Содержание к диссертации
Введение
1. Краткие сведения о ДНК зависимой РНК полимеразе бактериофага Т7 Escherichia coli. 9
2. Этапы транскрипционного цикла 10
2.1 Инициация 10
2.2 Элонгация 13
2.3 Терминация 14
3. Терминационные последовательности РНК полимеразы бактериофага Т7 15
3.1 Терминационные последовательности первого класса (образующие стабильные шпилькообразные структуры) 15
3.1.1 Влияние контекста последовательности матрицы перед терминаторами первого класса 17
3.1.2 Влияние стабильности шпильки 17
3.1.3 Влияние А:Т богатого участка, расположенного после шпильки 18
3.2 Терминационные последовательности второго класса 18
3.2.1 Роль нематричной цепи в процессе терминации 19
3.2.2 Роль последовательности ДНК в терминации на сигналах второго класса 19
3.2.3 Влияние контекста последовательности матрицы на терминацию второго класса 21
3.2.4 Последовательность консенсуса является сайтом паузы Т7 РНК полимеразы 21
3.2.5 Роль А:Т богатой последовательности, расположенной после консенсуса, в терминации 22
4. Мутантные ферменты со сниженной эффективностью терминации на ГПТ 22
5. РНК полимеразы родственных бактериофагов узнают терминационные последовательности второго класса 23
6. Модель терминации на шпилькообразующем терминаторе 23
7. Кинетическая модель терминации 24
8 Результаты и обсуждение 28
8.1. Разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 28
8.1.1 Приближения РНК-полимеразы к однонитевому промотору при помощи ДНК связывающего домена белка Gal4 не достаточно для инициации транскрипции 29
8.1.2 Двуцепочечныи олигонуклеотид, имеющий последовательность участка связывания промотора, активирует транскрипцию на однонитевой матрице 32
8.1.3 Одноцепочечная ДНК должна содержать полную последовательность промотора для проявления эффекта активации 37
8.1.4 Модель активации транскрипции участком связывания промотора in trans 44
8.1.5 Удаление интеркалирующей петли не приводит к транскрипции на однонитевой матрице 47
8.2. Характеризация терминационного сигнала из гена предшественника прогормона паращитовидной железы человека 49
8.2.1 Влияние точечных мутаций на эффективность терминации на ПТГ терминаторе 51
8.2.2 Обе цепи двойной спирали ДНК необходимы для функционирования ПТГ терминатора 52
8.2.3 Нарушения двуспиральности ДНК перед ПТГ терминатором негативно отражаются на его функциональности 55
Выводы 58
Материалы и методы 59
- Элонгация
- РНК полимеразы родственных бактериофагов узнают терминационные последовательности второго класса
- Характеризация терминационного сигнала из гена предшественника прогормона паращитовидной железы человека
- Нарушения двуспиральности ДНК перед ПТГ терминатором негативно отражаются на его функциональности
Введение к работе
Изучение механизмов экспрессии генетической информации является одним из наиболее актуальных направлений в современной молекулярной биологии. Нарушения процессов экспрессии приводят к снижению жизнеспособности (болезням) или летальны. По данной тематике проводятся широкие исследования в мировых научных центрах. Первый этап экспрессии генов, транскрипция, осуществляется ДНК-зависимыми РНК полимеразами (РНКП), которые присутствуют у всех известных клеточных организмов и многих вирусов. Общепринято разделять РНКП на две группы: многосубъединичные и односубъединичные. Сложные многосубъединичные РНКП характерны для клеточных организмов, односубъединичные кодируются геномами некоторых вирусов и бактериофагов. Бактериофаг Т7 Escherichia coli кодирует собственную РНКП для экспрессии средних и поздних генов. Этот белок, молекулярной массой 98 кДа, содержит одну полипептидную цепь, в отличие от мультисубъединичных ферментов клеточных организмов. В то же время РНК полимераза фага Т7 обладает всеми функциями, необходимыми для полноценного синтеза РНК (Sousa, 1996; McAllister, 1997). Совпадение этапов транскрипции, сходство организации транскрипционных комплексов и наличие функционально гомологичных элементов в структурах РНК полимераз у всех организмов позволяют говорить о единообразии механизма транскрипции в природе. Универсальность транскрипционного аппарата наряду с относительно простым устройством фаговых РНК полимераз позволили ферменту фага Т7 занять уникальное место среди классических моделей для изучения транскрипции. Там, где результаты исследований многосубъединичных полимераз оказываются трудноинтерпретируемыми, изучение Т7 РНКП позволяет выявить основные детали протекания транскрипционного цикла и понять принципы транскрипционного механизма в целом.
