Содержание к диссертации
Введение
1. Генетическая иммунизация 11
2. ДНК-иммунизация при герпетических инфекциях 19
2.1 Классификация герпесвирусов 20
2.2 Пути передачи ВПГ 22
2.3 Строение ВПГ 23
2.4 Взаимодействие вирусас клеткой 23
2.5 Иммунный ответ при герпетической инфекции 26
2.6 Современные вакцины против ВПГ 30
2.6.1 Инактивированные вакцины ..30
2.6.2 Субъединичные вакцины 32
2.6.3 Живые аттенуированные, генноинженерные вакцины 33
2.7 ДНК-вакцины против ВПГ-инфекции 34
2.8 Адъюванты для ДНК-вакцин 36
3. ГМ-КСФ и ФНО как потенциальные адъюванты для ДНК-вакцин 40
3.1 ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) 40
3.2 Фактор некроза опухоли (ФНО) 42
4. Отечественные иммуномодуляторы нового поколения 45
4.1 Глюкозаминил-мурамилдипептид (ГМД11) 45
4.2 Гепон 47
5 Собственные исследования 50
5.1 Получение гибридом, продуцирующих МКА к белкам ВПГ 1 50
5.1.1 Иммунизация 50
5.1.2 Миеломная клеточная линия 50
5.1.3 Культивирование клеток 50
5.1.4 Слияние клеток и выращивание гибридом 50
5.1.5 Криоконсервирование гибридом 51
5.1.6 Получение асцитных жидкостей, содержащих МК 52
5.1.7 Получение МКА из асцитных жидкостей 52
5.1.8 Определение концентрации белка 52
5.1.9 Субтипирование МКА 52
5.1.10 Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 52
5.1.11 Непрямой иммунофлюоресцентный анализ (нИФ) 52
5.2. Животные 53
5.3. Вирус и клетки 53
5.4. Определение летальной дозы ВПГ1 53
5.5. Иммуноген (плазмида pDNAgD) 54
5.6. Выделение рекомбинантного фактора некроза опухоли мышей (мФНОа) 54
5.7. Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного TNFa 54
5.8. Конструирование плазмиды для эукариротическои экспрессии гена мышиного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF) 55
5.9. Трансфекция in vitro 56
5.10. ДНК-иммунизация 57
5.11. Изучение активности антител к ВПГ1 57
5.12. Реакция нейтрализации 57
5.13. Определение ВПГ-специфических иммуноглобулинов класса IgGl и IgG2a 58
5.14. Определение количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов 58
5.15. Определение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов 58
5.16. Активность интерферона (ИФа) 59
5.17. Протективный ответ 59
6. Получение и характеристика МКА кВПГ 60
6.1 Слияние и скрининг гибридом 60
6.2 Характеристика МКА 61
6.2.1. Активность МКА в реакции нИФ 61
6.2.2. Активность МКА в реакции ИФА 61
6.2.3- Субтипирование Ig, представляющих МКА 61
6.2.4. Способность МКА подавлять инфекционную активность ВПГ в реакции нейтрализации 62
7. Определение летальной дозы ВПГ 63
8. Трансфекция in vitro 63
9. Генетическая иммунизация in vivo 63
9.1. Изучение динамики клеточного и гуморального иммунного ответов на введение плазмиды pDNAgD, содержащей ген gD ВПГ 1 63
9.2. Исследование действия ФНО на иммунный ответ при иммунизации животных pDNAgD 74
9.3. Исследование адъювантного действия ГМ-КСФ на ДНК-иммунизацию мышей против герпетической инфекции 83
9.4. Влияние ГМДП на иммунный ответ при ДНК-иммунизации против вируса простого герпеса 87
9.5. Исследование адъювантного действия препарата Гепон на ДНК- иммунизацию животных против ВПГ-инфекции 93
Обсуждение результатов исследований 99
- Пути передачи ВПГ
- Животные
- Характеристика МКА
- Исследование действия ФНО на иммунный ответ при иммунизации животных pDNAgD
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вирус простого герпеса (ВПГ) является причиной многих тяжелых заболеваний человека, проявляющихся в виде воспалительных поражений различных органов и тканей (герпетического кератита, энцефалита, уретритов, вагинитов). Большинство людей вступают в контакт с ВПГ1 в раннем возрасте (в 3 года - 6 лет). В 99% случаев после контакта у иммунокомпетентных детей клинические симптомы не развиваются, но в сыворотке можно обнаружить антитела. К 13-14-летнему возрасту, в среднем, инфицировано уже 70-83% детей, в возрасте 50 лет и старше антитела к ВПГ1 и/или 2 типа выявляются уже у 90% населения (1). В США от ВПГ1 и 2 страдает более 150 млн. человек, и ежегодно инфицируется еще около 0.5 млн. человек (218, 142). В России ввиду отсутствия должной выявляемости и учета показатель заболеваемости генитальным герпесом (ВПГ2) составил в 1996 -1999 гг. лишь 11-16 случаев на 100 тыс. населения (против 80-200 случаев на 100 тыс. населения за рубежом) (43). По данным опубликованных работ инфицировано ВПГ1/2 около 22 млн. человек (24), Можно предположить, что эта цифра занижена в 5-10 раз.
