Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1.1. Физико-химические свойства Т7РНКП, первичная и пространственная структура фермента 10
1.2. Транскрипционный цикл Т7РНКП 19
1.2.1. Взаимодействие с промотором 20
1.2.2. Связывание NTP и инициация транскрипции 34
1.2.3. Элонгационный комплекс и удлинение РНК 44
1.2.4. Неспецифические проявления активности Т7РНКП. Беспромоторные системы 55
1.2.5. Терминация транскрипции 59
1.3. Функциональные исследования 7РНКП. Роль отдельных аминокислотных остатков 72
1.2.5. Химическая модификация и ингибиторный анализ 73
1.2.6. Аффинная модификация 76
1.2.7. Исследование мутантных форм Т7РНКП 95
Материалы и методы
2.1. Реактивы, буферные растворы, плазмиды и ферментные препараты 114
2.2. Методики, использованные в работе 117
2.3. Расчет кинетических параметров реакций 131
2.4. Конформационные расчеты и построение пространственных моделей 135
Результаты и обсуждение 137
3.1. Аналоги нуклеотидов - субстраты и ингибиторы Т7РНКП 137
3.2. Необратимые ингибиторы Т7РНКП. Аффинная модификация фермента 145
3.3. Роль N-концевого домена и междоменной перемычки 158
3.3.1.Изучение ограниченного протеолиза Т7РНКП 158
3.3.2. Исследование мутантных форм Т7РНКП, содержащих замены аминокислотных остатков в области междоменной перемычки 160
3.3.3. Мутации по остатку Lys-98 171
3.4. Роль аминокислотной последовательности 563-571 в Т7РНКП 173
3.5. Исследование консервативного мотива В 179
3.5.1.Общая характеристика мотива В 179
3.5.2. Обоснование выбора вариантов аминокислотных замен 180
3.5.3. Мутации в N-концевой части мотива В 181
3.5.4. Мутации в С-концевой части мотива В 186
3.6. Уникальные свойства мутанта Tyr639Phe. «Двойной» и «тройной» мутанты.Л 96
3.6.1.Утилизация дезоксирибонуклеотидов мутантной формой Т7РНКП 196
3.6.2. Ошибки при транскрипции, свойственные «двойному» и «тройному» мутантам 204
3.6.3. Функционирование «двойного» мутанта Т7РНКП в режиме удлинения праймера 206
3.7. Взаимодействие Т7РНКП с модифицированными промоторами 212
3.8. Фотоаффинная модификация Т7РНКП. 5-[3-()-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)пропенил-1]-иТР (N3-TFBP-UTP) 223
Выводы 233
Благодарности 236
Список литературы 237
- Неспецифические проявления активности Т7РНКП. Беспромоторные системы
- Функциональные исследования 7РНКП. Роль отдельных аминокислотных остатков
- Конформационные расчеты и построение пространственных моделей
- Исследование мутантных форм Т7РНКП, содержащих замены аминокислотных остатков в области междоменной перемычки
Введение к работе
Бактериофаг Т7 является одним из наиболее изученных среди фагов, поражающих клетки E.coli. Ключевым ферментом жизнедеятельности бактериофага является ДНК-зависимая РНК-полимераза (Т7РНКП), которая ответственна за транскрипцию генов, кодирующих белки, определяющие созревание и упаковку фаговых частиц. Т7РНКП бьша впервые выделена в 1969 г. из клеток E.coli, инфицированных бактериофагом Т7. В настоящее время источником вьщеления рекомбинантного фермента являются штаммы E.coli, несущие плазмидные конструкции, экспрессирующие ген 1 бактериофага Т7.
Т7РНКП состоит из 883 аминокислотных остатков (98092 Да) и представляет собой односубъединичный белок, способный осуществлять полный цикл транскрипции без участия каких-либо дополнительных белковых факторов. Это делает данный фермент наиболее удобной моделью для изучения молекулярных механизмов транскрипции. Новая информация о закономерностях процесса транскрипции может быть использована при изучении других ферментов, в том числе вирусных РНК-полимераз, что имеет большое значение для поиска способов борьбы с вирусными инфекциями.
