Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из наиболее распространенных вирусов, патогенных для человека и животных, является вирус гриппа А. Он способен вызывать эпидемии и пандемии, сопровождающиеся высокой смертностью. Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, имеет широкий круг хозяев. Вирус гриппа А быстро эволюционирует. Наиболее вариабельны поверхностные гликопротеины вириона, гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA), определяющие иммунный ответ. HA является мишенью для вируснейтрализующих антител, которые играют главную роль в защите от инфекции.
В настоящее время известны 16 антигенных подтипов HA (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9) вируса гриппа А.
В человеческой популяции к настоящему времени циркулируют вирусы гриппа А, HA которых относятся к двум подтипам: Н1 и Н3. Другие подтипы HA (Н2, Н4-Н16) в настоящее время не представлены в человеческой популяции. Поэтому люди не обладают иммунной защитой против вирусов подтипов Н4-Н16, а иммунитетом против вируса подтипа Н2 обладают лица старше 44 лет, так как подтип Н2 циркулировал с 1957 по 1968 гг. Вирус гриппа А, резко отличающийся по антигенной специфичности от вирусов, циркулирующих в человеческой популяции, может рассматриваться как потенциальный источник гена гемагглютинина вирусов будущих пандемий.
В 1918 году появился вирус гриппа А подтипа Н1N1, вызвавший опустошительную пандемию, получившую название «испанки» и унесший не менее 40 миллионов жизней. Вирус гриппа подтипа Н1N1 циркулировал до 1957 года и сменился вирусом Н2N2. С 1957г. по 1968г. циркулировал вирус Н2N2, после 1968 г. – Н3N2. В 1977 году снова стал циркулировать вирус гриппа А Н1N1, но на этот раз вирус Н3N2 не исчез, и эти вирусы циркулировали вместе, поочередно преобладая при сезонных эпидемиях и постепенно дрейфуя.
В начале апреля 2009 года поступило сообщение о вспышке гриппа в Мексике, которая была вызвана новым вирусом гриппа A(H1N1)pdm09, генетический состав которого ранее не регистрировали среди вирусов гриппа свиней и людей. Уже 11 июня в связи с устойчивой передачей вируса в нескольких странах мира ВОЗ объявила о 6-ой, самой высокой, фазе пандемии. Пандемический вирус гриппа A(H1N1)pdm09 появился на фоне сезонной активности эпидемических штаммов и вытеснил их из циркуляции, став доминирующим.
Пандемический вирус возник в результате скрещивания двух вирусов гриппа свиней, классического североамериканского и европейского [Garten et al., 2009]. Новый вирус резко отличается по антигенным свойствам от циркулировавшего в предшествующие годы вируса гриппа А подтипа H1.
Из вирусов гриппа птиц особый интерес представляет вирус подтипа Н5. В 1997 году в Гонконге были отмечены заболевания человека в результате заражения высокопатогенным вирусом гриппа А птиц подтипа Н5N1. С 2004 года в Китае, Камбодже, Вьетнаме, Индонезии, Турции, Египте, Нигерии, Пакистане и других странах зарегистрированы заболевания людей с высокой летальностью, вызванные данным вирусом. К настоящему времени суммарное количество подтвержденных случаев заболевания людей вирусом гриппа Н5N1 насчитывает 602 человека, из которых 355 погибло. С 2005 года эпизоотии среди птиц, вызванные вирусом Н5N1 отмечены в России, Украине и в Центральной Европе. Достоверные случаи передачи вируса от человека к человеку пока не описаны. В связи с отсутствием у людей антител к НА вирусов гриппа А подтипа Н5 и активной циркуляцией их в природе, вирусы этого подтипа обладают потенциалом пандемических агентов. Поэтому детальное исследование антигенных свойств НА подтипа Н5 и, в частности, изучение распределения участков, реагирующих с нейтрализующими антителами, является важной задачей.
После публикации трехмерной структуры НА подтипа Н5 по данным рентгеноструктурного анализа было проведено детальное антигенное картирование молекулы НА подтипа Н5 [Kaverin et al., 2002]. В 2007 году было проведено антигенное картирование трехмерной структуры молекулы НА высоко патогенного штамма вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) [Kaverin et al., 2007]. Данные об особенностях антигенной структуры НА того варианта вируса H5N1, который вызвал вспышки в Европе и Африке (цинхайского варианта), в научной литературе отсутствовали.
Исследование антигенных эпитопов, распознаваемых нейтрализующими антителами, весьма актуально в связи с продолжающейся эволюцией вирусов гриппа А подтипа H5N1, появлением новых антигенных вариантов, и с возможностью в будущем антигенного дрейфа в случае заноса вируса гриппа А подтипа Н5 в человеческую популяцию с последующей постоянной циркуляцией в ней. Изучение антигенных свойств пандемического вируса 2009 года подтипа Н1N1 имеет не меньшую значимость, так как при циркуляции вирус претерпевает дрейф, который надо учитывать при вакцинопрофилактике.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было выявить особенности антигенной структуры НА вируса гриппа А, распознаваемые антителами против современных вариантов вирусов подтипов Н5 и Н1, а также исследовать влияние мутаций, обеспечивающих резистентность к нейтрализующему действию антител, на взаимодействие НА с аналогами клеточных рецепторов.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Получить эскейп-мутанты, резистентные к моноклональным антителам против современных вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н1, и определить их антигенную специфичность в перекрестных реакциях с моноклональными антителами;
-
Провести секвенирование генов НА всех полученных эскейп-мутантов с целью выявления аминокислотных замен в молекуле НА, определяющих их резистентность к моноклональным антителам;
-
Определить локализацию аминокислотных замен, обеспечивающих резистентность к моноклональным антителам, в трехмерной структуре молекулы НА подтипов Н5 и Н1.