В настоящее время имеется большое количество лекарственных препаратов для лечения герпетической инфекции, однако заболеваемость, вызванная ВПГ1 и ВПГ2, продолжает расти. Существующая в нашей стране противогерпетическая вакцина на основе инактивированного вируса прошла успешные испытания, однако, при ее применении, существует вероятность реактивации вируса в случае его неполной инактивации (7). В зарубежных странах разрабатывают вакцины против герпеса с использованием различных подходов. Один из них основан на получении индивидуальных рекомбинантных вирусных белков. Как показали испытания в США, субъединичные вакцины на основе вирусных белков обеспечивают лишь частичную защиту от первичного заражения и приводят к незначительному сокращению рецидивов заболевания у людей, страдающих генитальным -8-герпесом (200). Это стимулирует дальнейшее развитие альтернативных подходов, одним из которых является генетическая иммунизация и создание ДНК-вакцин. ДНК-иммунизация основана на использовании ДНК-конструкций, кодирующих специфические иммуногены. В качестве специфического иммуногена в нашей работе использовался поверхностный гликопротеин gD ВПГ, так как он играет важную роль во взаимодействии вируса с клетками-мишенями и содержит эпитопы, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Одним из важных компонентов вакцинных препаратов являются адъюванты. Преимущество ДНК-вакцин состоит в возможности комбинирования ДНК-конструкций с другими генами, например с генами цитокинов, что по имеющимся данным позволяет существенно повысить уровни как Т-клеточного, так и гуморального иммунного ответов. Перспективными компонентами ДНК-вакцин могли бы быть также новые синтетические иммуномодуляторы, в том числе отечественные, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Разработка вакцин на основе новых биотехнологических подходов позволит предотвратить заболевания, вызванные ВПГ 1/2.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось изучение иммунного ответа и протективных свойств ДНК-конструкции, содержащей ген белка gD ВПГ, и сравнительный анализ адъювантных свойств двух генов - гена фактора Некроза опухоли (TNF) и гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), а также двух синтетических пептидов - глюкозаминил-мурамилдипептида (ГМДП) и Гепона.
Для достижения цели ставились следующие задачи:
1. Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела (МКА), взаимодействующие с белком gD ВПГ1.
Изучить способность ДНК-конструкции на основе гшазмиды pcDNA-3.1(+), содержащей ген gD ВПГ1 (pDNAgD), экспрессироваться в эукариотических клетках линии Vera.
Провести сравнительный анализ эффективности различных способов введения pDNAgD in vivo и определить наиболее эффективный способ введения плазмидной конструкции pDNAgD.
Исследовать показатели Т-клеточного и В-клеточного иммунных ответов на ДНК-иммунизацию pDNAgD, установить сроки формирования их максимальных уровней, и длительность циркуляции противовирусных антител в крови иммунизированных животных.
Провести сравнительный анализ адъювантных свойств 2-х ДНК-плазмид, содержащих ген TNF (pDNATNF) и ген GM-CSF (pDNAGM-CSF), и 2-х синтетических пептидов ГМДП и Гепона.
6. Изучить защитный эффект ДНК-иммунизации pDNAgD, проведенной совместно с изученными адъювантами.
Научная новизна и практическая значимость.
Получены гибридомы, продуцирующие МКА, взаимодействующие с белком gD ВПГ1 и ВПГ2.
Показано, что внутримышечная ДНК-иммунизация pDNAgD приводит к формированию более высоких уровней Т-клеточного ответа, чем подкожное введение ДНК.
Показано, что использование в качестве адьювантов при ДНК-иммунизации pDNAGM-CSF и ГМДП приводит к повышению защитного эффекта однократной иммунизации pDNAgD с 63% до 96-100%.
Установлено, что усиление Т-клеточного и В-клеточного иммунных ответов in vitro, происходящее под действием pDNATNF при ДНК-иммунизации, не приводит к усилению защитного эффекта in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. МКА, полученные в ходе работы, направлены к белку gD ВПГ и активно взаимодействуют с ВПГ1 и 2 в иммунохимических,
Ф иммунологических и вирусологических реакциях.
2. Показана способность полученных МКА выявлять белок gD in situ в эукариотических клетках, трансфицированных ДНК-конструкцией pDNAgD in vitro, а также в клетках, инфицированных ВПГ 1/2.
3. Установлена оптимальная схема введения pDNAgD in vivo. Определены сроки формирования максимальных уровней Т- и В-клеточных иммунных ответов и длительность циркуляции анти-ВПГ1 антител.
4. Проведен сравнительный анализ адъювантных свойств белка TNF (мФНО), pDNATNF, pDNAGM-CSF, ГМДП и Гепона и установлено, что pDNAGM-CSF и ГМДП существенно повышают эффективность защиты животных от заражения летальными дозами ВПГ1.
