Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы: белки клеточной стенки дрожжей и способы их закрепления 9
Введение 9
1. Компоненты клеточной стенки дрожжей 10
2. Способы ковалентной модификации белков клеточной стенки 13
2.1.1Ч-гликозилирование 13
2.2.0-гликозилирование 14
2.3. GPI-якорь 15
3. Классификация и характеристика белков клеточной стенки по способу экстракции. 15
3.1. Ковалентно закрепленные белки: GPInPIR 16
3.1.1. GPI-белки клеточной стенки 17
3.1.2. ASL-белки клеточной стенки 24
3.2. SEP-белки клеточной стенки 26
3.2.1. Глкжантрансфераза Bgl2p клеточной стенки дрожжей. 33
4. Примеры белков, ремоделирующих клеточную стенку дрожжей 38
4.1. р-1,3-глюканозилтрансферазаОа5Ір 39
4.2. Экзо-р-1,3-глюканазы 39
4.3. Эндохитиназа 40
4.4. Предполагаемые глюкан/хитин кросс-связывающие ферменты 40
4.5. Глюканазы Scw4p и ScwlOp 41
4.6. Глкжантрансфераза Bgl2p 41
5. Заключение 44
III. Материалы и методы 45
1. Используемые в работе реактивы 45
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания 45
3. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов 46
4. Трансформация клеток дрожжей 46
5. Выделение суммарной ДНК дрожжей 46
6. Электрофоретические методы 47
6.1 Электрофорез ДНК в агарозном геле 47
6.2 Электрофорез белков в денатурирующих условиях 47
7. Вестерн-блот анализ 48
8. Окраска белков при помощи Кумасси 48
9. Окраска белков при помощи нитрата серебра 48
10. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения 49
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 50
12. Выделение клеточных стенок дрожжей 50
13. Частичная депротеинизация клеточных стенок 51
14. Экстракция белков клеточных стенок дрожжей 51
15. Выделение глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей 52
16. Спектроскопия кругового дихроизма 52
17. Приготовление тотальных препаратов внутриклеточных белков 53
18. Приготовление препарата Bgl2p для MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа 53
18.1. Трипсинолиз белка в ПААГ 53
18.2. Фракционирование пептидов, полученных в результате обработки белка трипсином 54
19. MALDI-TOF масс-спектрометрия 55
20. Микроскопические методы анализа 55
20.1 Конфокальная микроскопия препаратов, окрашенных антителами и дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия клеточных стенок дрожжей 55
20.2 Электронная микроскопия фибрилл, сформированных с участием глюкантрансферазы Bgl2p 56
21. Связывание флуоресцентного красителя Thioflavin Т (ThT) 56
22. Собственная флуоресценция глюкантрансферазы Bgl2p 57
23. Тушение собственной флуоресценции Bgl2p 57
24. Прочие методы 58
IV. Результаты и обсуждение 59
1. Сравнение BgI2p, закрепляющегося в клеточной стенке, и Bgl2p, секретируемого в среду культивирования дрожжей S. cerevisiae 59
1.1. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae а-типа спаривания 61
1.2. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из среды культивирования дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4 62
1.3. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из клеточной стенки штамма S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD4 дикого типа 62
1.4. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae А-типа спаривания 64
1.5. Обобщение результатов масс-спектрометрического анализа Bgl2p. Поиск различий в N-гликозилировании Bgl2p из клеточной стенки и среды культивирования 65
2. Формирование ассоциатов Bgl2p фибриллярной морфологии в препарате из среды культивирования штамма S. cerevisiae А270 с нарушенным геном SSU21/MCD4 68
3. Характеристика роли дисульфидных связей для закрепления глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок 75
4. Получение мутантов А- и а-типов спаривания с нарушенным геном BGL2 из дрожжей Cerevisiae дикого типа 76
5.Фенотипическое проявление делеции гена BGL2 на дрожжах S. cerevisiae А- и а- типов спаривания 77
6. Изучение конформационных особенностей Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae дикого типа 79
6.1. Температурно-зависимые конформационные переходы Bgl2p 79
6.2.Измерение констант тушения собственной флуоресценции триптофановых остатков Bgl2 хлоридом цезия, йодидом калия и акриламидом 83
6.2.1 .Константы тушения хлоридом цезия. 83
6.2.2.Константы тушения йодидом калия. 86
6.2.3 .Константы тушения акриламидом 88
6.2.4.Общая характеристика данных по константам тушения хлорида цезия, иодида калия и акриламида при разных температурах 90
6.3. Дополнительное подтверждение уменьшения эспонированности остатков триптофана Bgl2p при повышении температуры 92
6.4. Влияние рН среды и ионов двухвалентных металлов на значение параметра А 95