-
Провести исследование влияния антигенно значимых аминокислотных замен эскейп-мутантов вируса гриппа А подтипов Н5 и Н1 на сродство к сиалосодержащим синтетическим аналогам природных рецепторов.
Научная новизна и практическое значение работы
В работе представлены результаты антигенного картирования молекулы НА вируса гриппа А подтипов Н5 и Н1, которые отражают ранее не выявленные аспекты антигенной структуры молекулы НА подтипа Н5, а также характеризуют специфичность моноклональных антител, полученных к современным вариантам вирусов гриппа подтипов Н1 и Н5.
Антигенное картирование посредством селекции и характеристики эскейп-мутантов с использованием моноклональных антител против распространенного в странах Африки и Европы цинхайского варианта высокопатогенного вируса подтипа Н5N1 до настоящего времени не было проведено. Данная работа расширяет представление об особенностях антигенной структуры молекулы НА подтипа Н5 и об участках молекулы НА, которые определяют вариации антигенной специфичности в процессе эволюции. Полученные данные впервые описывают распределение антигенно значимых участков в трехмерной структуре молекулы НА, распознаваемых моноклональными антителами против вируса гриппа А подтипа H5N1 цинхайской группы.
В данной работе также проведено антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, штамм A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl. Были выявлены пять аминокислотных позиций в НА, распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами против пандемического вируса гриппа 2009 года подтипа Н1N1, причем некоторые из них вызывали снижение сродства к сиалосодержащим аналогам клеточных рецепторов. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в НА природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф пандемического вируса гриппа H1N1.
Работа имеет преимущественно теоретический характер, но полученные данные в будущем должны будут приниматься во внимание при решении практических проблем. В связи с продолжающейся эволюцией высокопатогенных вирусов гриппа А подтипа H5N1 и их выраженной патогенностью для человека, новые данные по картированию молекулы НА вируса гриппа подтипа Н5, а также сведения об участках НА, реагирующих с моноклональными антителами против наиболее распространенного цинхайского варианта вируса H5N1, будут важны для оценки характера эволюции высокопатогенного вируса гриппа H5N1. Данные об антигенных эпитопах НА вируса гриппа A(H1N1)pdm09 важны для оценки потенциала антигенного дрейфа в ходе будущей циркуляции новых вариантов вируса гриппа А подтипа H1N1.
В ходе выполнения работы был впервые получен высокопродуктивный реассортантный штамм, содержащий гены НА и NA отечественного штамма пандемического вируса гриппа 2009 года. Штамм может найти применение для производства инактивированных и субъединичных вакцин (решение о выдаче патента от 03.05.2012, заявка на патент №2011129286/10 от 14.07.2011, Каверин Н.В., Руднева И.А., Тимофеева Т.А., Шилов А.А., Игнатьева А.В. «Реассортант ReM8 – вакцинный штамм вируса гриппа А подтипа H1N1»).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Антигенное картирование молекулы НА вируса гриппа А подтипа Н5 посредством селекции эскейп-мутантов с помощью антител против высокопатогенного вируса гриппа H5N1, выделенного на территории России, позволяет уточнить и дополнить картину антигенной структуры НА подтипа Н5, а также выявляет область в молекуле НА, распознаваемую нейтрализующими антителами против вируса гриппа подтипа H5N1 цинхайского варианта, распространившемуся в странах Европы и Африки.
-
Вируснейтрализующие моноклональные антитела к НА вируса А/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) распознают не выявленную ранее область в НА, которая определяет вариации антигенной специфичности в процессе эволюции.
-
Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов, резистентных к моноклональным антителам против вируса цинхайской ветви A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), частично совпадают с аминокислотными заменами, выявленными при антигенных вариациях НА подтипа Н5, подобных антигенному дрейфу, что указывает на роль выявленных антигенно значимых аминокислотных позиций при эволюции вируса.
-
Впервые проведенное антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, позволило идентифицировать 5 аминокислотных позиций, распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами в НА вируса A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl. Полученные данные указывают на преимущественную роль ограниченного участка молекулы НА вируса гриппа 2009 года в пределах антигенных сайтов Sa и Sb в индукции вирус-нейтрализующих антител.
-
Определение сродства НА эскейп-мутантов вируса гриппа А подтипов H5N1 и H1N1 к сиалосодержащим синтетическим аналогам клеточных рецепторов выявило влияние аминокислотных замен в области НА, прилегающей к рецептор-связывающему карману.
-
Для НА подтипа Н1 выявлена корреляция изменений степени сродства к сиало-олигосахаридам с изменениями электростатического заряда при аминокислотных заменах, влияющих на взаимодействие НА с нейтрализующими антителами.
-
Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов подтипа Н1 с заменами в НА природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международной конференции молодых ученых, Берлин, Германия, 2010 г, 30-й Ежегодной конференции Американского Общества Вирусологов, Миннеаполис, Миннесота, США, 2010 г.
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития России 24 мая 2012 года.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 2 – в материалах международного конгресса и конференции.
Объем и структура диссертации
Диссертация написана на 166 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, пяти разделов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация содержит 9 схем, 19 таблиц, 6 рисунков и 1 приложение. Список использованной литературы содержит 246 отечественных и зарубежных источников.