Пути передачи ВПГ
Воротами инфекции служат слизистые оболочки и кожа. После инфицирования ВПГ восходит по периферическим нервам до ганглиев, где и сохраняется пожизненно. При латентной форме ВПГ-1 персистирует в ганглии тройничного нерва, а ВПГ-2 — в ганглиях крестцового сплетения. При активации вирус распространяется по нерву к первоначальному очагу поражения. Основными путями передачи вируса являются: воздушно-капельный; половой; трансплацентарный; контактный (чаще при поцелуе). Не исключена передача вируса бытовым путем. Заражение происходит при поцелуе, а также через игрушки и предметы обихода, одежду, но реализуется гораздо реже. Встречаются случаи инфицирования при лечении зубов и выполнении медицинских процедур. Медицинский персонал может инфицироваться при осмотре и проведении оперативных вмешательств (установлено, что ВПГ сохраняет жизнеспособность на резиновых перчатках и инструментах в течение нескольких часов). Строение ВПГ. ВПГ-1 и ВПГ-2 имеют размер от 120 нм до 200 нм и около 50% идентичных участков. Состоят из трех основных компонентов; нуклеоида, расположенного в центральной части; капсида, покрывающего нуклеоид и имеющего форму икосаэдра (капсид содержит 162 капсомера); липидной оболочки, в которую заключены указанные структуры. Между капсидом и липидной оболочкой находится белковый слой - тегумент. Геном представлен линейной двухнитевой ДНК большого размера, в среднем, 150 kb, и способен кодировать свыше 60 генных продуктов. Обнаружены ферменты (в том числе протеинкиназа), ассоциированные с мембранами. В составе вирионов обнаружены более 30 полипептидов, в том числе гликопротеины gA, gB, gC, gD, gE, gG и другие, находящиеся на наружной поверхности гликолипидной оболочки. Основными иммуногенами являются gB, gC, gD и gH-gL, индуцирующие нейтрализующие антитела. Это явилось основной причиной использования поверхностных белков ВПГ при создании субъединичных вакцин (99). 2.4 Взаимодействие вируса с клеткой. Синтез вирусных белков начинается через два часа после заражения, максимальное их количество накапливается через 8 часов. Вирионы появляются через 10 часов. Вирус реплицируется в ядре клетки.
При прохождении через ядерную мембрану в эндоплазматический ретикулум он приобретает гликопротеидную оболочку. В действительности, приблизительно за 10 часов вирус проходит довольно сложный жизненный путь, который включает следующие этапы: адсорбция и слияние с мембраной клетки хозяина; раздевание и разрушение вириона; проникновение в клетку; синтез ДНК, белков и сборка вирусных частиц; освобождение вирусных частиц из клетки. Вирус проникает в клетку путем пиноцитоза. В этом участвуют специфические вирусные гликопротеины, находящиеся на поверхности клетку, необходимо взаимодействие белка gD ВПГ с одним из высокоаффинных рецепторов на клеточной поверхности (69). Первым охарактеризованным рецептором для gD является молекула, названная HveA (посредник входа ВПГ А). Это тримерная молекула, входящая в семейство рецепторов ФНО, также известная под названием TNFR14 или HVEM (153). Физиологическим лигандом HveA являются ФНО-подобные молекулы LIGHT и лимфотоксин - аЗ (180). HveA может проводить внутрь клетки ко-стимуляторные или апоптотические сигналы (196) посредством своего цитоплазматического домена (140). HveA экспрессируется на клетках лимфоидного ряда, моноцитах и дендритных клетках (89). Все эти клетки могут быть инфицированы ВПГ, в них вирус реплицируется и повреждает их (150). Второй класс рецепторов для белка gD включает некоторые белки, которые являются представителями суперсемейства иммуноглобулинов, называемые нектинами (в том числе нектин - 1а, или HveC и нектин - 2 или HveB)(67), Это - трансмембранные белки, которые могут служить в качестве гомофильных молекул адгезии. Существует несколько изоформ нектинов. HveC экспрессируются на сенсорных нейронах (102), вследствие этого они участвуют патогенезе нейрональной инфекции. При слиянии вируса с плазматической мембраной и стенкой вакуоли удаляется липопротеидная мембрана, и освобожденный нуклеокапсид транспортируется к ядерным порам. Вирусная ДНК попадает в ядро, где с помощью клеточных и вирусных ферментов происходит ее депротеинизация, а затем транскрипция и репликация. Транскрипция мРНК происходит с помощью РНК-полимеразы 2. Продуцируется 80 или более мРНК, но только 4 из них подвергнуться в дальнейшем сплайсингу. Вирус индуцирует синтез ряда клеточных ферментов. В цитоплазме синтезируется около 50 вирусспецифических белков, большая часть из которых превращается в структурные вирусные белки. Синтезированные белки транспортируются в ядро и, связываясь с определенными участками геномной ДНК, регулируют включение синтеза мРНК для следующей группы белков. Транскрипция имеет регулируемый каскадый механизм и может быть подразделена на 3 фазы а, р и у. Транскрипция а генов, также называемых сверхранними генами, происходит непосредственно на входе ДНК в ядро. Известно несколько сверхранних белков, таких как ICPO (ICP - внутриклеточный белок), ICP4, ICP22, ICP27 и ICP47, Эти белки играют регуляторные роли в вирусной репликации и необходимы для активации р генов, ICPO, ICP4 и ICP27 активируют экспрессию Р генов и блокируют сплайсинг клеточной пре-мРНК. Функции ICP22 - не известны. ICP47 - блокирует презентацию антигенов цитотоксическим Т-клеткам. р гены кодируют белки, необходимые для репликации ДНК, которые включают ДНК полимеразу, праймазу, ДНКазу, тимидинкиназу, рибонуклеазу, урацил ДНК гликолазу, сШТРазу, протеикиназу и др. Синтез белков кодируемых Р генами, ведет к репликации ДНК. Продукция белков происходит через 1-3 часа после инфицирования (110). Репликация ДНК необходима для транскрипции у генов, которые кодируют белки, входящие в состав новых вирионов (более 30 белков). Гены, кодирующие белки gD и gB, экспрессируются через 3-5 часов после инфицирования и максимально воздействуют на клетку посредством ингибирования синтеза ДНК. Экспрессия генов белка gC происходит на поздних стадиях после инфекции и подавляется в присутствии эффективных концентраций ингибиторов синтеза ДНК (143).
