Введение к работе
Актуальность работы
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость при ежегодных сезонных эпидемиях, вызванных вирусами гриппа человека, составляет 20-30% у детей и 5-10% у взрослых, численность группы риска может достигать сотен миллионов человек, при этом в развитых странах от гриппа и его осложнений ежегодно погибают от 250 до 500 тысяч человек (WHO, 2002).
В 1997 году в Гонконге были выявлены случаи инфекции людей, в том числе с летальным исходом, вызванные вирусом гриппа птиц серотипа A/H5N1, а к концу 2009 года по данным ВОЗ инфекция, обусловленная этим серотипом вируса, была выявлена у 445 человек, из которых около 60% умерло (WHO, 2009). В связи с этим многими специалистами было высказано опасение о возможном возникновении пандемии у людей, вызванной высоковирулентными вирусами гриппа птиц (Львов Д.К., 2006). Следует также отметить, что участившиеся в последнее время эпизоотии гриппа среди домашней птицы приносят огромный экономический ущерб (Гендон Ю.З., 2006).
Вакцинопрофилактика является одним из основных способов борьбы с гриппом (WHO, 2002). Выделяют сезонные гриппозные вакцины, предназначенные для ежегодной профилактики сезонных эпидемий гриппа, препандемические вакцины для так называемого праймирования населения против возможного пандемического штамма вируса гриппа, а также пандемические вакцины для защиты против пандемического штамма вируса гриппа. В то же время последние препараты не лишены ряда ограничений.
Одно из таких ограничений для препандемических и пандемических гриппозных вакцин связано с тем, что мощности всех производителей гриппозных вакцин недостаточно для проведения иммунизации даже тех групп людей, которых обычно относят к группам риска (WHO, 2006).
Проблема оперативного увеличения мощности производства гриппозных вакцин может быть решена в определенной степени при использовании культур перевиваемых линий клеток для выращивания вакцинных штаммов вирусов гриппа, что, к тому же, может повысить стабильность и стандартность производства (WHO, 2007). Однако многие свежевыделенные штаммы вирусов гриппа, в том числе вирусов гриппа птиц, плохо размножаются в куриных эмбрионах и культуре перевиваемых линий клеток (Wilschut J. et al., 2006). По этой причине весьма важно для каждого штамма вируса, который предполагается использовать в качестве вакцинного, и для каждого субстрата выявить наиболее оптимальные параметры размножения вируса, а также изучить дополнительные условия для усиления репродукции вируса в различных субстратах.
Серьезным недостатком большинства инактивированных гриппозных вакцин является их неспособность защитить от вновь возникающих дрейфовых вариантов вирусов гриппа. Так, при несовпадении антигенной специфичности штамма вируса, содержащегося в сезонной гриппозной вакцине, с новым антигенным вариантом вируса эффективность препарата оказывается крайне низкой (DeJong J. et al., 2000).
Использование адъювантов может повысить иммуногенность и защитную эффективность вакцин против вирусов гриппа и даже повысить защиту от дрейфовых вариантов вируса. В то же время адъювант не должен вызывать неблагоприятные реакции у вакцинируемых (Aguilar J. et al., 2007). Известные в настоящее время адъюванты гриппозных вакцин – производные алюминия (гидроксид алюминия) и сквалена (MF59 и ASO3) – не вполне удовлетворяют этим требованиям (Nicholson K. et al., 2009; Banzhoff A. et al., 2009).
Изучение новых адъювантов гриппозных вакцин, обладающих высокой иммуногенностью и низкой реактогенностью, является одним из актуальных направлений совершенствования инактивированных вакцин против вирусов гриппа, в том числе вирусов гриппа птиц. Одним из таких адъювантов может быть хитозан, который является биосовместимым и биодеградируемым полимером на основе глюкозы (Arca H. et al., 2009).
В последнее время было показано, что массовая вакцинация домашней птицы вакцинами против вирусов гриппа птиц, в частности серотипа H5N1, является не только эффективным способом борьбы с эпизоотиями гриппа птиц, но также практически исключает инфекцию людей этими вирусами (Chen H., 2009). В то же время такие вакцины должны быть простыми и недорогими в производстве, а также способными защищать не только от гомологичного штамма вируса, но также и от дрейфовых вариантов.
Таким образом, сравнительное изучение репродукции вирусов гриппа птиц в культурах перевиваемых линий клеток и куриных эмбрионах, изучение перспективных адъювантов гриппозных вакцин, а также разработка простого способа изготовления инактивированной вакцины против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы являются актуальными направлениями совершенствования инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц, что, кроме того, может быть использовано и при изготовлении аналогичных вакцин для иммунизации людей.
