Введение к работе
Актуальность темы. Разработка гибридомной технологии определила бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей. Созданы десятки тысяч высокоаффинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также с низкомолекулярными антигенами. На их основе получены конъюгаты с различными функциональными соединениями - токсинами, ферментами, а также магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами. Однако все упомянутые выше антитела и их производные широко используются, в основном для целей диагностики и биотехнологии. Их применение для терапии ограничивается тем, что с помощью гибридомной технологии удается получать, главным образом, молекулы мышиных иммуноглобулинов, которые вызывают у человека иммунный ответ, что приводит к их связыванию и удалению из организма (Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006). Создание человеческих гибридом затрудняется из-за сложности получения иммунных лимфоцитов, отсутствия подходящих миеломных клеточных линий, низкой эффективности гибридизации и нестабильности образующихся гибридных клеток. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммуногенности мышиных моноклональных антител (МКА) путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека. Для решения этой проблемы были разработаны подходы, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов антител мыши с константными доменами человеческих антител, "гуманизация" путем замены гипервариабельных районов в молекуле антитела человека на аналогичные участки из мышиного антитела, получение полноразмерных антител человека с помощью трансгенных мышей и технологии фагового дисплея.
В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают химерные антитела. Технология получения химерных антител относительна проста и экономически выгодна, а терапевтический эффект достаточно высок. Именно поэтому в списке рекомбинантных антител, одобренных и разрешенных FDA для терапевтических целей, подавляющее количество антител являются химерными.
На сегодняшний день в клинике используются следующие препараты химерных антител: abciximab (ReoproR: Fab anti-GpIIb/IIIa, Centocor/Eli Lilly) - для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, Rituximab (RitxanR: IgGl anti-CD20, Biogen-IDEC) -для лечения больных неходжкинскими лимфомами, infliximab (RemicadeR: IgGl anti-TNF-a, Centocor) - для лечения ревматоидных артритов и болезни Крона, Basiliximab
'г)
(SimulectR: IgGl anti-CD25, Novartis) - в трансплантологии при отторжении трансплантата, Cetuximab (ErbituxR: IgGl anti-EGRF, ImClone) - для лечения рака прямой кишки (Gavilondo, 2000; Laffly, 2005; Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006).
К настоящему времени получены химерные антитела против ряда вирусных патогенов: вируса иммунодефицита человека (Major, 1994), вируса гепатита В (Preston, 1998; Bose, 2006), С (Law, 2008) и Е (Luo, 2007), вируса Varicella-Zoster (Shankar, 2005). Показано, что химерные антитела могут осуществлять протекцию и нейтрализацию вирусных агентов (Shankar, 2005; Bose, 2006; Luo, 2007).
Одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов на территории Российской Федерации является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать серьезные поражения нервной системы. Современная эпидемическая ситуация в некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока в отношении КЭ характеризуется значительным ростом заболеваемости (Локтев, 2007). Эта закономерность характерна не только для этих регионов России, где регистрируется большая часть случаев заболеваний, но и для многих европейских стран. В настоящее время единственным специфическим средством лечения этого заболевания является гамма-глобулин против вируса КЭ, получаемый из крови иммунизированных людей. Высокая стоимость данного препарата, его дефицит и возможный риск при его применении делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Таким альтернативным средством могли бы стать вируснейтрализующие химерные антитела против вируса КЭ.
Целью данной работы являлось получение вируснеитрализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита и исследование их свойств.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
клонировать гены, кодирующие вариабельные домены тяжелых (Vh) и легких (VL) цепей МКА 13D6 и 10С2 против вируса КЭ и определить их нуклеотидные последовательности;
сконструировать на основе полученных Vh- и Vl-гєнов рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие химерные и одноцепочечные антитела против вируса КЭ;
исследовать иммунохимические свойства полученных химерных и одноцепочечных антител;
исследовать вируснейтрализующие свойства полученных рекомбинантных антител.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе
впервые сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие
продукцию вируснеитрализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса
КЭ в эукариотических клетках и в клетках Е. соН, соответственно. Определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности этих антител. Показано, что одноцепочечное антитело scl3D6 и химерное антитело chl3D6 способны ингибировать инфекционность вируса КЭ в культуре эукариотических клеток. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для одноцепочечного и химерного антител SC13D6 и chl3D6 в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vera Е6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ. Исследованы иммунохимические свойства одноцепочечных и химерных антител. С помощью методов иммуноферментного анализа определены константы аффинности полученных рекомбинантных одноцепочечных и химерных антител.
В ходе данной работы впервые были получены химерные антитела против вируса КЭ, обладающие вируснейтрализующими свойствами. Полученные антитела после проверки их терапевтических свойств могли бы стать основой для разработки препарата для лечения клещевого энцефалита.
Получен стабильный штамм-продуцент растворимых вируснейтрализующих одноцепочечных антител против вируса КЭ, который задепонирован в коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 8 Международных конференциях: 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "The interface between Immunology and Medicine" (Москва, Россия, 2005), 8th International EMBL PhD Student Symposium "Biology of Disease A Molecular Battlefield" (Гейдельберг, Германия, 2006), 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "Immunology and viral infection" (Москва, Россия, 2007), 1st International Summer School 2008 "Pathogen-Host Interplay" (Берлин-Потсдам, Германия, 2008), International Life Sciences Students' Conference (Варшава, Польша, 2008), FEBS Practical Course "Structural variations in genome, gene expression, single cell analysis: arrays, beads, high-throughput sequencing" (Прага, Чехия, 2008), the ІЗ"1 CIMO Winter School "Biomolecules in health and disease" (Хельсинки, Финляндия, 2009), 34th FEBS Congress "Life's Molecular Interactions" (Прага, Чехия, 2009); и одной Российской конференции - III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 38 рисунков и 3 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (141 наименований).