Животные
Опыты проводили на мышах линии BALB/c, самках с массой тела 18-22 г, полученных из Центрального питомника лабораторных животных "Крюково" РАМН. 5.3 Вирус и клетки. ВПГ1, референс-штамм F, любезно предоставленный профессором L. Pereira (США), поддерживали путем пассирования на культуре клеток Vero, выращиваемых на среде Игла ("ICN", США), содержащей 10% ЭТС ("ПАНЭКО", Россия), 2мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина в атмосфере 5% СОг. В качестве ростовой среды для культивирования спленоцитов использовали среду RPMI-1640 ("ICN", США), содержащую 15-20% ЭКС, 4.5 г/л глюкозы, 2мМ глутамина, 0.2 ед./мл инсулина, 50мкг/мл гентамицина. Концентрирование вируса проводили путем центрифугирования цитоплазматической фракции зараженных клеток Vero в течение 2 часов при 12000 об/мин. на центрифуге Beckman J2-21 М/Е, ротор JA-14. Инфекционную активность вируса определяли в тесте бляшкообразования и выражали в бляшкообразующих единицах на 1 мл (БОЕ/мл). 5.4 Определение летальной дозы ВПГ1 проводили путем заражения животных последовательными разведениями вируса (цельный вирус, 10"1, 10" 2, 10"3, 10 4), внутрибрюшинно, по 1 мл, согласно методике Маклейна и Хакретта (12). Смертность животных учитывали в течение месяца после заражения. Расчет летальной дозы ВПГ1 проводили по формуле: LD = Ci-50/Ci-C2» где Сі = % мышей, павших при максимальном разведении, давшем летальность выше 50% - 50 С2 = % мышей, павших при минимальном разведении, давшем летальность ниже 50% 5.5 Иммуноген (плазмида pDNAgD). В качестве специфического вирусного иммуногена использовали плазмиду pcDNAgDHSV, любезно предоставленную проф. D. Emanuel, США. Плазмида была получена на основе коммерческой плазмиды pcDNA-3.1(+) ("Invitrogen", США), в которую был встроен ген gD ВПГ и маркерный ген пео (неомицин-фосфотрансферазы).
Плазмидную ДНК, содержащую ген gD (pDNAgD), получали, трансформируя клетки Е. coli, и очищали, используя набор "Qiagen maxiprep kit" ("Qiagen Inc.", США). 5.6 Выделение рекомбинантного фактора некроза опухолей мышей (мФНОа). Клетки E.coli штамма SG 20050 трансформировали плазмидой pmTNF (49), содержащей ген мышиного TNFa под контролем триптофанового промотора. Рекомбинантный белок выделяли двукратной хроматографией как описано ранее (50). Концентрацию очищенного препарата определяли, используя Protein assay kit ("Bio-Rad", США), биологическую активность устанавливали в стандартном тесте как описано (130). 5.7 Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного TNFa. Данный раздел работы был выполнен совместно с сотрудниками ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Л,Н. Шингаровой, О.В. Некрасовой и Е. Ф. Болдыревой. Клетки селезенки мышей активировали конканавалином А и выращивали 24 часа при 37С. Суммарную мРНК выделяли при помощи Trizol Reagent по методике производителя ("Gibco BRL", США). pDNA получали, используя RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit ("Fermentas", Литва) в присутствии ген-специфичных праймеров CCTCAGCGAGGACAGCAAGGG к 5 -концу гена и TCAGAGTAAAGGGGTCAGAGTG к 3 -концу гена. Амплификацию гена мФНОа проводили на матрице кДНК с праймерами GTTCTGGCTAGCTCACTCACTGGCCCAAGG и ACCCAGAATTCTCACAGAGCAATGACTCC, содержащими сайты узнавания Nhel и EcoR I, соответственно. Продукт амплификации обрабатывали этими рестриктазами и клонировали в плазмиду pcDNA3.1 (+) ("Invitrogen", США), обработанную Nhel и EcoR І. В результате получили плазмиду pcmTNF, в дальнейшем обозначаемую как pDNATNF; ее строение подтверждали рестриктным анализом и определением нуклеотидной последовательности участка ДИК, клонированного при помощи ГИДР. Секвенирование проводили по методике с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit ("Fermentas", Литва). 5.8 Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного гранул оиитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF). Клетки селезенки мышей активировали конканавалином А (конА) и выращивали 24 ч. при 37. Суммарную мРНК выделяли при помощи Trizol Reagent (Gibco BRL, США) по методу (81). pDNA получали используя RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва;. В реакции использовали 1/10 часть выделенной суммарной РНК и ген-специфический праймер 5 -CCTCCTCrCG C?GCTGGATTCAGAGCTGGCCT [1], содержащий участок, комплементарный 3 -концевой области mRNA, расположенной за пределом терминирующего кодона гена gm-csf. (выделено жирным шрифтом) и сайт узнавания рестриктазы Xhol (выделена курсивом) для последующего клонирования. Амплификацию гена проводили на матрице кДНК с праймерами: 5 -GTCCTGGC7WGCATGTGGCTGGAGAA [2].