Цель и задачи исследования
Цель исследования – оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в куриных эмбрионах и культуре перевиваемых линий клеток и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц.
В соответствии с поставленной целью задачами настоящего исследования являлись:
1. Изучение и оптимизация репродукции вирусов гриппа птиц в различных субстратах:
– в культуре перевиваемых линий клеток MDCK и Vero;
– в культуре перевиваемых линий клеток MDCK с использованием микроносителя;
– в куриных эмбрионах.
2. Разработка простого способа удаления инактивирующего агента при изготовлении инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц с целью снижения потерь антигена.
3. Изучение иммуногенности и защитной эффективности инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц, вводимых парентерально, при использовании в качестве адъюванта хитозана (опыты на мышах).
Научная новизна работы
Показано, что оптимальные условия размножения штаммов вирусов гриппа птиц различных серотипов в культурах перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, а также в куриных эмбрионах (множественность заражения, время инкубации и концентрация трипсина) являются неодинаковыми для исследованных штаммов. При этом перевиваемые линии клеток MDCK более чувствительны к вирусам гриппа птиц в сравнении с линией клеток Vero.
Впервые показано, что добавление трипсина одновременно с заражением куриных эмбрионов существенно повышает урожай вирусов гриппа птиц как по титрам гемагглютинина, так и инфекционности.
Впервые показано, что добавление к инактивированным препаратам вирусов гриппа птиц в качестве адъюванта хитозана существенно повышает иммуногенность, а также защитную эффективность препарата не только по отношению к гомологичному штамму вируса, но также и к гетерологичным штаммам вирусов гриппа птиц серотипа Н5.
Впервые разработан способ простого и полного удаления инактивирующего агента (формалина) из инактивированных препаратов вируса гриппа птиц без потери антигена (уровня гемагглютинирующей активности), который при одинаковых титрах гемагглютинина повышает иммуногенность инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц против как гомологичного, так и гетерологичных штаммов вирусов гриппа птиц серотипа Н5.
Впервые предложен простой, быстрый и недорогой способ получения инактивированной вакцины против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы с добавлением в качестве адъюванта хитозана, способной индуцировать высокие титры антител против гомологичного и гетерологичных штаммов вирусов гриппа птиц серотипа Н5.
Практическая значимость исследования
Определенные в исследованиях оптимальные параметры размножения ряда штаммов вирусов гриппа птиц различных серотипов (H3, H4, H5, H7) могут быть использованы для повышения урожая вирусов гриппа птиц при изготовлении инактивированных вакцин.
Выявлена бльшая чувствительность к различным штаммам вирусов гриппа птиц линии клеток MDCK в сравнении с линией клеток Vero, что может применяться при лабораторной диагностике вируса гриппа птиц и при изготовлении культуральных вакцин против вирусов гриппа птиц.
Внесение трипсина одновременно с заражением вирусом приводит к существенному увеличению урожая вирусов гриппа птиц и может быть использовано при изготовлении эмбриональных вакцин против вирусов гриппа птиц.
Хитозан, существенно увеличивающий иммуногенность и защитную эффективность инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц против гомологичного и гетерологичных штаммов вирусов гриппа серотипа Н5, является перспективным адъювантом вакцин против вирусов гриппа птиц.
Простой способ удаления формалина из инактивированных препаратов вируса гриппа птиц без потери антигена, при одинаковых титрах гемагглютинина повышающий иммуногенность против гомологичного и гетерологичных штаммов вируса гриппа птиц серотипа Н5, целесообразно использовать при изготовлении вакцин против вирусов гриппа птиц.
Полученные данные могут также использоваться при изготовлении вакцин против вирусов гриппа птиц для иммунизации людей.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих конференциях: V-ой конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); 7-ом конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 2008); 3-ей международной конференции «Influenza Vaccines for the World» (Гриппозные вакцины для мира) (Канны, Франция, 2009); 3-ей международной конференции «Modern vaccines adjuvants and delivery systems» (Современные вакцины и системы доставки) (Вена, Австрия, 2009); итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2010).
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции кафедры общей фармацевтической и биомедицинской технологии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов отдела вирусологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 01 февраля 2010 года.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Объем и структура
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 3-х глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список цитируемой литературы включает 342 отечественных и иностранных источника.
Работа изложена на 242 страницах машинописного текста, иллюстрированного 41 рисунком и 11 таблицами.