6.5. Расчет параметра а-меры завершенности перехода из одного состояния молекулы в другое состояние 95
7. Заключение 98
V. Выводы 99
Приложение 1 .Компьютерный расчет масс пептидов Bgl2p, возникающих в результате гидролиза трипсином. Массы пептидов располагаются в порядке нахождения пептидов в последовательности белка 100
Приложение 2. Компьютерный расчет масс пептидов Bgl2p, возникающих в результате гидролиза трипсином. Массы пептидов располагаются по величине в порядке убывания 105
Приложение 3 Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания 110
Приложение 4. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 112
Приложение. 5. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из среды культивирования штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4 114
Приложение 6. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из среды культивирования штамма дрожисей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4 вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 117
Приложение 7. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточной стенки штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD4 дикого типа 119
Приложение 8. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата BgI2p из клеточной стенки штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD4 дикого типа, вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 122
Приложение 9. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при повторном масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae А-типа спаривания 124
Приложение 10. Соответствие значений детектированных масс при повторном масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae А-типа спаривания вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 126
VI. Ссылки 129
- GPI-белки клеточной стенки
- Сравнение BgI2p, закрепляющегося в клеточной стенке, и Bgl2p, секретируемого в среду культивирования дрожжей S. cerevisiae
- Формирование ассоциатов Bgl2p фибриллярной морфологии в препарате из среды культивирования штамма S. cerevisiae А270 с нарушенным геном SSU21/MCD4
- Температурно-зависимые конформационные переходы Bgl2p
GPI-белки клеточной стенки
По-видимому, конечным местом, где все GPI-белки дрожжей выполняют свою функцию, является плазматическая мембрана или клеточная стенка. Типичная доменная организация GPI-белка у дрожжей представлена на рис. 5.
Как уже упоминалось выше определенное количество белков клеточной стенки дрожжей S.cerevisiae может быть экстрагировано из глюкановой сети простым кипячением клеток в додецилсульфате натрия в присутствии редуцирующих агентов, разрушающих дисульфидные мостики. Однако, большая часть белков клеточной стенки ковалентно связана с нерастворимой глюкановой сетью. Из этих ковалентно закрепленных белков первое место по количеству занимают GPI-белки, которые на определенных стадиях созревания теряют липидный компонент GPI-якоря и прикрепляются через оставшиеся остатки маннозы GPI-якоря к рі,6-глюкану. Если GPI-белки клеточной стенки экспрессировать без С-концевого сигнала прикрепления GPI-якоря, они не формируют связь с глюкановой сетью и во многих случаях секретируются (Schreuder et al., 1993; Lu et al., 1995; Van der Vaart et al., 1997). Также, некоторые GPI-белки секретируются, когда количество рі,6-глюкана сильно уменьшено (Jiang et al., 1996; Machi et al., 2004; Kapteyn et al., 1999). GPI-белки клеточной стенки могут быть селективно удалены из клеточных стенок путем обработки эндо-р1,6-глюканазой или фтороводородной кислотой (Kapteyn et al., 1996). Минорная популяция клеточно-стеночных белков не является GPI-белками, но тем не менее, прикреплена к глюкановому каркасу посредством ковалентной щелочелабильной связи, за что эти белки называют белками щелочеэктрагируемой фракции (ASL-CWP) (De Groot et al., 2005). Полный список GPI-белков был составлен путем комьютерного анализа дрожжевого генома (Eisenhaber et al., 2004; Саго et al., 1997; De Groot et al., 2003; Hamada et al., 1998), однако лишь для меньшей части белков из этого списка существование GPI-якоря было установлено биохимически (Kapteyn et al., 1999; Fontaine et al., 2003; Pittet and Conzelmann, 2007). Анализ генов, кодирующих GPI-белки клеточной стенки дрожжей, продемонстрировал наличие у них С-концевого фрагмента, состоящего из остатка глицина или аспарагина (функционирует в качестве сайта расщепления для последующего присоединения GPI-якоря), полярного домена (пять - десять остатков) и гидрофобного домена (пятнадцать - двадцать аминокислот).