Помимо этого, вследствие доступности Т7РНКП, ее высокой транскрипционной активности и строгой специфичности к промотору, этот фермент широко используется в молекулярной биологии для синтеза заданных последовательностей РНК. Изучение закономерностей функционирования Т7РНКП, наряду с исследованием мутантных форм фермента, может привести к получению белков с измененными свойствами, являющихся более эффективными и многофункциональными молекулярно-биологическими инструментами, нежели природная Т7РНКП. В связи с этим
детальное структурно-функциональное исследование Т7РНКП, в частности,
установление роли отдельных аминокислотных остатков и локализация контактов между компонентами полимеразной реакции в процессе транскрипции, является актуальной научной задачей.
Целью настоящей работы являлось изучение молекулярного механизма действия и роли отдельных структурных элементов Т7РНКП на различных стадиях процесса транскрипции, в частности, установление функции отдельных аминокислотных остатков фермента в на различных стадиях ферментативной реакции, выявление контактов между компонентами транскрипционного комплекса, включая и такие, которые вследствие короткого времени существования не могут быть зафиксированы при рентгеноструктурных исследованиях. Кроме того, изучение мутантных форм Т7РНКП, обладающих новыми свойствами, может расширить возможность применения этого фермента в молекулярно-биологической практике.
Т7РНКП изучается в лаборатории энзимологии транскрипции ИМБ РАН с 1987 года. В начале нашей работы информация о функциональной топографии и механизме действия Т7РНКП была весьма ограниченной. Однако, поскольку данный фермент является перспективным объектом как с позиции исследования молекулярных основ механизма транскрипции, так и с точки зрения практического использования, в последние десятилетия этот белок был предметом пристального внимания целого ряда зарубежных лабораторий. За прошедшие годы с начала нашей работы в научной литературе появились сотни публикаций, касающихся исследований Т7РНКП, основные из них подробно рассмотрены в обзоре литературы. Вследствие этого наше исследование оказалось закономерно «встроенным» в общий поток работ по этому актуальному направлению.
9 Такая ситуация имела как свои достоинства, так и недостатки. С одной стороны,
полученные нами результаты в ряде случаев были приоритетными и через некоторое
время подтверждались независимыми исследованиями других лабораторий. Кроме
того, появление в 1993 году первых данных, а в 1999-2002 году - полного цикла
рентгеноструктурных исследований Т7РНКП, позволило нам соотнести результаты
нашей работы с информацией, полученной принципиально иным методом, и тем самым
получить дополнительные подтверждения обоснованности наших положений и
выводов. С другой стороны, находясь в состоянии жесткой конкуренции с
зарубежными лабораториями, в большинстве случаев лучше материально
оснащенными, в некоторых случаях мы не смогли обеспечить приоритетность наших
результатов - аналогичные независимо полученные данные оказывались
опубликованными одновременно или чуть раньше наших.
Однако в целом нам удалось сохранить положение одной из лидирующих групп, разрабатывающих данную научную проблему. Значительная часть результатов, представленных в данной работе, в настоящее время сохраняют свою новизну и оригинальность, признанную нашими зарубежными коллегами и конкурентами.
В процессе всестороннего исследования Т7РНКП с использованием преимущественно методов аффинной модификации и исследования мутантных форм фермента, нам удалось установить ряд новых деталей механизма функционирования фермента, а также выявить неизвестные ранее контакты между отдельными аминокислотными остатками Т7РНКП и определенными положениями промотора и/или нуклеотидных субстратов. Были также исследованы впервые полученные мутантные формы фермента, обладающие новыми свойствами, не присущими Т7РНКП дикого типа.