В транскрипционном цикле различают три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. На первой стадии транскрипции РНК полимераза узнаёт специфическую последовательность промотора. После связывания фермента происходит разделение цепей ДНК на инициаторном участке и начинается синтез РНК-транскрипта. После нескольких циклов синтеза абортивных продуктов происходит переход к элонгации. На этой стадии происходит удлиннение РНК до тех пор, пока фермент не встретит сигнал терминации, что приводит к диссоциации транскрипционного комплекса и высвобождению готового РНК-продукта. Последние исследования позволили сделать качественный скачок в проблеме понимания процесса элонгации. В то же время наибольший интерес, как менее изученные, представляют стадии инициации и терминации.
Целями данной работы являлось разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК-полимеразы фага Т7 и выяснение принципа действия ПТГ терминатора. В процессе исследований решались следующие задачи (а) определение влияния связывания фермента с ДНК на эффективность инициации; (б) определение минимальной длины связывающего участка одноцепочечного промотора при которой происходит инициация; (в) выявление возможных иных функций участка связывания; (г) моделирование взаимодействия фермента с одноцепочечным промотором при добавлении двухцепочечного олигонуклеотида, содержащего участок связывания промотора; (д) определение последовательности ДНК необходимой для функционирования ПТГ терминатора; (е) выявление структуры ДНК необходимой для функционирования ПТГ терминатора.
Впервые показано, что участок связывания промотора несёт другую важную функцию, помимо связывающей - активацию полимеразы в транскрипционно-компетентное состояние. Продемонстрирована ранее не описанная возможность физического разделения участков связывания и инициации для промотора Т7 РНКП. Впервые показано, что Т7 РНКП инициирует синтез РНК на одноцепочечной ДНК, содержащей промотор.
Впервые определена минимальная нуклеотидная последовательность нового типа терминационного сигнала РНК полимеразы бактериофага Т7 (ATCTGTT в нематричной цепи). При мутации в любом из положений этого консенсуса терминации не происходит. Впервые продемонстрировано, что для терминации абсолютно необходимо наличие нематричной цепи в районе терминатора, иными словами двуспиральности ДНК. Даже при незначительных нарушениях непрерывности нематричной цепи (разрыва с отсутствием одного нуклеотида) перед терминатором эффективность терминации значительно снижается.
Полученные результаты позволяют составить представление о действии участка связывания промотора в процессе инициации транскрипции РНК полимеразы бактериофага 77, а также терминации на саитспецифическом терминаторе из гена предшественника паратироидного гормона человека. Эти новые факты вносят важный вклад в представления об инициации и терминации транскрипции.
Элонгация
Последние исследования элонгационных комплексов продемонстрировали, что длина ДНК:РНК гибрида составляет примерно 8 нт., при размере транскрипционного расплетения 9 нт., последующие 4 нуклеотида в РНК также защищены от действия РНКазы (Huang и Sousa, 2000; Temiakov и сотр., 2000; Liu и Martin, 2001). При изомеризации инициаторного ги комплекса в элонгационный комплекс происходят значительные конформационные изменения в структуре белка. В результате перестройки N- концевого домена фермент приобретает конформацию, достаточно стабильную, чтобы фермент мог продолжать элонгацию на протяжении нескольких тысяч пар оснований (Tahirov и сотр., 2002). В структуре РНКП присутствуют несколько элементов, влияющих на процессивность. Это РНК-связывающий домен, образующий контакт с растущим РНК-продуктом после потери им контакта с матрицей, а также домен «большого пальца», взаимодействующий с матрицей (Mentesana и сотр., 2000). Скорость синтеза РНК в процессе элонгации достигает 230 нт/сек (Golomb и Chamberlin, 1974), по другим данным 100-200 нт/сек (Туницкая и сотр., 1989), что значительно превышает скорость синтеза многосубъединичными РНК-полимеразами. Скорость передвижения полимеразы по матрице не равномерна. Она зависит от контекста последовательности, концентрации субстрата и других факторов. Замедление синтеза происходит в так называемых сайтах пауз, которые часто характеризуются наличием А:Т-богатых последовательностей (Lyakhov и сотр., 1998). Транскрипционный цикл завершается терминацией. Терминация При терминации происходит диссоциация тройного элонгационного комплекса на составляющие: фермент, ДНК и РНК-продукт. Для РНК полимеразы бактериофага Т7 известно два различных класса терминационных последовательностей. Первый класс терминаторов не имеет выраженной гомологии по последовательности, но обладает выраженной структурной гомологией (рис. 4). Терминаторы данного класса представляют собой инвертированный повтор, при транскрипции которого в РНК образуется стабильная структуру - шпилька, после которой следует несколько остатков уридина. Образование шпильки и нестабильного ДНК:РНК гибрида, поскольку пары A:U обладают наименьшей энергией взаимодействия, приводит к диссоциации РНК-продукта из тройного комплекса. Для терминаторов второго класса не характерна выраженная вторичная структура.