Биохимические свидетельства существования GPI-якоря могут быть получены непрямьши методами, например, потерей гидрофобности белка после обработки фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазой С,, либо посредством введения метаболической метки компонентов якоря ([3Н]-инозитол), либо посредством потери поверхностной локализации при сайт-направленном мутагенезе предполагаемого сайта ю (сайта в молекуле белка, при расщеплении по которому образуется сайт прикрепления GPI-якоря), либо посредством демонстрации ковалентной щелочеустойчивой и в то же время глюканазо-чувствительной ассоциации с клеточной стенкой, для которой добавление GPI-якоря является необходимым условием (Pittet and Conzelmann, 2007). Более прямое доказательство наличия GPI-заякоривания получают посредством очистки GPI-белков и анализа их С-концов химическими и физическими (например, масс-спектрометрическим анализом) методами (Yin et al., 2005).
Показано, что путь биосинтеза GPI-якоря у дрожжей имеет много общих черт с аналогичными путями высших животных и человека. Показано, также, что эти белки обнаружены у архей, но не обнаружены у эубактерий (Conzelmann et al 1988; Conzelmann et al., 1992; Herscovics and Orlean, 1993).
Наиболее важным отличием GPI-белков клеточной стенки от мембранных белков является тот факт, что они лишены большей части GPI-якоря. Клеточная стенка дрожжей S.cerevisiae состоит из внутреннего глюканового слоя, наружнего маннопротеинового и небольшого количества хитина. Многие GPI-белки встраиваются в клеточную стенку, ковалентно связываясь с р-глюканом. Это также показано на других грибах, таких, как Candida (Kapteyn, et al., 2000; Frieman et al., 2002; de Groot et al., 2004), но не Aspergillus (Bruneau et al„ 2001; Latge et al, 2005). Область связывания с компонентами клеточной стенки в GPI-белках была установлена в лабораториях Кабиба и Клиса, показавших, что первый остаток маннозы GPI-якорей посредством гликозидной связи связан с (И,6-глюканом, который, в свою очередь, прикреплен к р-1,3-глюкану и хитину (Kollar et al., 1997). Структура связывающего белок с глюканом участка была идентифицирована как 5елок-СО-КН-(СН2)2-Р04-(Мапа1-ЗМапа1-2- )Мапа1-2Мапа1-бМап-Р-1,6-глюкан. Эта структура отражает то, что GPI-якорь расщепляется при встраивании GPI-белка в клеточную стенку и компонент глюкозамин-фосфатидилинозитол теряется в этом процессе. С другой стороны, минорное количество GPI-белков находится на плазматической мембране. Классификация GPI-белков на клеточно-стеночные (GPI-CWPs) и связанные с плазматической мембраной (GPI-PMPs) считается скорее относительной, чем абсолютной, поскольку она отражает только преобладающую локализацию белка, в соответствии с чем многие GPI-белки могут быть найдены в обоих местах локализации — плазматической мембране и клеточных стенках (Pittet and Conzelmann, 2007). Тем не менее, специфические остатки в со-минус области, по-видимому, способствуют локализации GPI-белка либо в клеточной стенке, либо в плазматической мембране. Основные остатки в области сразу апстрим от сайта прикрепления GPI-якоря (со-сайт) часто находят в GPI-белках, связанных с плазматической мембраной (например, Ypslp, Plblp), но не находят в GPI-белках, связанных с клеточной стенкой. Поэтому предполагается, что наличие основных остатков близко к (й-санту предотвращает дальнейший процессинг и интеграцию GPI-белка в клеточную стенку (Саго et al., 1997; Vossen et al., 1997). Анализ большого количества биохимически проверенных