, промывали 3 раза 70 % этанолом и растворяли в требуемом объёме Н20.
Фрагмент кДНК YB-1 длиной 1054 п.о. получали рестрикцией плазмиды pBluescript II SK YB-1 по сайтам EcoRl. Фрагмент метили [a-32P]dATP (400 МБк/мл, 148 ТБк/моль, ИБХ, г. Москва, Россия) с использованием Multiprime DNA labelling system (GE Healthcare, США) согласно рекомендациям фирмы. Затем зонд пропускали через Nick-Column (Sephadex G-50, GE Healthcare, США) для удаления моно- и олигонуклеотидов.
Бесклеточную систему трансляции на экзогенной мРНК объёмом 15 мкл центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы и фракционировали, как описано в п. 16. Затем из каждой фракции выделяли суммарную РНК (см. п. 17.) Для денатурации РНК к одному объёму образца добавляли три объёма раствора: 2,2 М формальдегид, 50% формамид, lx MOPS (40 мМ MOPS (рН 7,0), 10 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА), и инкубировали при 65С в течение 15 мин. Затем быстро охлаждали до 4С и добавляли два объёма охлаждённого буфера 20х SSC (3 М NaCl, 300 мМ Na-цитрат). Образцы после денатурации РНК фильтровали через нейлоновую мембрану Hybond N (GE Healthcare, США) при помощи прибора Bio-dot (Bio-Rad, США). Высушенную мембрану облучали ультрафиолетовым светом (254 нм). Доза облучения составляла 0,15 J/CM .
Мембрану, для блокирования неспецифического связывания ДНК-зонда, инкубировали при 45С в течение 2,5 часов в буфере следующего состава: 5х SSC, 5х Denhardt s reagent (фиколл 0,1%; поливинилпирролидон 0,1%; BSA 0,1%), 50% формамид, 1% SDS, 100 мкг/мл суммарной РНК Е. coli (1 мл буфера на 10 см мембраны). Гибридизацию с [ Р]-меченным ДНК-зондом (удельная активность 5х108 имп/мин/мкг) (см. п. 18) проводили в таком же буфере в течение 13-15 часов при 45С.
После гибридизации мембрану отмывали следующим образом: в 2х SSC с 0,1% SDS 2 раза по 5 мин при 24С, затем в 0,2х SSC с 0,1% SDS 2 раза по 5 мин при 24С и, наконец, в 0,2х SSC с 0,1% SDS 2 раза по 15 мин при 42С. Мембрану высушивали и экспонировали либо с рентгеновской плёнкой в течение 16-18 часов при -70С, либо с интенсифицирующим экраном (тип MS) и детектировали с помощью авторадиографической электронной фосфорной системы «Циклон» (CycloneStoragePhosphorSystem, Packard Instrument Company Inc.). Относительное количество радиоактивности определяли с помощью программы OptiQuant (ver. 03.00).
Фрагмент РНК (10 мкг) инкубировали в буфере: 50 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 0,1 мМ ЭДТА, в присутствии 4 ед. щелочной фосфатазы (Fermentas, Литва) при 50С в течение 30 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 65С в течение 10 мин. Затем добавляли равный объём смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25/24/1), перемешивали и центрифугировали при 12000 g в течение 5 мин, после чего отбирали верхнюю водную фазу. Эту процедуру повторяли со смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24/1). К водной фазе добавляли ацетат натрия (рН 5,2) до конечной концентрации 0,3 М и 3 объёма 96% этанола и инкубировали в течение 2 часов при -70С. РНК осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, промывали 3 раза 70% этанолом и растворяли в требуемом объёме Н20.
Дефосфорилированный фрагмент РНК инкубировали в присутствии у-[32Р]АТР (400 МБк/мл, 148 ТБк/моль, ИБХ, г. Москва, Россия) и Т4-полинуклеотидкиназы (Fermentas, Литва) 30 мин при 37С согласно рекомендациям фирмы. В реакционную смесь добавляли мочевину до концентрации 7 М, наносили на 3,8 % ПААГ гель с 7 М мочевиной и проводили электрофорез как описано в п. 13. Затем вырезали кусочек геля с фрагментом РНК нужной длины и экстрагировали РНК из геля буфером: 100 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 500 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0,1 % додецилсульфат лития. РНК осаждали 3 объёмами 96% этанола в течение 2 часов при -70С. Осадок РНК собирали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, промывали 3 раза 70% этанолом и растворяли в требуемом объёме Н20. 5 -[32Р]-меченный фрагмент РНК (20000 имп/мин) инкубировали с исследуемым белком или без него при 30С в течение 15 мин в 10 мкл реакционной смеси: 10 мМ HEPES-KOH (рН 7,6), 100 мМ КС1, 0,15 мкг/мкл тРНК.