В то же время они содержат сходную последовательность: ATCTGTT. 3. Терминационные последовательности РНК полимеразы бактериофага Т7. 3.1. Терминационные последовательности первого класса (образующие стабильные шпилькообразные структуры). В последовательности генома бактериофага Т7 присутствует два терминатора, из которых лишь один - Тф, расположенный в районе кодирующем поздние гены, - узнаётся фаговой РНК полимеразои (Dunn и Studier, 1980). Этот терминатор относится к классу шпилькообразующих терминаторов или терминаторов первого типа (рис. 4). Терминатор Тф образован инвертированным повтором, при транскрипции которого в РНК образуется стабильная шпилькообразная структура. Длина шпильки данного терминатора составляет 12 нт, но не все нуклеотиды в ней образуют стабильные связи, часть из них образует относительно слабые G:U пары. В основании шпильки находятся четыре высокостабильных G:C пары. Сразу после инвертированного повтора находиться последовательность, кодирующая в РНК 6 остатков уридина (Dunn и Studier, 1983). Эффективность терминации на фаговых терминаторах невысока (McAllister и McCarron, 1977; McAllister и сотр., 1981), что может быть необходимо для экспрессии генетического материала, расположенного после терминатора в геноме бактериофага, так как данные гены транскрибируются лишь небольшой популяцией нетерминировавших РНКП (Dunn и Studier, 1983). Помимо терминатора Тф, РНК полимераза фага Т7 может также распознавать другие терминаторы, имеющие сходную структуру. Длина шпильки и количество остатков аденозина (которым соответствуют уридиновые остатки в РНК) может вариировать. К ним относятся ТЗ-Тф терминатор , ггпВ ТІ и ггпВ Т2 терминаторы из рибосомального оперона Escherichia coli (Christiansen, 1988), rrnC терминатор (Young, 1979; Jeng и сотр., 1990), треониновый аттенюатор (Jeng и сотр., 1990) и терминационный сигнал Р4 из плазмиды pBR322 (McAllister и сотр., 1981). Упомянутые терминационные последовательности узнаются также бактериальной РНК полимеразой из Є. coli, однако не все подобные сигналы, обладающие стабильной вторичной структурой, вызывают терминацию Т7 РНКП. В частности терминационный сигнал Т7-Те из раннего района генома фага Т7. Этот сигнал узнаётся бактериальной РНК полимеразой, но не узнаётся полимеразой бактериофага Т7 (Dunn и Studier, 1980). Это может быть обусловлено тем, что для терминации Т7 РНКП требуется более стабильная шпилька и продолжительная последовательность уридиновых остатков (Jeng и сотр., 1990). 3.1.1 Влияние контекста последовательности матрицы перед терминаторами первого класса. При анализе особенностей терминации РНКП Т7 на треониновом аттенюаторе (Jeng и сотр., 1990) обнаружили влияние последовательности, фланкирующей терминатор, на эффективность терминации. Сходные наблюдения сделаны в работе (Macdonald и сотр., 1993), где проводили исследования различных терминационных последовательностей. Исследователи установили зависимость эффективности терминации от промотора с которого начинался синтез РНК, а также от последовательности, расположенной перед терминатором. При этом анализ этой последовательности не выявил дополнительных элементов вторичной структуры в её составе. К Для терминации на Тф характерно наличие укороченных минорных продуктов терминации, вызыванных диссоциацией РНК в первой (восходящей) части шпильки. Эти продукты исчезают при удалении предшествующей терминатору последовательности матрицы.