Неспецифические проявления активности Т7РНКП. Беспромоторные системы
Несмотря на очень высокую специфичность Т7РНКП к своему промотору, in vitro были зарегистрированы проявления полимеризующей активности этого фермента в системах, не содержащих промотора. Неизвестно, имеет ли место что-нибудь подобное in vivo. Некоторые из этих проявлений пока не получили внятного объяснения, и возможно могут рассматриваться как артефакты. Так, Biebncher & Luce [116] описали синтез РНК de novo в отсутствие вообще какой-либо матрицы. Этот процесс регистрировался (по истечении длительного лаг-периода) в неординарных условиях проведения реакции, с использованием очень высокой концентрации Т7РНКП и длительного времени инкубации (до 20 часов). В смеси обнаруживались РНК-продукты различной длины, в среднем несколько десятков нуклеотидов. Авторы предполагают, что в данных условиях реализуется механизм, подобный присущему некоторым вирусным РНК-зависимым РНК-полимеразам (репликазам), однако оговариваются, что вряд ли этот процесс может реализоваться in vivo.
В ряде случаев при анализе продуктов полимеразной реакции наблюдается превышение длины синтезируемого транскрипта над длиной транскрибируемой части матрицы (т.н. аберрантные транскрипты) [117-119]. На этом основании Cazenave & Uhlenbeck [117] предположили, что если транскрибируемая РНК имеет самокомплементарные участки и способна образовывать шпильки, то после ее диссоциации с матрицы происходит дальнейший синтез по модели РНК-зависимого удлинения праймера. В работе [118] было предложено другое, более убедительное, объяснение этому факту. Предполагают, что в случае транскрипции с матриц, имеющих 3 -выступающие (и в меньшей степени - «тупые») концы, Т7РНКП конформационно способна «поворачивать обратно» и считывать комплементарную цепь, которая становится для нее кодирующей. При этом после «поворота» фермент работает в обычном режиме элонгации, а отнюдь не РНК-зависимого синтеза. Однако недавно была опубликована работа [119], в которой, подтверждая наблюдение, что синтез аберрантных транскриптов зависит от структуры концевой части матрицы (наличия 3 -выступающего конца), авторы тем не менее считают предпочтительней гипотезу о РНК-зависимом удлинении праймера, нежели о «повороте» фермента и транскрипции второй цепи матрицы. Таким образом, вопрос о механизме возникновения аберрантных транскриптов окончательного ответа не получил. Возможно, что имеет место суперпозиция обоих вариантов: в результате «поворота» фермента синтезируется самокомплементарный участок РНК, а уже затем сам этот участок выступает в роли праймера.
Примерами беспромоторного синтеза (удлинения РНК-праймера), осуществляемого в искусственной системе, служат обсуждавшиеся выше модели элонгационного комплекса [111-115]. В этих случаях наличие полимеризующей активности объясняется тем, что данная система является аналогом стадии элонгации фермента. Однако сам факт необходимости искусственного конструирования подобных систем свидетельствует, что такая модель также не функционирует in vivo.
В работе [120] обсуждается наличие у фермента ДНКазной (специфичной к одноцепочечным участкам) и РНКазной активностей. Эти активности присущи именно Т7РНКП, а не минорным примесям в белковых препаратах, что доказывается тем, что мутации в активном центре фермента резко снижают, наряду с полимеразной, и эти сопутствующие активности. Нуклеазные активности Т7РНКП регистрировались только в отсутствие ДНК-матрицы и/или мононуклеотидных субстратов, иными словами, при невозможности протекания реакции полимеризации, а также были присущи ферменту в составе остановленного элонгационного комплекса. Напрашивается аналогия с некоторыми ДНК-полимеразами, например, с фрагментом Кленова, у которого в отсутствие субстратов для полимеризации на первый план выступает нуклеазная активность.
Помимо перечисленных случаев, носящих либо искусственный, либо, возможно, отчасти артефактный характер, хорошо известен тот факт, что Т7РНКП способна эффективно вести синтез гомополирибонуклеотидов на одноцепочечных матрицах: лучше всего утилизируется (dC)n, с несколько меньшей эффективностью -альтернирующие полимеры (dGdC)n и (dIdC)„, а также ДНК из спермы лосося. Во всех случаях продуктом является гомополимер (rG)„. [14,39].