А. В случае ферментативного щеплення РНК по гуаниловым остаткам добавляли 0,25 ед. РНКазы ТІ (Fermentas, Литва) и инкубировали 10 мин при 30С. Пробы подвергали фенольной депротеинизации, и РНК осаждали этанолом. Осадок РНК растворяли в 8 М растворе мочевины и анализировали электрофорезом в 12% ПААГ с 8 М мочевиной с последующей радиоавтографией.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
В данной работе мы показали, что YB-1 сохраняет свою способность избирательно ингибировать трансляцию мРНК YB-1, из которой удален РАВР-связывающий сайт (Рис. 24, дорожки 2, 3). При этом РАВР не способен восстанавливать трансляцию такой мРНК, подавленную белком YB-1 (Рис. 24, дорожки 4-6). Этот результат согласуется с предположением о прямом негативном действии YB-1 на инициацию трансляции. Пока не ясно, каким образом YB-1, находясь на 3 НТО, подавляет инициацию трансляции мРНК YB-1 на 5 конце молекулы мРНК. Можно думать, что этому способствует сближение регуляторной последовательности в 3 НТО с 5 концом молекулы мРНК. Такое сближение могло бы возникнуть либо в силу структурных особенностей самой мРНК YB-1, либо за счёт взаимодействия белков, локализованных на 5 и 3 НТО мРНК (некоторые примеры такого взаимодействия приведены в литературном обзоре). Можно предположить, что такое сближение могло бы достигаться в результате взаимодействия YB-1, ассоциированного с регуляторной последовательностью в 3 НТО, с YB-1, специфически связанным с нуклеотидной последовательностью в 5 НТО. Специфическое взаимодействие YB-1 с 5 НТО мРНК YB-1 недавно было показано японской группой исследователей (Fukuda et al., 2004). В этой работе было продемонстрировано избирательное ингибирование трансляции репортерной мРНК с 5 НТО мРНК YB-1 под действием белка YB-1. Однако наши эксперименты (данные не приводятся) показывают, что, несмотря на специфическое связывание YB-1 с 5 НТО мРНК YB-1, после удаления 5 НТО трансляция мРНК YB-1 оставалась столь же чувствительной к добавлению YB-1 в БСТ, как и трансляция мРНК дикого типа. Это исключает циклизацию мРНК YB-1 через взаимодействие молекул YB-1, специфически связанных с 5 и 3 НТО, как непременное условие ингибирования трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1.
Расшифровка механизма избирательного ингибирования инициации трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1, так же как и окончательный выбор из трех выше представленных альтернативных механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1 под действием двух мажорных белков мРНП, требует проведения дополнительных экспериментов.
Вполне вероятно, что, помимо YB-1 и РАВР, в регуляции трансляции мРНК YB-1 участвует ряд других белков, специфически взаимодействующих с 5 и 3 НТО этой мРНК. Такие белки уже обнаружены, и их функции ещё предстоит выяснить.
Данная работа затрагивает важную проблему специфического взаимодействия YB-1 с РНК. Как было отмечено в главе «Обзор литературы», многие из функций YB-1 обусловлены его высоким неспецифическим сродством к РНК. Тем не менее, в нескольких случаях было продемонстрировано связывание YB-1 со специфическими последовательностями РНК. Так, помимо обнаруженного в данной работе мотива UCCAA/GCA, был определен специфический участок связывания белка MSY2/4 эмбрионов мыши (гомолога YB-1) в 3 НТО мРНК протамина 1 (Giorgini et al., 2001). Этот участок содержит последовательность UCCAUCA. ещё один гомолог YB-1 - белок Chk-YB-1 курицы - проявлял повышенное сродство к РНК вируса саркомы Рауса и связывался с последовательностью GUACCACC (Swamynathan et al., 2000). Методом SELEX отобрана нуклеотидная последовательность, избирательно связывающаяся с белками FRGY1 (соматическим) и FRGY2 (эмбриональным) X. laevis (Bouvet et al., 1995). В обоих случаях этой последовательностью, названной YRS (FRGY Recognized Sequence), оказался гексануклеотид AACAUC.
Как можно видеть, эти нуклеотидные последовательности, специфически узнаваемые гомологами YB-1 из разных организмов, обладают определённым сходством между собой и с последовательностями, обнаруженными нами в мРНК YB-1 - все они обогащены А и С. Однако для избирательного взаимодействия с
YB-1 необходимо не только, а возможно, не столько высокое содержание А и С, но и определённое положение этих оснований в последовательности. Так, с помощью одно- и двунуклеотидных замен в последовательности AACAUC показано, что для связывания белка FRGY2 особенно важны нуклеотиды в третьем (С), четвертом (А) и шестом (С) положениях (Bouvet et al., 1995). Наши эксперименты также демонстрируют важность наличия А и С в сайте специфического связывания YB-1 в регуляторной последовательности мРНК YB-1 для ингибирования трансляции этой мРНК.
Однако в ряде случаев показано, что YB-1 имеет более высокое сродство и к другим последовательностям РНК, таким как поли(О) (Minich and Ovchinnikov, 1992) и AU-богатым последовательностям (Capowski et al., 2001). Почему YB-1 проявляет повышенное сродство к таким последовательностям, неизвестно, но возможно, это связано с особенностями пространственной структуры РНК с такими последовательностями.
Остается не вполне ясным вопрос о том, какой из доменов YB-1 отвечает за специфическое связывание с РНК. Например, было заявлено, что для специфичного взаимодействия FRGY2 с РНК требуется CSD, а С-концевой домен, неспецифически связывающий РНК, необходим для более эффективной ассоциации FRGY2 с РНК (Bouvet et al., 1995). Однако в другой работе было установлено, что только полноразмерный белок Chk-YB-1 способен специфически связываться с РНК вируса саркомы Рауса. Ни CSD, ни С-домен, взятые по отдельности, такой специфичностью не обладали (Swamynathan et al., 2000). Кроме того, на специфичность взаимодействия YB-1 с РНК в клетке могут, вероятно, влиять его ковалентные модификации, а также связывание с другими белками.
Похожие диссертации на Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1