GPI-белков также позволяет предполагать, что присутствие остатков валина, изолейцина или лейцина в положениях со-4 и со-5 так же как и наличие остатков тирозина или аспарагина в положении со-2 является положительным сигналом для локализации GPI-белка в клеточной стенке (Hamada et al., 1998; Hamada et al., 1999). Для GPI-белков плазматической мембраны было показано, что удаление заряженных остатков в позициях «а-2 и со-1 так же, как и введение гидрофобных остатков аминокислот в позиции ю-4 способствует увеличению встраивания данных GPI-белков в клеточную стенку (Frieman and Cormack, 2003). Однако, встраивание в клеточную стенку зависит, по-видимому, также от последовательностей, которые располагаются еще более апстрим от ю-сайта. Многие GPI-белки содержат серин/треонин-богатые области на расстоянии вплоть до нескольких сотен остатков аминокислот апстрим от со-сайта и было показано, что такие серин/треонин-богатые области способствуют интеграции в клеточную стенку. Ser/Thr-сигнал способен отменять эффект локализации в цитоплазматической мембране, обусловленный наличием основных остатков аминокислот рядом с ш-сайтом. Ser/Thr-сигнал, по-видимому, используется для локализации в клеточной стенке, так как средняя длина областей, обогащенных остатками серина и треонина у GPI-беков клеточной стенки существенно больше, чем у GPI-белков плазматической мембраны (Frieman and Cormack, 2004). Присутствие таких областей может объяснять, почему существуют заметные количества белка Gaslp, ковалентно связанного с клеточной стенкой (Yin et al., 2005; De Sampaio et al., 1999). Данный GPI-заякоренный белок клеточной стенки заслуживает особого внимания, поскольку наряду с наличием глюканозилтрансферазной функции, у него была показана роль в транскрипционном сайленсинге у дрожжей (Burgess et al., 2009). Следует отметить, что факт наличия второй функции, часто относящейся даже к другому компартменту клетки, у белков не является единичным (Gancedo and Flores,, 2008). Длинные серин/треонин-богатые участки не только способствуют интеграции в клеточную стенку, но также дают возможность GPI-белкам, способствующим клеточной адгезии, экспонировать свои N-концевые домены на наружную поверхность клеточной стенки, где они могут взаимодействовать со своими лигандами (Frieman et al., 2002). Действительно, искусственное укорочение серин/треонин-богатого участка в гене ЕРА1 Candida glabrata препятствует выполнению им адгезионной функции, поскольку N-концевой домен, связывающий лиганд, у укороченного варианта белка не имел доступа к клеточной поверхности, хотя белок оставался ковалентно связанным с глюканом (Frieman et al, 2002). Коллар с соавторами (Kollar et al., 1997) установил наличие ковалентной связи между первым остатком маннозы GPI-якоря и глюкозным остатком рі,6-глюкана. Это предполагает наличие возможного механизма трансгликозидирования для прикрепления GPI-белков к глюкану клеточной стенки. Сочетание методов энзиматического гидролиза Р1,6-глюканазой и расщепления фосфоэфирных связей фтористоводородной кислотой показало, что GPI-белки в клеточной стенке присоединены к глюкану посредством фосфоэтаноламинманнозного мостика. Их присоединение к глюкану клеточной стенки осуществляется за счет связывания маннозного остатка GPI-якоря с р1,6-глюканом (рис. 6); данная связь была продемонстрирована как химически, так и генетически. Следует отметить, что данная схема встраивания GPI-белков в К С, отображенные на рис. 6, не изменилась до настоящего времени.