Функциональные исследования 7РНКП. Роль отдельных аминокислотных остатков
При всесторонних исследованиях транскрипционного цикла, катализируемого Т7 РНКП, применялся весьма широкий спектр методических подходов, которые адекватны поставленной задаче. Одним из наиболее информативных подходов были ренттено-структурные исследования, позволяющие «нарисовать» структуру реакционного комплекса, соответствующую различным стадиям транскрипционного цикла, и тем самым однозначно показать наличие и природу конформационных перестроек между стадиями реакции. Важную роль сьпрали и другие подходы, описанные вьппе, например различные варианты футпринтинга.
В то же время эта стратегия кажется гораздо менее эффективной при исследовании вопроса о внутренних молекулярных механизмах, обеспечивающих эти важные конфор-мационные перестройки, а также узнавание промотора и выбор «правильных» нуклеотид-ных субстратов, т.е. о конкретной роли отдельных аминокислотных остатков белковой молекулы. При всех бесспорных достоинствах РСА, этот метод дает информацию о статическом состоянии белка (и комплекса) в определенный момент времени, и не может ответить на вопрос, какими внутримолекулярными взаимодействиями это состояние было достигнуто, иными словами, какова динамика межстадийных переходов, узнавания субстрата, формирования фосфодиэфирной связи и т.д.
Для исследования функциональной роли отдельных аминокислотных остатков в молекуле фермента широко применяются иные подходы. В основном, это различные виды химической модификации, а также получение и исследование мутантных форм фермента.
Анализ воздействия на активность фермента разнообразных химических соединений был очень широко распространен несколько десятилетий назад: исследование практически всех ферментов начиналось с анализа действия на них реагентов, специфичных по отношению к определенным аминокислотным остаткам, а также структурных аналогов субстратов, которые могут как утилизироваться ферментом, так и ингибировать его активность. Эти подходы и сегодня продолжают использоваться как элемент первичной характеризации ферментов.
В одной из ранних работ Oakley et al [9] было показано полное ингибирование Т7РНКП дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (Nbs2) и [14С]иодацетамидом. В обоих случаях полная инктивация фермента соответствовала включению 0.9-1 моль реагента на моль белка, причем включение [14С] блокировалось при предварительной обработке Nbs2, что указывало на наличие единственной критической для активности SH-группы, являющейся мишенью обоих реагентов. У модифицированного фермента способность связываться с промотор-содержащей матрицей сохранялась, но значительно ухудшалось сродство к GTP. После денатурации гуанидинхлоридом число SH-групп, реагирующих с Nbs2, увеличивалось до 4-х.
В то же время по данным других авторов [18], титрование денатурированного белка Nbs2 указывает на доступность для модификации всех 12-ти остатков цистеина, имеющиеся в белке, а 5 из них остаются доступными и в нативной форме. Использование [14С]иодацетамида, так же как и в работе [9], показало полную инактивацию при включении 1 моля реагента на моль белка, однако было зарегистрировано изменение параметров взаимодействия модифицированного фермента не только с GTP, но также и с промотором. Основной мишенью амидометилирования являлся Cys347; в меньшей степени затрагивались Cys723 и Cys839. Первые два остатка находятся в консервативных сегментах, которые, по данным целого ряда исследований [66,75,78], предположительно участвуют во взаимодействии с промотором.