Эти данные говорят о том, что при проходе через терминатор судьба транскрипционного комплекса зависит, в том числе, и от событий, произошедших перед этим и оказавших влияние на стабильность комплекса (Macdonald и сотр., 1994). і 3.1.2 Влияние стабильности шпильки При транскрипции анти-смысловой последовательности шпильки терминации не наблюдается (Christiansen, 1988), хотя её стабильность при этом не изменяется. Это указывает на наличие других факторов, также вносящих вклад в процесс терминации. В работе Jeng и сотр. (Jeng и сотр., 1990) проводили мутагенез треонинового аттенюатора. Сравнение терминации на 14 различных вариантах выявило важность как стабильности, так -j и последовательности шпильки для терминации. Экперименты с инвертированием последовательности терминатора проводились на терминаторе Тф, pBR322 Р4, trpA и rrnB ТІ. При этом сохраняется стабильность шпильки, однако РНКП теряет способность к терминации, что также указывает на наличие других факторов, вносящих вклад в эффективность терминации (Macdonald и сотр., 1993). В то же время, замена ГТФ на ИТФ в составе транскрипционной реакции приводит к исчезновению терминации на rrnB ТІ, напрямую демонстрируя важность стабильности шпильки для эффективной диссоциации тройного комплекса (Hartvig и Christiansen, 1996). 3.1.3 Влияние А:Т богатого участка, расположенного после шпильки Исследования терминации на треониновом аттенюаторе показали, что уменьшение протяжённости А:Т богатой последовательности, расположенной непосредственно после шпильки, вызывает падение эффективности терминации (Jeng и сотр., 1990). Сходные данные были получены в результате удаления остатков уридина из последовательности терминатора Тф. При этом происходит потеря терминатором функциональности (Macdonald и сотр., 1994). В этой же работе проводился анализ транскрипции на длинных А:Т богатых последовательностях, в результате которого было описано явление терминации на них при снижении концентрации УТФ.
РНК полимеразы родственных бактериофагов узнают терминационные последовательности второго класса
РНК полимеразы бактериофага ТЗ и SP6 терминируют на последовательности из гена предшественника гормона паращитовидной железы человека с эффективностью 0.53 и 0.80 соответственно, что сравнимо или выше эффективности терминации Т7 РНКП (0.54) (Lyakhov и сотр., 1997). РНК полимераза бактериофага SP6 также продемонстрировали высокую эффективность терминации в экспериментах с использованием терминатора ггпВ Tib (Kwdn и Kang, 1999). 6. Модель терминации на шпилькообразуюшем терминаторе В работе Sousa и сотр. (Sousa и сотр., 1992) выдвинули гипотезу, что с момента инициации транскрипции РНК полимераза может присутствовать, по меньшей мере, в двух функционально различных конформациях: абортивной (нестабильной) и процессивной (стабильной) форме. Переход фермента из одной конформации в другую происходит под действием растущей цепи РНК, которая взаимодействует с полинуклеотид- связывающим сайтом, расположенным в районе N-концевого домена белка (Muller и сотр., 1988; Patra и сотр., 1992). Это становиться возможным после того, как РНК достигнет длины примерно 10 нуклеотидов. В процессе терминации шпилька, образующаяся в РНК в результате прохождения через последовательность терминатора, нарушает взаимодействие РНК со связывающим сайтом белка. Вероятно, что образование шпильки может ослабить эти взаимодействия потому, что РНК связывающий сайт обладает значительно меньшим сродством к двунитевои РНК, чем к однонитевои. Таким образом, процесс перехода от процессивной конформации к абортивной является обращением процесса, произошедшего во время инициации. В качестве основного фактора стабильности тройного комплекса, состоящего из фермента, матрицы и продукта, называются РНК-белковые взаимодействия в районе полинуклеотид-связывающего сайта. Эта модель была принята за основу в последующих исследованиях для объяснения процесса терминации (Macdonald и сотр., 1993). Авторы внесли некоторые уточнения в модель, которые были основаны на новых наблюдениях. В частности, постулируется, что обратный процесс перехода от нестабильной формы к стабильной в процессе терминации протекает по многостадийному механизму. Процесс высоко специфичен, так как происходит узнавание определённой структуры РНК, и является не только следствием нарушения связи между белком и РНК продуктом. Основным фактором стабильности тройного комплекса предполагается ДНК-РНК гибрид. 7. Кинетическая модель терминации Данная модель является логическим развитием прдыдущих моделей. Переход РНК полимеразы из нестабильной инициаторно-терминационной конформации (ГТ) в стабильную элонгационную (EL) сопровождается ростом цепи РНК.