Праймер [2] содержит последовательность, соответствующую 5 -концевой области гена (выделена жирным шрифтом), ATG- кодон и последовательность узнавания Nhel (выделена курсивом). Амплификацию гена проводили в объеме 100 мкл. Реакционная смесь содержала 10 нг cDNA, по 30 пмолей праймеров, смесь dNTP (по 0.2 тМ каждого), 10 тМ Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM КС1, 2.5 тМ MgS04 , 2.5 ед.акт. Pfu ДНК-полимеразы (Stratagene) и 1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы (Fermentas). Проводили 25 циклов по схеме: 95вС/40 сек, б2еС/40 сек, 72С/1 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосы длиной около 480 п.о. вырезали, ДНК экстрагировали из геля, обрабатывали рестриктазами Nhel и Xhol и клонировали в плазмиду pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, США), обработанную этими же рестриктазами. В результате получили плазмиду pCgmcsf2; ее строение подтверждали рестриктным анализом и определением нуклеотидной последсвательности участка ДНК, клонированного при помощи ГЩР. Секвенирование проводили по методике и с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit (Fermentas, Литва). 5.9 Трансфекция in vitro. Для получения генетически трансформированных клеток, экспрессирующих белок gD ВПГ1 использовали перевиваемую клеточную линию Vero, чувствительную к данному вирусу. Для трансфекции клеток использовали коммерческую плазмиду pcDNA-3.1(+) "Invitrogen" (США), в которую был встроен ген gD ВПГ и маркерный ген неомицин-фосфотазы. Трансфекцию клеток Vero осуществляли стандартным кальций — фосфатным методом. Селекцию трасформантов проводили в культуральной среде, содержащей - генетицин G-418 в концентрации 400 мкг/мл (125). После трансфекции клетки фиксировали в разные сроки и изучали экспрессию гена gD методом непрямой иммунофлюоресценции (нИФ), при помощи оригинальных МКА к белку gD, клон 4g8, получение которых описано выше.
Характеристика МКА
В этой главе приведены данные, полученные при изучении активности взаимодействия МКА с белками ВПГ1, а также другие иммудохимические характеристики МКА. 6.2.1. Активность МКА в реакции нИФ. Активность взаимодействия полученных МКА с ВПГ1 в нИФ представлена в таблице 1. Данные таблицы показывают, что все изученные МКА способны окрашивать клетки Vero, инфицированные ВПГ1. Окраска локализовалась в цитоплазме, В качестве отрицательного контроля использовали незараженные клетки Vero. Активность изученных МКА в реакции нИФ была неодинаковой и отличалась в 2-12 раз. Наибольшей активностью обладали МКА, продуцируемые клонами 3f4 и 2с9. Антитела 4g8 к rgD были использованы в последующих опытах по трансфекции клеток in vitro, плазмидой, содержащей ген белка gD ВПГ. 6.2.2 Активность МКА в реакции ИФА. Было показано, что 5 клонов продуцируют МКА, обладающие активностью в ИФА (таблица 1). Активность МКА 2g9 оказалась низкой. Единственным клоном, отобранным на rgD ВПГ, был клон 4g8. МКА этого клона обладали наибольшей активностью в ИФА. 6.2.3 Субтипирование Ig, представляющих МКА. Данные определения класса и субкласса тяжелых цепей в составе Ig, синтезируемых гибридомными клеточными линиями, приведены в таблице 1. Было показано, что все МКА принадлежали к классу IgG. 5 из 6 МКА принадлежали к субклассу IgGl и только 2g9 - к субклассу IgG2b. Так как важным свойством противовирусных антител является их способность нейтрализовать инфекционную активность вируса, МКА были изучены в реакции биологической нейтрализации in vitro. Проведенные опыты показали, что МКА 4g8 и 3f4 обладают вируснейтрализующей активностью. Оба МКА полностью подавляли репликацию вируса в клетках Vero, индекс нейтрализации (обратное разведение сывороток, при котором ЦПД подавляется на 50%) составлял 40 усл. ед. Определение летальной дозы ВПГ1. Определение летальной дозы образцов ВПГ1, использовавшихся в опытах на животных, проводили на мышах линии BALB/c. Для этого формировали 5 групп животных. Результаты титрования ВПГ1, а также количество выживших и павших мышей представлены в таблице 2. Расчет, проведенный по формуле, указанной в разделе Материалы и методы, показал что, инокулят содержал 1 х 102+0,2 = 102,2 LD50 =160 ЫЭ5о/мл. Глава 8. Трансфекция in vitro. Опыты по трансфекции клеток Vero показали, что появление клонов трансфицированных клеток происходит на третьи сутки после введения чужеродной ДНК и селекции в присутствии генетицина G-418.