В той же работе [9] было показано, что нитрование тетранитрометаном 4-х поверхностных остатков тирозина приводит к нарушению связывания Т7РНКП с промотором. Для двух других ДНК-связьшающих белков бактериофагов Т4 и fd, показано, что тирозиновые остатки участвуют в связывании ДНК, интеркалируя между основаниями одной из цепей [138], что может способствовать расплавлению двойной спирали. Заметим, что по данным рентгеноструктурного анализа (см. выше), остатки тирозина, участвующие во взаимодействии с промотором, однозначно не установлены; известному функционально важному остатку Туг639 скорее приписывается участие в каталитическом акте на стадии дискриминации нуклеотидных субстратов и формирования межнуклеотид-ных связей, нежели в связывании с промотором. В то же время, как обсуждалось выше, Sastry & Ross [59] предполагают взаимодействие Туг623 с нуклеотидом в (-3) положении промотора.
Другой подход, как сказано выше, заключается в анализе действия на фермент структурных аналогов субстратов. На основе полученных этим методом результатов можно судить о важности отдельных фрагментов молекулы субстрата для активности фермента, о локализации зарядов и возможности электростатических взаимодействий, о наличии/отсутствии свободных полостей, куда может (или не может) поместиться объемный заместитель и т.п. Эти предварительные данные позволяют планировать дальнейшие исследования.
В последние годы, в связи с появлением и развитием более прогрессивных подходов, этот метод используется уже не столь широко. Исключение составляют исследования ключевых ферментов метаболизма некоторых вирусов (ВИЧ, вируса гепатита С и др.) В этом случае широкий скрининг потенциальных ингибиторов указанных ферментов имеет основной целью поиск новых лекарственных препаратов (см. например, обзор [ 139] ). Иногда анализ ингибирующего действия определенного класса соединений на ферменты имеет целью изучение механизма действия не фермента, а именно данного класса соединений, как правило, интересных для медицины. Так, например, Wilmanska et al [НО] исследовали ингибирующее действие ряда противо-опухолевых антибиотиков на различные стадии процесса транскрипции, катализируемые РНК-полимеразами E.coli и бактериофага Т7 с целью детализации механизмов действия не столько ферментов, сколько самих антибиотиков.
Андреевой и соавт. [141] было проведено исследование серии аналогов нуклеозидтрифосфатов и неорганического пирофосфата как потенциальных ингибиторов или субстратов Т7РНКП и обратной транскриптазы ВИЧ. Эти соединения представляли собой производные бис-фосфоновой кислоты, имеющие различные ароматические и неароматические боковые заместители, а также производные NTP, при встраивании которых в растущую цепь в процессе реакции полимеризации уходящей группой оказываются бис-фосфонаты. Среди исследованных аналогов нуклеотидов рибо-ряда обнаружились два соединения, являвшихся полноценными субстратами Т7РНКП. Еще несколько соединений позволяли получить абортивные продукты, однако слишком малая длина последних, требующая лишь одно-двухкратного встраивания соответствующего аналога в растущую цепь, не позволяла достоверно утверждать, что эти абортивные транскрипты не связаны с ошибочным некомплементарным включением, либо с незначительными примесями немодифицированных нуклеотидов. Получение полноразмерных транскриптов может служить доказательством того, что использование соединения ферментом не является артефактом. В обоих случаях уходящей группой оказывалась незамещенная метиленбисфосфоновая кислота. Введение заместителей в метиленовую группу приводило к невозможности утилизации соответствующего производного.