Присоединение каждого следующего основания в растущую цепь РНК либо диссоциация транскрипционного комплекса зависит от константы реакции в кадом из положений вдоль матрицы (рис. 6). Константы реакции отражают совокупность процессов, происходящих при добавлении следующего нуклеотида в положении п. В результате этого происходит сдвиг транскрипционного комплекса в положение п+1. Для комплекса в положении п, кх является константой включения в РНК следующего нуклеотида. к2 - константа перехода в нестабильную конформацию, к_2 - обратная константа перехода из инициаторно-терминационной конформации в элонгационную, к3 - константа терминации комплекса, 1с, -константа добавления следующего нуклеотида, когда фермент находится в инициаторно-терминационной конформации. Терминация элонгационного комплекса непосредственно без перехода в ГТ, а также возможность реакции, обратной добавлению нуклеотидов - гидролиз продукта, в данной модели не учитывались в следствие малой вероятности в обычных условиях протекания реакции. Кроме того, не учитывалась возможность неспецифической терминации, которая для РНК полимеразы дикого типа практически не детектируется. Вероятность терминации или остановки фермента (паузы) на матрице зависит от относительных значений констант в каждом конкретном положении на матрице. Продолжение процессивной элонгации (k2 kl7 и/или к2 к_2) подразумевает, что константа ki в типичном положении матрицы (РНК полимераза в элонгационной конформации) составляет около 200 s-1, так как средняя скорость реакции около 200 нт/сек. В то же время способность фермента синтезировать РНК длиной 15000 нуклеотидов подразумевает, что вероятность терминации составляет менее 1/15000. В свете кинетической модели, процесс перехода из инициаторно-терминационной конформации в элонгационную конформацию в данном положении матрицы является результатом уменьшения ki, увеличения к2 и/или уменьшения к_2). Эффективность терминации, следовательно, зависит от той фракции фермента, которая перешла в нестабильную конформацию, а также от значения к3, относительно к_2 и к,. При значении к», сравнимом с к3 и к_2, большая фракция фермента произведёт включение следующего основания в РНК и, соответственно, передвинется по матрице в следующее положение.
Механизм терминации РНК полимеразы бактериофага 77 на терминаторах двух классов имеет сходные черты, однако, существуют и важные отличия. В то же время, разница в факторах, вызывающих паузу (шпилька, в случае сигнала класса I, или специфическая последовательность, в случае сигнала класса II), подразумевает сходство кинетического механизма. Уменьшение ki (что ведёт к увеличению к2) происходит либо вследствие взаимодействия со шпилькой, либо с последовательностью. В последствии происходит сдвиг кинетического равновесия в сторону образования нестабильной конформации. Подобная модель позволяет объяснить процесс перехода фермента от паузы к терминации. Для терминаторов Тф и ГПТ характерна минимальная остановка в процессе элонгации, что подразумевает константу к3 значительно больше, чем к_2. В этом случае большая часть комплексов, перешедших в нестабильную конформацию подвергается диссоциации (терминирует), а не возвращается обратно в элонгационную конформацию. В таких случаях отношение терминировавшей фракции фермента к фракции продолжившей элонгацию должно быть примерно равно Кг/ki. Большое количество остатков уридина, характерное для сильных терминаторов, подразумевает, что к3 значительно превышает k_2 , при низкой стабильности гибрида. Соответственно, эффективность терминации снижается при уменьшении количества остатков уридина в составе терминатора ПТГ (Lyakhov и сотр., 1998). Большая фракция фермента при прохождении сигналов CJ или ПТГ, с укороченной последовательностью уридиновых остатков, задерживается на них в течение продолжительного времени. В данных случаях ki k2., a k3 k_2. Продолжительность паузы в таких случаях в значительной мере зависит от ki и к .