На пятые сутки после трансфекции 37% клонов содержали белок gD ВПГ в цитоплазме, который определяли методом нИФ. На восьмые сутки после трансфекции количество трансформированных клонов составило 75%. На 15 сутки после внесения чужеродной ДНК и ведения клеток в селективной среде, все оставшиеся клоны продуцировали белок gD (100%). Полученные данные указывают на способность конструкции pcDNAgD ВПГ трансфицировать клетки Vero. Была показана экспрессия гена gD, встроенного в бактериальную плазмиду, в генетически трансформированных клетках млекопитающих. В первой части работы была отработана схема введения pDNAgD ВПГ и изучена динамика иммунного ответа на инъекцию данной конструкции. Плазмидную ДНК вводили внутримышечно в четырехглавую мышцу бедра задних лап по 50 и 100 мкг, подкожно - в подушечки задних лап и основание хвоста по 10 и 20 мкг, а также в область подключичных и ягодичных лимфатических узлов, по 50 мкг на животное. В каждой группе было по 5 мышей. Сравнительный анализ иммунного ответа показал, ч о наилучшие показатели наблюдаются при внутримышечном введении pDNAgD (рисунок 1). На основании полученных данных в дальнейших экспериментах, использовалось преимущественно внутримышечное введение pDNAgD. Для изучения динамики иммунного ответа использовали 3 группы по 9 животных в каждой. Животных иммунизировали внутримышечно в четырехглавую мышцу бедра, каждой лапы по 50 мкг плазмиды pDNAgD разведенной в PBS и подкожно - 10 мкг, в основание хвоста. Мышам первой группы пДНК вводили однократно, второй группы - дважды и третьей группы - трижды с интервалами в 21 день между инъекциями. Кровь для изучения специфических антител к ВПГ1 брали через I, 2, 3 недели после первой иммунизации, через 1,2 недели после второй и через 1, 2 недели после третьей иммунизации. Было показано, что через одну неделю после однократной иммунизации специфическая активность антител к ВПГ1 практически отсутствовала (рисунок 2), затем постепенно нарастала и через три недели превосходила контрольный уровень в 9 раз (титр AT 1/450). Повторное введение ДНК приводило к дальнейшему увеличению уровня антител к ВПГ 1, который достигал максимальных значений через две недели после второй инъекции. После третьей иммунизации увеличения активности антител не наблюдалось. Таким образом, максимальная активность гуморального ответа достигалась через две недели после повторного введения pDNAgD. При исследовании уровня вируснейтрализующей активности антител (ВНА) к ВПГ1 было установлено, что ВНА содержались в сыворотке только вводного животного, иммунизированного дважды, их титр был невысоким -1/40. Для выяснения длительности циркуляции противовирусных антител к ВПГ 1 в крови иммунизированных pDNAgD животных мышам вводили ДНК дважды по 100 мкг внутримышечно. Кровь на исследование брали каждую неделю после второй инъекции плазмиды. Установлено, что со временем уровень противовирусных антител снижается, циркуляция антител в крови животных продолжается около трех месяцев, после чего AT практически не выявляются (рисунок 3). Таким образом, было установлено, что длительность гуморального иммунного ответа, возникающего на двукратное введение pDNAgD, составляет 3 месяца. Исследование динамики активации Т-клеток показало (рисунок 4), что наибольший пролиферативный ответ Т-клеток на стимуляцию ВПГ1 наблюдался через две недели после однократной инъекции ДНК, когда количество бластов в селезенке у иммунизированных мышей в 9 раз превышало таковое у контрольных, не иммунизированных животных.