Конформационные расчеты и построение пространственных моделей
Пространственные модели строили с применением программы DS Viewer Pro (Accelrys Ьіс), используя в качестве исходной модели трехмерные структуры Т7РНКП: свободного фермента (Brookhaven Protein Data Bank ГО 1ARO) [37] (для рис.3.18), Т7РНКП в комплексе с промотором (ID 1CEZ) [32] (для рис.3.35), и инициаторного комплекса (ID 1QLN) [34] (для рис.3.24 и 3.38). Для построения модели связывания N3FBP-UTP в активном центре Т7РНКП структура ингибитора предварительно оптимизировалась методом молекулярной механики ММ+ в программе HyperChem 6.01 (Hypercube Lie), вводилась в позицию, соответствующую 3 - концевому остатку растущей цепи РНК в трехмерной структуре и далее анализировалась в программе DS Viewer Pro. В качестве оценки стерических затруднений между заместителем в положении 4 уридинового основания N3FBP-U и белком были выбраны близкие межатомные контакты менее 70% сумм ковалентных радиусов. В нашей лаборатории к.б.н. В.О.Речинским был разработан метод экспрессии Т7РНКП в клетках Е.соН под контролем термочувствительного промотора, позволяющий получать фермент в больших количествах (до 50 мг белка из 1 л культуры) [5], что дало возможность начать широкие исследования механизма действия этого фермента. В момент начала нашей работы мы располагали весьма скудными сведениями относительно пространственного строения и механизма действия Т7РНКП; известна была лишь первичная структура белка [6,7] и некоторые его самые общие характеристики. Поэтому мы начали исследования с тех экспериментов, которые традиционно предшествуют ренттеноструктурным и генноинженерным исследованиям белков, а именно с проведения ингибиторного анализа и поиска подходящих реагентов для аффинной модификации. Для детального исследования роли рибозного остатка мы использовали ряд аналогов UTP, содержащих дополнительные метальные группы в положениях 2 , 3 и 5 рибозного фрагмента молекулы. Эти соединения (рис.3.1 А) были любезно предоставлены нам д.х.н. С.Н. Михайловым (ИМБ РАН). В первую очередь были исследованы субстратные свойства этих соединений, то есть их способность заменять природный UTP в реакции транскрипции, катализируемой Т7РНКП (рис.3.1 Б). Было показано, что наличие дополнительных СНз-заместителей в 5 -положении рибозы уменьшало включение данных соединений в растущую РНК-цепь вместо UTP: 5 -аял0-изомер (5 aMeUTP) обеспечивал активность фермента равную 15% от контрольной, а для /иалло-изомера (5 tMeUTP) включение составляло 7%. В обоих случаях совместное присутствие в реакционной смеси аналога и природного субстрата приводило не только к полному восстановлению активности, но даже к некоторому ее превышению, близкому к аддитивности (110 и 103% соответственно), что указывает на то, что 5 - метильные аналоги UTP не ингибируют (или не терминируют) синтез, а только лишь хуже (медленнее) включаются в растущую цепь продукта. Иная картина наблюдалась в случае введения СНз-групп в Т и 3 -положения рибозного остатка нуклеотида. 3 MeUTP не являлся субстратом для Т7РНКП, однако добавление природного UTP полностью восстанавливало активность фермента. Таким образом, в данном случае не наблюдалось конкуренции между субстратом и аналогом, что указывало на то, что 3 -метилированный UTP фактически не обладал сродством к активному центру фермента. В то же время 2 MeUTP не только утрачивал субстратные свойства, но и эффективно ингибировал включение природного UTP. Для выяснения механизма этого ингибирования продукты транскрипции были исследованы посредством электрофореза в полиакриламидном геле (рис.3.1.В). Матрицей служила плазмида pGEMT, инициирующая последовательность которой такова, что первое включение UTP соответствует положению (+13) транскрипта.
Как видно из рисунка, оба изомера, содержащие СНз-группы в 5 -положении, обеспечивают получение полноразмерного транскрипта, хотя, как уже было показано, с меньшей эффективностью (рис. 3.1 В, дорожки 3 и 4). Среди продуктов, полученных в присутствии З МеЦТР (рис. 3.1 В, дорожка 6), регистрируются только абортивные транскрипты, не достигающие длины 13 нуклеотидов. В то же время 2 MeUTP однократно включается в РНК-продукт в положении +13 и обеспечивает полную терминацию синтеза: никаких более длинных продуктов в реакционной смеси не регистрируется (рис.3.1 В, дорожка 5).