Сравнение BgI2p, закрепляющегося в клеточной стенке, и Bgl2p, секретируемого в среду культивирования дрожжей S. cerevisiae
Несмотря на способность Bgl2p необычайно прочно закрепляться в КС дрожжей S. cerevisiae, описана мутация, при которой данный белок не встраивается в КС, а в большом количестве обнаруживается в среде культивирования. Эта мутация в гене SSU21/MCD4, сопровождается снижением количества GPI-белков вследствие нарушения формирования GPI-якорей (Packeiscr et al, 1999; Maneesri et al., 2005). Известно, что у дрожжей некоторые GPI-белки, обладают протеолитической активностью (Krysan et al., 2005), в то же время у родственного Bgl2p фермента - глюканазы табака, - ранее был обнаружен процессинг, в результате которого отщепляется С-концевой фрагмент полипептидной цепи (Shinshi et al., 1988).
Сопоставление перечисленных фактов позволяло с одной стороны предполагать наличие аналогичного С-концевого процессинга у глюкантрансферазы Bgl2p в штамме дикого типа, а с другой - нарушение этого процессинга у штамма с мутацией в гене SSU21/MCD4 и, как следствие, потерю глюкантрансферазой Bgl2p способности закрепляться в КС. Для проверки высказанного предположения мы провели сравнительный анализ глюкантрансферазы Bgl2p, выделенной из КС дрожжей S. cerevisiae родительского штамма дикого типа, в котором данный фермент прочно закреплен в КС, с Bgl2p из культуральной жидкости штамма А270 с мутацией в гене SSU21/MCD4 при помощи MALDI масс-спектрометрии. В качестве дополнительного контроля был проведен анализ глюкантрансферазы Bgl2p из штамма А270 с плазмидой, несушей ген SSU21/MCD4 дикого типа, в котором Bgl2p встраивался в КС.
Следует отметить, что последовательность Bgl2p, кодируемая геном BGL2, включает в себя N-концевой сигнальный пептид, отщепляющийся при прохождении молекулой Bgl2p транспортных путей в дрожжевой клетке, поэтому для упрощения восприятия информации в дальнейшем данные будут представлены в основном для последовательности Bgl2p, не содержащей N-концевого пептида.
Молекула Bgl2p (без сигнального пептида) содержит в своей последовательности 19 сайтов расщепления трипсином (рис. 10). Для того, чтобы ориентироваться в результатах масс-спектрометрического анализа, сначала необходимо было рассчитать массы пептидов, которые теоретически должны получаться в результате трипсинолиза молекулы Bgl2p. Рассчетные значения масс пептидов представлены в Приложении 1 и Приложении 2 (в данных таблицах представлены массы пептидов Bgl2p в порядке следования по последовательности белка и в порядке снижения значений масс; расчет проводился с учетом возможности пропуска трипсином одного сайта расщепления).
Формирование ассоциатов Bgl2p фибриллярной морфологии в препарате из среды культивирования штамма S. cerevisiae А270 с нарушенным геном SSU21/MCD4
Ранее в нашей лаборатории было показано, что в препарате Bgl2p, полученном из КС путем экстракции при нагревании, детектируются структуры фибриллярной морфологии (Плотникова, 2006). Мы проверили способность Bgl2p из среды культивирования дрожжей S. cerevisiae формировать фибриллярные структуры. Для этого мы использовали культуральную среду штамма А270 с нарушенным геном SSU21/MCD4, характеризующегося повышенной секрецией Bgl2p в среду культивирования.