После второй иммунизации количество бластов в популяции спленоцитов было достоверно ниже, хотя и превышало контрольный уровень в 4 раза. После 3-ей иммунизации ответ снижался до уровня, не превышающего контрольный. Таким образом, максимальная активация ВПГ1- специфических Т-лимфоцитов была отмечена через 2 недели после однократной иммунизации pDNAgD. На основании полученных данных в последующих опытах изучали параметры иммунного ответа через 2 недели после однократной и двукратной ДНК-иммунизаций. Для исследования протективных свойств конструкции pDNAgD мышей заражали ВПГ1 в дозе 160 LD5o через три недели после однократного или двукратного введения pDNAgD. Использовали по 10-30 животных в каждой группе. При однократной иммунизации в контрольной группе (животные, которым вводили физиологический раствор) уже через 2 дня после заражения ВПП у всех животных проявлялись симптомы герпетической инфекции, такие как ВПГ-специфическое поражение глаз, вялость, неровная походка, 3 мыши из 10 пали. Через 4 дня все мыши контрольной группы погибли. В группе животных, иммунизированных pDNAgD, от герпетической инфекции в течение 20 дней погибло 37% мышей, у выживших симптомы болезни отсутствовали на протяжении всего периода наблюдения (60 дней). После двукратного введения pDNAgD, и последующего заражении мышей 160 LD50 ВПГ1 через три недели, все животные остались живы. Симптомы ВПГ-инфекции у них не наблюдались. Таким образом, было показано, что двукратная иммунизация pDNAgD полностью защищает мышей от герпетической инфекции. Для сравнения показателей иммунного ответа при ДНК-йммунизации и при иммунизации животных рекомбинантым белком gD был проведен следующий эксперимент. Животных первых двух групп иммунизировали pDNAgD (по 100 мкг внутримышечно), животных третьей и четвертой групп -белком gD (по 2 мкг внутримышечно), однократно и двукратно. Результаты представлены в таблице 3. Они показали, что пролиферативный Т-клеточный ответ при однократной иммунизации pDNAgD достоверно превышал таковой в группе мышей, иммунизированных белком gD, в 3.6 раза. После второй иммунизации Т-клеточный ответ у животных, которым вводили ген gD, также был выше в 2.6 раза (р 0.05). При исследовании уровня специфических анти-ВПГ AT, было установлено, что изменение данного показателя у животных, иммунизированных как pDNAgD, так и белком gD, находились на одном уровне.
Исследование действия ФНО на иммунный ответ при иммунизации животных pDNAgD
Следующая часть работы была направлена на выяснение адъювантной активности ФНОа. В первой серии экспериментов сравнивали В- и Т-клеточный ответы мышей, иммунизированных pDNAgD и pDNAgD + белок ФНОа. Рекомбинантный мышиный белок ФНОа (мФНО) вводили внутрибрюшинно по 0.1 мкг на животное. В работе Шестопалова А.М. с соавторами (48) было показано, что эта концентрация ФНО не оказывает токсического действия на животных и не вызывает у них отрицательных последствий. В каждом опыте данной серии использовали по три животных в каждой группе. Для определения гуморального ответа сыворотки мышей в каждой группе объединяли. Опыты показали, что после однократного одновременного введения pDNAgD и мФНО активность антител к ВПГ1 практически не изменялась по сравнению с введением pDNAgD, оставаясь на низком уровне (титр анти-ВПГ1 - 1:200), и стимуляция Т-клеток отсутствовала (ИСП-1.2). Можно было предположить, что отсутствие адъювантного эффекта ФНОа при ДНК-иммунизации связано с неоптимальным сроком введения цитокина. Для проверки этого предположения была проведена вторая серия экспериментов, в которой белок мФНО вводили в той же концентрации за 1 сутки до ДНК-иммунизации, совместно с pDNAgD, через 2 суток и через 5 суток после однократного введения плазмиды. ЙФА показал, что титр антител к ВПГ1 превышал таковой у мышей, иммунизированных pDNAgD, только при введении мФНО через 5 суток (1:100 и 1:200 соответственно). В то же время Т-клеточный ответ различался (рисунок 5): при совместном введении и через 2 суток после ДНК-иммунизации ИСП Т- клеток был равен 1.1 и 0.7, соответственно. При инъекции мФНО за 24 часа до pDNAgD ИСП составил 4.2; при введении через 5 суток после pDNAgD - 7.2. Стимуляция Т-клеток у мышей, иммунизированных pDNAgD без мФНО, в данном опыте характеризовалась ИСП, равным 7.9 (рисунок 5, таблица 4). Таким образом, белок ФНОа, введенный через 5 суток после ДНК-иммунизации, существенно не влиял на параметры В- и Т-клеточного ответа на ДНК-иммунизацию по сравнению с введением одной pDNAgD, тогда как введенный в другие изученные сроки - подавлял стимуляцию Т-клеток к пролиферации. В дальнейших экспериментах для более детального изучения иммунного ответа использовали введение мФНО через 5 суток после иммунизации pDNAgD. Представляло интерес оценить действие белка ФНОа на иммунный ответ животных, иммунизированных инактивированньш вирусом.