Характеризация терминационного сигнала из гена предшественника прогормона паращитовидной железы человека
Описано множество разнообразных сигнальных последовательностей ДНК, влияющих на процесс транскрипции. Среди них различные по силе промоторы, регуляторные участки связывания специфических белков-регуляторов, сайты пауз, на которых РНК полимераза временно останавливает синтез РНК- продукта, а также терминаторы, на которых происходит высвобождение РНК из транскрипционного комплекса. Наиболее изученными являются терминаторы, образущие шпилькоподобные структуры в РНК в процессе терминации. Другие сигнальные последовательности, в том числе вызывающие паузы, арест а также терминацию без образования шпилькоподобных структур в РНК изучены менее подробно. Известны два типа терминаторов, обуславливающих диссоциацию элонгационного комплекса Т7 РНК полимеразы. Терминатор Тф из района поздних генов фага Т7 представляет собой типичный терминатор типа I. Последовательность ДНК этого терминатора определяет возможность формирования стабильной шпилькоподобнои структуры в РНК во время транскрипции, после которой следует несколько А:Т пар. При транскрипции этого участка РНК- продукт образует наименее стабильные связи с матричной цепью ДНК. В результате существенно облегчается диссоциация РНК из тройного комплекса с ферментом и ДНК- матрицей. Эти черты характерны также для шпилькообразующих терминаторов бактериальной РНК полимеразы Escherichia со//, которые распознаются РНК полимеразой фага Т7. Для таких терминаторов характерна сходная вторичная структура при отсутствии гомологии в последовательности (за исключением А:Т богатого участка). В отличие от терминаторов типа I, для терминатора II типа, обнаруженного в гене предшественника гормона паращитовидной железы человека, невозможно предсказать образование шпилькоподобнои вторичной структуры в РНК. Кроме того этот терминатор теряет функциональность при удалении нематричной цепи ДНК. Хартвиг и Кристиансен обратили внимание на гомологию последовательности данного сигнала (ATCrGTT в нематричной цепи) и в последовательности терминатора ггтВ ТІ Е со//. Позднее гомологичные порледовательности были обнаружены в межгенном участке кДНК вируса везикулярного стоматита, в области разрешения конкатемеров фагового генома Т7 во время репликации, в ДНК аденовирусов, а также фага X. Некоторые из этих последовательностей вызывают терминацию лишь в присутствии лизоцима фага Т7 (снижающего эффективность транскрипции Т7 РНКП), или при транскрипции мутантными ферментами, чувствительными к лизоциму.
Описаны мутантные РНКП не способные к терминации на терминаторах II типа, в то же время не потерявшие функциональности на терминаторах I типа, из чего следует отличие механизмов протекания процесса терминации при транскрипции на терминаторах различных типов. Распознавание II типа терминаторов РНК полимеразой необходимо для нормального протекания жизненного цикла бактериофага Т7. В частности, мутация РНК полимеразы, приводящая к потере распознавания терминатора II типа в области разрешения конкатемеров генома Т7, вызывает нарушение обработки и упаковки фаговой ДНК в капсид. 2.1 Влияние точечных мутаций на эффективность терминации на ГПТ терминаторе Было показано, что ГПТ терминатор содержится в участке ДНК размером 31 п. о. Для точного картирования был проведён делеционныи анализ участка, предварительно содержащего ПТГ терминатор, в результате которого последовательность терминатора была локализована на участке от 15 до 4 п.о. перед точкой терминации. Данный участок содержит последовательность из 10 п. о. (САТСТЪ ми по нематричной цепи), необходимую для эффективной терминации. Поиск гомологичных последовательностей по базам данных выявил идентичную последовательность из 7 п. о. (подчёркнуто) в ДНК бактериофага Т7, а также в геномах некоторых вирусов. Для определения важности последовательности в каждом из положений консенсус подвергли мутагенезу. Результаты эксперимента представлены на рис. 21 и в таблице. При транскрипции на частично-однонитевых матрицах (участок связывания промотора должен быть двуцепочечным, см. главу 1) с ПТГ терминатором и без него количество полноразмерного продукта заметно снижено в первом случае (рис. 22, 3-я