Поскольку культуральная среда помимо Bgl2p содержала другие белки, для их удаления нами был применен метод фильтрации препарата через половолоконный картридж, пропускающий компоненты с молекулярной массой менее 100 кДа (молекулярная масса Bgl2p составляет 34 кДа). Результаты процедуры фильтрования культуральной среды представлены на рис. 17А. Видно, что Bgl2p из среды культивирования успешно проходит через фильтр, пропускающий белки с массой менее 100 кДа (рис. 17А, дорожка 2), что является свидетельством отсутствия крупных ассоциатов Bgl2p (более 2-3 молекул Bgl2p) в культуральной среде и устойчивости Bgl2p при его концентрации в среде культивирования к процессам агрегации/ассоциации. Если бы Bgl2p некотролируемо агрегировал, то уже в процессе культивирования дрожжей он весь собрался бы в агрегаты и не смог пройти через используемый фильтр. Данный подход также применим для частичной очистки среды культивирования, содержащей Bgl2p.
На следующем этапе проводили окрашивание препаратов культуральной среды, предварительно инкубировавшихся при температуре 37С, антителами к Bgl2p. В результате при конфокальной микроскопии детектировали структуры с неразличимой данным методом морфологией (средний размер 20-40 мкм), которые специфически окрашивались антителами к Bgl2p (данные не приведены). Нами было выдвинуто предположение, что Bgl2p в среде культивирования эффективно образовывал фибриллярные структуры, которые затем соединялись в более плотные ассоциаты. Чтобы зарегистрировать наличие фибриллярных структур, формируемых данным белком, мы применили подход, заключающийся в добавлении Конго Красного, который обладает способностью ингибировать формирование амилоидных фибрилл (Frid et al., 2007). Нам удалось подобрать концентрацию Конго Красного (8 мкМ), при которой формируются фибриллярные структуры длиной 2-10 мкм в препарате из среды культивирования штамма А270 (рис. 18). Следует отметить, что при окрашивании препарата Bgl2p, получаемого из КС путем экстракции в воду при нагревании, антителами к Bgl2p с помощью конфокальной и электронной микроскопии также регистрируются агрегаты фибриллярной морфологии длиной до 10 мкм (рис. 19). Таким образом, использованный нами подход, заключающийся в добавлении ингибитора формирования амилоидных фибрилл, позволил детектировать фибриллярные структуры в препарате Bgl2p из культуральной жидкости штамма А270.
Дополнительным подтверждением способности Bgl2p из культуральной среды эффективно образовывать олигомеры служит эксперимент, заключающийся в концентрировании в 100 раз подвергнутой фильтрованию среды культивирования штамма А270. На полученном Вестерн-блоте (рис. 17, дорожки 3 и 4) видно, что Bgl2p из среды культивирования образует олигомер с массой более 48 кДа (предположительно димер) и олигомеры с молекулярной массой более 117 кДа, устойчивые к кипячению в буфере для нанесения проб Лэммли. Следует отметить, что в данных условиях концентрирования практически не выявляется наличия мономерной формы Bgl2p. Этот результат указывает на способность Bgl2p с высокой эффективностью ассоциировать при повышении его концентрации в среде культивирования, что подтверждает данные конфокальной микроскопии окрашенных антителами к Bgl2p препаратов культуральной среды. При этом нужно отметить, что при экстракции Bgl2p из КС диметилсульфоксидом данный белок также образует устойчивые к кипячению в буфере Лэммли олигомеры (Горковский, 2009).
Следует отметить, что глюкантрансфераза Bgl2p в препарате цитозоля штамма А270 с нарушенным формированием GPI-якорей также способна образовывать олигомеры, осаждающиеся в результате ультрацентрифугирования (рис. 20). С другой стороны, как ранее было показано Плотниковой Т.А. (Плотникова, 2006), Bgl2p, экстрагируемый при помощи ламинариназы, входит в ПААГ только после кипячения, что может свидетельствовать об участии данного белка в образовании ассоциатов (рис.21).
