Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вирусы гриппа H5N1 привлекли внимание широкой общественности в 1997 году, после случаев смертельных заболеваний людей в Гонконге. С вирусом ведется перманентная борьба – уничтожается поголовье птиц в местах вспышек, проводится вакцинация домашней птицы – но все эти меры оказываются недостаточными. По не совсем понятным причинам даже трехкратная вакцинация кур инактивированными вакцинами не предотвращает последующее заболевание и распространение вируса.
Живые гриппозные вакцины требуют значительно меньших количеств антигена, чем инактивированные, вследствие чего они дешевле и, при острой необходимости, могут быть быстро наработаны в достаточных количествах. В последние годы методом обратной генетики создано много экспериментальных живых вакцин путем внесения в геном вируса одного или ряда изменений. Полученные штаммы глубоко аттенуированы, при сохранении хорошей иммуногенности. Однако генетическая стабильность таких конструкций может вызывать сомнения. В случае реассортации, рекомбинации или реверсии может возникнуть вирус с нежелательными характеристиками.
Живая вакцина, не вызывающая такого опасения, должна быть аттенуирована не по одному принципу или одному гену, а, желательно, по всем генам, тогда она не сможет служить причиной возникновения опасных реассортантов.
Цели исследования:
-
Создание аттенуированных штаммов вирусов гриппа H5, которые могут быть использованы в качестве вакцинных продуцентов против H5N1 вирусов гриппа.
-
Сравнение безопасности, иммуногенности и протективности инактивированных цельновирионных и расщепленных вакцин, вакцин с адъювантами, а также экспериментальных живых вакцины.
-
Создание экспериментальной ветеринарной вакцины против H5N1 вирусов гриппа.
Задачи исследования:
-
Получить аттенуированный H5N1 вариант высокопатогенного вируса А/сhicken/Kurgan/3/2005.
-
Получить реассортанты с гемагглютининами Н5 и остальными генами двух доноров аттенуации: холодоадаптированного вируса и апатогенного вируса чайки.
-
Произвести сравнение вирусов с разными гемагглютининами, и полностью совпадающими по остальным генам в качестве экспериментальных вакцин.
-
Изучить на мышах и курах безопасность, иммуногенность и протективную способность инактивированных вакцин, полученных реассортантов и апатогенных вирусов диких уток.
Научная новизна работы
Разработан оригинальный метод «обратной селекции» для аттенуации высокопатогенных вирусов в условиях имитирующих жизненный цикл апатогенных вирусов.
Разработан оригинальный двухступенчатый метод получения реассортантов вирусов гриппа с промежуточной стадией термочувствительного варианта.
На модели мышей впервые показана безопасность и высокая иммуногенность реассортанта с гемагглютинином от высокопатогенного H5N1 вируса А/сhicken/Kurgan/3/2005, аттенуированного методом «обратной селекции» и внутренними генами от холодоадаптированного донора аттенуации.
Впервые изучены, в качестве экспериментальных вакцинных штаммов, конструкции с Н5 гемагглютинином и остальными генами от апатогенного вируса гриппа чайки и апатогенный H5N2 вирус дикой утки целиком.
Практическая значимость работы
Получены аттенуированные реассортанты H5N1 вирусов, перспективные в качестве продуцентов инактивированных и живых вакцин.
Показано, что вирус А/duck/Moscow/4182/2010 (H5N2), выделенный от дикой утки, можно рассматривать как кандидат ветеринарной живой вакцины против высоковирулентных H5N1 вирусов, так как он безопасен для мышей и однодневных цыплят, при этом обеспечивает высокий и равномерный прирост уровня антител и 100% защиту от последующего контрольного заражения высокопатогенным H5N1 вирусом.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Получены холодоадаптированные реассортанты вакцинного штамма A/Vietnam/1203/04-PR8/CDC-RG и аттенуированного штамма А/chicken/Kurgan/3654at/2005 c холодоадаптированным донором внутренних генов А/Leningrad/134/17/57. Оба реассортанта не патогенны для мышей, высокоурожайны на куриных эмбрионах, после однократного инфицирования формируют у мышей протективный иммунитет к вирусу H5. Штаммы можно рекомендовать как продуценты для производства инактивированной и живой вакцины против вирусов гриппа H5N1.
-
Сравнение субъединичных, цельновирионных и живых вакцин вирусов на мышиной модели показало, что субъединичные вакцины, даже при добавлении адъювантов, недостаточно эффективны, цельновирионная вакцина эффективна только при гомологичной вакцинации, в то время как живые вакцины эффективны даже в случае антигенного несоответствия вакцинного и инфекционного вируса гриппа.
-
Получены реассортанты VN-Gull и Ku-Gull (H5N2) с гемагглютининами Н5 и остальными генами от непатогенного вируса A/Gull/Moscow/3100/2006, которые после однократного инфицирования формируют у цыплят и мышей стерильный иммунитет.
-
Показано, что природные апатогенные вирусы гриппа птиц могут быть использованы в качестве доноров аттенуации при создании ветеринарных вакцинных штаммов.
-
Впервые показано, что природный апатогенный H5N2 вирус дикой утки можно рассматривать как кандидат ветеринарной живой вакцины против высоковирулентных H5N1 вирусов.
Личный вклад автора
Выделение природных изолятов и их характеристика; получение реассортантов и изучение их безопасности, иммуногенности и протективной способности in vivo, а так же изучение иммуногенности и протективной активности вируса А/duck/Moscow/4182/2010 на курах проведено Боравлевой Е.Ю. самостоятельно.
Сравнение разных типов вакцин и получение аттенуированного варианта высокопатогенного вируса А/сhicken/Kurgan/3/2005, а также определение нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов вирусов проводилось совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной биологии вирусов гриппа. Определение индекса патогенности вирусов на курах проведено Ильёй Александровичем Чвала, в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.
Внедрение результатов работы
В GenBank депонировано 17 нуклеотидных последовательностей генов вирусов, выделенных либо полученных Е.Ю. Боравлевой.
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы были представлены на:
-
VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней – 2007», Москва, 28-30 ноября 2007.
-
19th Annual Meeting of the Society for Virology in Leipzig, Germany. 18 -21 March 2009.
-
Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», 21–22 декабря 2010 года, Санкт-Петербург.
-
Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты разработки приготовления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий» 23-27 мая 2011г. Ялта, Крым.
-
Конгрессе «Простуда и грипп 2012», Москва, 3-4 октября 2012.
-
Научной конференции «Грипп: эпидемиологии, вирусология. Профилактика и лечение», Санкт-Петербург, 24-25 октября 2012.
-
17-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», г. Пущино, 21–26 апреля 2013года
-
Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013года.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 5 в журналах, входящих в перечень ВАК.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 82 страницах текста, включает 10 таблиц и 10 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 160 источников. Из них 12 отечественных и 148 иностранных.