дорожка). Несмотря на отсутствие чётко-выраженной терминации в области сайта ТІ можно наблюдать диффузную зону, наличие которой позволяет объяснить, почему выход полноразмерного РНК продукта значительно ниже при наличии ПТГ терминатора, чем в его отсутствие (рис. 22, 4). Кроме того, картина продукции абортивного синтеза не отличается при транскрипции на обеих частично-одноцепочечных матрицах. Вышеизложенное позволяет предположить наличие сайта задержки Т7 РНКП (паузы) во время транскрипции, причём этот сайт функционален и при транскрипции на одноцепочечной ДНК. Продукты транскрипции на соответствующих матрицах разделены в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (использовались матрицы представленные на предыдущем рисунке, в дорожках 5-8 добавление лизоцима обозначено знаком «+»). Для изучения влияния нематричной цепи на терминацию были использованы искусственные матрицы с различными нарушениями двуспиральности ДНК (рис. 24). В результате экспериментов были сделаны следующие заключения: для терминации Т7 РНКП на ПТГ терминаторе необходимо наличие терминационной последовательности в обеих цепях, так как присутствие терминационного сигнала только в одной цепи не обеспечивает эффективной терминации (рис. 24, 3 и 4). В то же время, наличие ПТГ терминатора в матричной цепи в виде неспаренного участка приводило к уменьшению выхода полноразмерного продукта и появлению диффузной зоны в области продуктов терминации, в соответствии с предыдущими результатами. Наличие последовательности терминатора только в нематричной цепи не приводит к появлению продуктов терминации. Таким образом, при терминации на ПТГ терминаторе необходимо присутствие последовательности сигнала в матричной цепи и интактность структуры ДНК.
Нарушения двуспиральности ДНК перед ПТГ терминатором негативно отражаются на его функциональности
Различные наблюдения указываают на важность отделения РНК от ДНК во время транскрипции для функционирования ПТГ терминатора. В частности, при транскрипции на однонитевои матрице терминации не происходит. Икеда и Ричардсон предположили, что у протеолитически модифицированной трипсином Т7 РНКП (не терминирует на ГПТ), дефект может быть в разделении ДНК:РНК гибрида. Кроме этого, Мид и сотр. обнаружили приблизительно десятикратное уменьшение продуктивности терминации на негативно суперскрученной матрице по сравнению с линейной матрицей. Он предположил, что стабильность двуспиральной структуры ДНК (что может действовать на вытеснение РНК-продукта) влияет на эффективность терминации. Восстановление структуры ДНК при схлопывании транскрипционного расплетения (пузыря) после прохождения РНКП может влиять на вытеснение РНК - продукта из гибрида, или предотвращать возможный отжиг РНК обратно на ДНК после их разделения. Таким образом, в отсутствие гомологичной нематричной цепи, можно предположить, что на гетеродуплексном участке (где нити матрицы некомплиментарны друг другу и не образуют двойной спирали) не происходит отделения РНК, вследствие чего образуется протяжённый ДНК:РНК гибрид. Чтобы проверить справедливость вышеизложенной гипотезы, были проведены эксперименты на матрицах с разрывами в нематричной цепи, а также с гетеродуплексными участками, расположенными выше ПТГ терминатора. Как продемонстрировано на рис. 24, наличие разрыва (дорожка 5), или гетеродуплексного участка выше ПТГ терминатора приводит к потере узнавания сигнала полимеразой даже если сигнал присутствует в обеих цепях ДНК. Это особенно ярко проявляется в случае основного сайта терминации (Т2). В то же время, разрыв фосфатного остова ДНК в нематричной цепи (дорожка 9), как и наличие неспаренных концов ДНК, обрамляющих этот разрыв, оказывает гораздо меньший эффект на терминацию (дорожка 10, 11). Это демонстрирует необходимость более существенных изменений в структуре спирали ДНК для нарушения функциональности терминатора. Отсутствие нематричной цепи после сигнала терминации уменьшает выход продукта терминации на основном сайте терминации Т2, при этом терминация по прежнему возможна на сайте ТІ (дорожка 6, 7). В этих случаях ДНК двуспиральна в случае ТІ, в то время как на участке Т2 нематричная цепь отсутствует (дорожка 6), либо продолжается лишь непосредственно до точки терминации.