Таким образом, глюкантрансфераза Bgl2p из среды культивирования штамма дрожжей S. cerevisiae А270 с нарушенным геном SSU21/MCD4 способна образовывать ассоциаты фибриллярной морфологии. Указанная способность характерна также и для белка, выделенного из КС путем экстракции при нагревании, что является дополнительным свидетельством наличия одинаковых свойств как у белка из КС, так и у белка из среды культивирования.
На основании полученных результатов, а также данных, полученных в лаборатории ранее, нами была выдвинута гипотеза о том, что глюкантрансфераза Bgl2p закрепляется в КС посредством образования фибриллярных структур, происходящего при повышении концентрации данного белка в КС. Для проверки гипотезы, мы провели работу по характеристике конформационных особенностей Bgl2p при помощи спектроскопических методов. Поскольку мы не обнаружили различий между Bgl2p из среды культивирования и Bgl2p из КС по всем исследованным нами параметрам, а свойство формировать агрегаты фибриллярной морфологии характерно как для белка из культуральной среды, так и для белка из КС, выделенного при нагревании, для дальнейших исследований Bgl2p было решено использовать препарат, полученный экстракцией из КС при нагревании, поскольку в культуральной среде штамма А270 содержится на два порядка меньше Bgl2p, чем в водном экстракте, получаемом из КС нагреванием. При этом также учитывалось то, что Bgl2p обладает высокой способностью к ассоциации, ввиду чего при его очистке из среды культивирования хроматографическими методами существует высокая вероятность частичной или полной потери данного белка. Перед работой по характеристике конформационных особенностей BgI2p необходимо было проверить, не играют ли дисульфидные связи роли в закреплении Bgl2p.
Температурно-зависимые конформационные переходы Bgl2p
Важно отметить, что Bgl2p не экстрагируется из КС при 37С за 1 час инкубации даже в присутствии 1% ДСН, однако практически полностью экстрагируется из КС при 55С в течение 1 часа и при 70С в течение 15 мин. Таким образом, способность Bgl2p быть закрепленным в КС падает с повышением температуры. Следует отметить, что указанная закономерность продемонстрирована как для Bgl2p из КС дрожжей S.cerevisiae А-типа спаривания так и для Bgl2p из КС дрожжей а-типа спаривания. В обоих случаях этот белок устойчив в се составе к обработке трипсином.
Температурные зависимости флуоресценции тиофлавина Т, светорассеяния и параметра А препарата Bgl2p представлены на рис. 24. От остальных амилоид-специфичных красителей (таких, как, например, Конго Красный) тиофлавин Т отличает способность связываться с фибриллами в процессе их сборки из белка-предшественника, не ингибируя при этом процесса фибриллообразования (Nilsson, 2004). На рис. 24А видно, что при уменьшении температуры среды инкубации интенсивность флуоресценции тиофлавина Т возрастает, что может свидетельствовать об увеличении содержания амилоидных фибрилл в препарате Bgl2p. В исследованном диапазоне температур максимальная флуоресценция наблюдается при 20С, минимальная при 69С. При 55С она уже в 4 раза меньше, чем при 20С, после чего продолжает снижаться и к 69С детектируется на слабом уровне. Измеренное в этих же условиях рассеяние света (рис. 24Б) падает с увеличением температуры, достигая своего минимума к 60С, после чего снова растет в диапазоне от 60 до 65С, затем остается практически неизменным вплоть до 85С.