Было установлено, что после однократного совместного введения 50 мкг ВПГТ и 0.1 мкг мФНО внутрибрюшинно активность антител увеличивалась в среднем в 2 раза и стимуляция Т-клеточного - в среднем в 4 раза по сравнению с ответом на ВПГ1 (таблица 4), Следующая серия опытов была посвящена изучению иммунного ответа на ДНК-иммунизацию, при которой в качестве иммунного адъюванта была использована ДНК-плазмида, содержащая ген белка ФНО мыши (pDNATNF). Мышей иммунизировали, вводя одновременно по 100 мкг pDNAgD и по 100 мкг pDNATNF (по 200 мкг ДНК на мышь). Иммунный ответ анализировали дважды: через 2 недели после однократной иммунизации и через 2 недели после повторного введения. Сравнивали с иммунным ответом животных, иммунизированных каждой из pDNA отдельно. Данные, представленные в таблице 4, показали, что активность антител к ВПГТ после однократной иммунизации плазмидой pDNAgD и двумя плазмидами была приблизительно одинаковой и достоверно не отличалась от активности анти-ВПГ1 в сыворотках неиммунных животных и мышей, иммунизированных pDNATNF. После второй иммунизации титры антител значительно возросли как после введения pDNAgD, так и после совместного введения pDNAgD + pDNATNF, причем в последнем случае активность антител была приблизительно в 4 раза выше, чем после введения одной pDNAgD. Более высокие показатели были выявлены также при анализе ответа Т-клеток. Так, после совместного введения двух плазмид было обнаружено превышение ИСП по сравнению с введением одной pDNAgD как после первой, так и после второй иммунизации (таблица 4). Следует отметить, что при введении животным 100 мкг одной pDNATNF стимуляции гуморального и пролиферативного Т-клеточного ответов не происходило. Таким образом, использование пДНК, содержащей ген белка ФНОа, позволило усилить специфический ответ на ДНК-иммунизацию обоих звеньев иммунитета. В дальнейших экспериментах иммунный ответ на ДНК-иммунизацию был изучен более подробно. Было установлено, что активность антител после второй иммунизации возрастала во всех вариантах опыта (таблица 4), при этом наибольший эффект достигался после повторного введения pDNAgD и особенно - после инъекции двух плазмидных ДНК совместно. Следует отметить, что иммунизация инактивированным вирусом индуцировала высокую активность антител уже после первого введения, а дополнительное введение белка ФНОа увеличивало этот показатель в 2 раза. Анализ ВНА показал, что максимальная способность антител предотвращать цитопатическое действие ВПГТ в культуре клеток наблюдалась в группе мышей, иммунизированных ВПГ1 совместно с мФНО (таблица 4), Меньшую, но достоверную активность проявили ВНА в сыворотках крови мышей, однократно иммунизированных ВПГ1 и pDNAgD без мФНО. При введении мФНО -pDNAgD и pDNATNF+pDNAgD активность ВНА находилась на низком уровне или отсутствовала (таблица 4). Это показывает, что мФНО усиливал активность ВНА, индуцированных вирусом, но подавлял их образование при ДНК-иммунизации. Данные сравнительного изучения субклассов ВПГ1 - специфических антител приведены на рисунке бив Таблице 4. Они показали, что в группе мышей, иммунизированных ВПГ1, происходит максимальное увеличение активности анти-ВПП субкласса IgGl по сравнению с контролем (рис.6).
Максимальное увеличение активности ВПГ1-специфических IgG2a наблюдалось в группе мышей, иммунизированных pDNAgD+pDNATNF. Соотношение IgG2a к IgGl (таблица 4) достоверно увеличилось после ДНК-иммунизации как одной pDNAgD, так и в особенности - после второй иммунизации двумя плазмидами. Достоверное увеличение соотношения IgG2a к IgGl обнаружено также в группе мышей, иммунизированных ВПГ1 совместно с мФНО. Количественное определение лимфоцитов, несущих маркеры CD4 и CD8, показало, что через 2 недели после иммунизации во всех вариантах опыта относительное содержание СВ8+-клеток незначительно увеличивалось (таблица 4). После второй иммунизации pDNAgD изменение соотношения CD4+/CD8+ оказалось статистически недостоверным. Был изучен защитный эффект цитокинов, содержащихся в сыворотках крови иммунизированных животных, от действия на клетки негомологичного вируса EMC in vitro. Как видно из данных таблицы 4, наибольшее защитное действие, определяемое главным образом ИФа, было обнаружено в трех группах животных: 1 - иммунизированных ВПГ1 (однократно и двукратно), 2 - ВПГ1 + мФНО и 3 pDNAgD + мФНО. Важно отметить, что защитный эффект сывороток в указанных группах проявлялся практически при таком же разведении (1:64), что и референс-сыворотка, служившая положительным контролем на активность ИФа. Для выяснения вопроса о том, может ли введение дополнительного количества неспецифической ДНК влиять на показатели иммунного ответа, нами был проведен специальный эксперимент. Мышам однократно вводили по 100 мкг pDNAgD или такое же количество pDNAgD в сочетании с векторной плазмидой (рМОСК), не содержащей вставки. Через две недели после инъекции исследовали показатели гуморального и Т-клеточного иммунных ответов. Было установлено, что достоверных изменений в уровнях иммунного ответа при иммунизации одной pDNAgD и pDNAgD в сочетании с ДНК- вектором не происходит (таблица 4). Таким образом, можно заключить, что введение дополнительной дозы ДНК в условиях наших опытов не влияло на показатели иммунного ответа. Кроме этого, отдельной группе мышей вводили одну векторную плазмиду без вставки, по 100 мкг, внутримышечно.