Вышеизложенные данные подтверждают необходимость двунитевои структуры ДНК для эффективной терминации на участке Т2, а также ПТГ последовательности выше по цепи. 1. Продемонстрировано, что участок связывания промотора РНК-полимеразы фага Т7 выполняет две функции: обеспечивает привлечение фермента к ДНК и активацию РНК-полимеразы фага Т7 в инициационно-компетентное состояние. 2. Показано, что РНК полимераза фага Т7 приобретает способность к инициации транскрипции на одноцепочечном промоторе при добавлении в реакцию двуцепочечного олигонуклеотида, содержащего последовательность участка связывания промотора. 3. Показано, что активация полимеразы невозможна при наличии мутаций на участке связывания промотора в составе одноцепочечной матричной цепи. 4. Предложена модель взаимодействия полимеразы с одноцепочечным промотором на начальной стадии инициации. 5. Продемонстрировано, что последовательность ПТГ терминатора (ATCTGTT) узнаётся РНК полимеразой фага Т7 специфически. Мутации в составе этого консенсуса нарушают функционирование терминатора. 6. Продемонстрирована необходимость непрерывности двойной спирали ДНК для терминации на ПТГ терминаторе в районе терминатора и перед ним. Показано, что присутствие фагового лизоцима не стимулирует терминацию на ПТГ терминаторе в виде одноцепочечной ДНК. Отличие принципа взаимодействия полимеразы с данным терминатором от шпилькообразующих терминаторов позволяет отнести ПТГ терминатор к отдельному классу П Для выделения больших количеств плазмидной ДНК использовали метод щелочного лизиса с последующим использованием полиэтиленгликоля (Sambrook и сотр., 1989). В микроколичествах плазмидную ДНК выделяли на силикагелевых мембранных колонках QUIAprep с использованием набора фирмы Qiagen, США. Использование ферментов в процедурах клонирования В процедурах клонирования плазмидной ДНК использовали различные рестрикционные эндонуклеазы, щелочную фосфатазу телёнка и Т4 ДНК лигазу (New England Biolabs, США). Для повышения эффективности клонирования продуктов ПЦР их фофорилировали по 5 -концу при помощи Т4 полинуклеотид киназы (New England Biolabs, США). Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях Для идентификации, разделения и очистки молекул ДНК проводили электрофорез в 1-2% агарозных гелях в 0,04 М трис-ацетатном буфере, рН 7,8 (Sambrook и сотр., 1989). При нанесении в образцы добавляли 10 кратный буфер нанесения, содержащий 0,04 М трис-ацетатный буфер, 50% глицерин, 0.25% бромфеноловый синий и 0.25% ксиленцианол. Анализ первичной последовательности ДНК Для определения последовательности ДНК в составе плазмид использовали метод секвенирования по Сэнгеру с двуцепочечнои ДНК при помощи набора Sequenase 2.0 DNA sequencing фирмы USB (США) согласно рекомендации производителя. В качестве радиоактивной метки использовали a-35S- ATP (NEN, США). Олигонуклеотидные праймеры заказывали в Macromolecular Resources, США. После проведения электрофореза в 6% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях гель фиксировали в растворе, содержащем 15% метанола, 5% уксусной кислоты в течение 30 мин., переносили на фильтровальную бумагу Змм Chr (Whatman, США) и высушивали на сушилке Slab Dryer 483 (Bio-Rad, США). Высушенные гели экспонировали в течение 14-18 часов с рентгеновской плёнкой RX-B (Labscientific, США) и проявляли при помощи автоматического прибора X- ОМАТ М35 processor (Kodak, США). Разделение РНК и ДНК методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидных гелях Для разделения продуктов транскрипционных реакций использовали электрофорез в 12% или 20% полиакриламидных гелях (соотношение акриламида к метиленбисакриламиду 19:1) в трис- боратном буфере (0,09 М Трис - борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0-8,5) в Ц присутствии 7 М мочевины (Sambrook и сотр., 1989). Перед нанесением образцов к ним добавляли равный объём буфера нанесения. Использовали буфера нанесения следующего сосотава: буфер с мочевиной, содержащий двукратный трис-боратный буфер, 8 М мочевину и 50 мМ ЭДТА, а также формамидный буфер, содержащий 90% формамид и 50 мМ ЭДТА. Электрофорез проводили при постоянной мощности 85 Вт в течение полутора часов для 20% гелей и 75 Вт, 1 час для 12% гелей.