Можно предположить, что при увеличении температуры от 20 до 60С BgI2p в растворе постепенно утрачивает способность формировать амилоидные структуры и не образует агрегаты другого типа, что согласуется с данными по флуоресценции тиофлавина Т и интенсивности светорассеяния. Однако после 60С (рис. 24Б), возможно, происходит образование агрегатов, по-видимому, неамилоидной природы (увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т после 60 С не наблюдали, рис. 24А). Следует отметить, что уже при значении температуры 50С в препарате Bgl2p методом электронной микроскопии не обнаружены фибриллярные структуры, что согласуется с данными по флуоресценции тиофлавина Т (рис. 24А). Таким образом, полученные результаты позволяют предполагать, что в препарате BgI2p количество фибрилл с кросс-Р-структурой уменьшается с увеличением температуры.
Анализ спектров кругового дихроизма препарата Bgl2p в диапазоне от 180 до 260 нм при разных значениях температуры, полученных Горковским А.А (Горковский, 2009), представленных на рис. 25, показал, что с повышением температуры происходит уменьшение содержания р-структуры в препарате Bgl2p (уменьшение пика на 215 нм и сдвиг точки пересечения нулевой линии влево). Возможно, что это уменьшение связано с нарушением как внутримолекулярной, так и межмолекулярной р-структуры в результате разрушения амилоидных фибрилл, на которое указывают данные по флуоресценции тиофлавина Т и светорассеянию препарата Bgl2p. Наличие изобестической точки на спектрах кругового дихроизма (при 205 нм) свидетельствует о том, что температурно-индуцированный переход осуществляется между двумя состояниями - предположительно высоко олигомеризованным и существенно менее олигомеризованным.
Эксперименты по изучению динамического лазерного светорассеяния препарата Bgl2p при 20С показали наличие в препарате частиц со средним размером 950 нм (рис. 26 А), тогда как в препарате, в котором концентрация белка была в 10 раз меньше, мы детектировали частицы со средним размером 20 нм (рис. 26 Б). Этот результат позволяет предполагать наличие концентрационной зависимости в формировании ассоциатов Bgl2p. Электронная микрофотография фибриллярных структур, детектируемых в препарате Bgl2p, полученном нагреванием из КС штамма дрожжей S. cerevisiae дикого типа, представлена на рис. 26 В. На рис.27 дополнительно представлены фибриллярные структуры, детектируемые в препарате Bgl2p при помощи электронной микроскопии.
Следует отметить, что размер детектированных методом динамического лазерного светорассеяния частиц сопоставим с размерами фибриллярных структур, детектируемых при конфокальной (данные не приведены) и электронной (рис. 26 В) микроскопии препаратов Bgl2p. Интересно, что распад фибриллярной структуры глюкантрансферазы при повышении температуры сопровождается увеличением значений параметра А (рис. 24В) и, следовательно, уменьшением экспонированности триптофановых остатков белка, что может свидетельствовать о большей структурированности их окружения.
Этот параметр служит индикатором положения максимума спектра флуоресценции триптофановых остатков и их контакта с водной средой, т.е. степени погружения внутрь белковой глобулы (Туроверов и др., 1975). Можно предположить, что разрушение амилоидных фибрилл не является следствием температурного плавления больших жестко упакованных структурных блоков, а, скорее всего, происходит в результате разрушения множественных слабых межмолекулярных взаимодействий, стабилизирующих фибриллу. То, что такое разрушение приводит к смещению положения максимума на спектре флуоресценции триптофановых остатков в коротковолновую сторону (увеличению параметра А), может свидетельствовать о том, что часть триптофановых остатков меняет свое окружение на менее полярное в результате разрушения межмолекулярных контактов в фибриллах глюкантрансферазы.
Следует отметить, что все температурные зависимости, указанные на рис. 24, носят обратимый характер, то есть при повторной регистрации температурной зависимости флуоресценции тиофлавина Т, светорассеяния и параметра А того же образца, зависимости не отличались от ранее полученных. Это является свидетельством высокой способности Bgl2p к ренатурации и устойчивости данного белка к повышенным температурам.