Исследование мутантных форм Т7РНКП, содержащих замены аминокислотных остатков в области междоменной перемычки
Для контроля мы построили график заведомо неспецифического взаимодействия с плазмидой, не содержащей промотор. Кроме того, поскольку было показано, что Т7РНКП, модифицированная ФСБА, полностью сохраняет неспецифическое связывание с ДНК, но теряет специфический компонент, мы использовали в качестве контроля также Ет. Действительно, график зависимости ln(Bj / В0) от времени в обоих последних случаях представлял собой прямую линию (рис.3 Л 4, кривые 2 и 3). Результаты проведенных экспериментов, характеризующих связывание мутантных форм Т7РНКП с промотором и с неспецифической ДНК, приведены в табл.3. И Из данных табл. 3.11 видно, что параметры взаимодействия Т7РНКП с промотором для фермента дикого типа и Lysl72Gly близки, в то время как у мутантов с расширенной способностью к утилизации матрицы комплекс с ДНК характеризуется меньшей стабильностью.
Можно полагать, что этой дестабилизацией и объясняется наблюдаемое изменение специфичности мутантов. Для последующей характеристики полученных мутантных форм фермента, (а также в дальнейшем и других планируемых мутаций), было интересно определить отдельно скорости инициации и элонгации синтеза РНК, поскольку влияние замен на эти стадии процесса транскрипции могло оказаться различным. Ранее основным подходом к определению средней скорости элонгации при синтезе РНК Т7РНКП являлся анализ транскриптов, синтезированных на тотальной ДНК фага Т7 [45] или на плазмиде, содержащей промотор [11]. Сущность метода заключалась в одновременном добавлении в реакционную смесь двух промотор-содержащих матриц, значительно отличающихся по длине синтезируемых на них транскриптов. В результате при анализе продуктов реакции в полиакриламидном геле сначала появлялся транскрипт меньшей длины, а спустя некоторое время - продукт большей длины. Исходя их разности числа транскрибируемых нуклеотидов и временного интервала между появлением короткой и длинной копий, рассчитывалась скорость элонгации синтеза. Данный метод имеет невысокую точность: поскольку скорость элонгации для Т7РНКП исчисляется сотнями нукл./сек, полученный временной интервал даже при большом различии в длинах транскриптов очень мал (несколько секунд), что приводит к большой погрешности определения.
Мы предложили принципиально новый подход к определению параметров стадий инициации и элонгации синтеза, основанный на кинетическом анализе реакции. Среднее время синтеза одной полной РНК-копии ДНК-матрицы (х) может быть представлено, как где t« - среднее время элементарного акта элонгации (включения одного нуклеотида в растущую цепь РНК); N - число нуклеотидов в транскрибируемой части матрицы; tx - сложный параметр, включающий временные характеристики стадий связывания субстратов, собственно инициации и терминации транскрипции. Принимая допущения, что, во-первых, число неполных РНК-копий пренебрежимо мало, и, во-вторых, что можно игнорировать паузирование в процессе транскрипции (приемлемость обоих допущений вытекает из рис.3.13), вводим следующие обозначения: t - время протекания реакции(сек.); [М] - концентрация матрицы (моль); п - число синтезированных РНК-копий; X - общее количество нуклеотидов, включенное в цепь РНК за время проведения реакции (моль). Тогда Отсюда время синтеза одной полной РНК-копии (т) равно t / п, или В условиях эксперимента где Ао - общая радиоактивность в пробе, cpm; Аі - включение радиоактивности в продукт, С - количество радиоактивного NTP в образце (моль), ф - коэффициент «гетерогенности матрицы». При длине матрицы более 150 п.о. ф 4, поскольку можно считать, что все четыре нуклеотида встречаются с одинаковой частотой. В случае матриц меньшей длины необходимо учитывать их состав, так как для абсолютного большинства матриц, применяющихся для определения активности Т7РНКП, в районе начала синтеза транскрипт обогащен пуриновыми нуклеотидами, особенно гуаниновы-ми. При использовании в качестве меченого нуклеотидного субстрата GTP, для матриц с N = 42,66 и 106 (см. Материалы и методы, табл.2.2) ф = 2,4; 2,9 и 3,2 соответственно. Из уравнений (3.5) и (3.6) следует, что
