Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Характеристика дрожжей как модельного объекта эукариотической клетки .11
2. Дифференцировка дрожжей как следствие асимметрии деления .11
3. Асимметричность деления дрожжей Saccharomyces cerevisiae 12
4. Асимметричное наследование макромолекулярных комплексов клетками S. сerevisiae .13
5. Различие длин фаз клеточного цикла материнской и дочерней клетки S. cerevisiae 15
6. Различие профилей экспрессии материнской и дочерней клетки S. cerevisiae 17
7. Типы спаривания дрожжей и HO-эндонуклеаза .18
8. Механизм формирования асимметрии между материнской и дочерней клеткой дрожжей .20
9. Асимметричное деление и репликативная продолжительность жизни 22
10. Наследование белковых агрегатов клетками дрожжей S. cerevisiae .24
11. Репликативная продолжительность жизни дрожжей Saccharomyces cerevisiae .26
12. Методы определения репликативной продолжительности жизни дрожжей .27
13. Генетика репликативного старения дрожжей .30
14. Влияние АФК и митохондрий на репликативную продолжительность жизни дрожжей 32
15. Асимметричное наследование митохондрий клетками S. сerevisiae .34
16. Влияние вакуолярного рН на функцию митохондрий и репликативную продолжительность жизни дрожжей .36
17. Изменения в клетках дрожжей, происходящие на ранних этапах репликатвного старения .38
18. Дифференцировка дрожжей в составе микроколонии 39
19. Дифференцировка дрожжей в стационарной фазе роста .42
Материалы и методы исследования 44
1. Объект исследования и методы культивирования 44
2. Амплификация дрожжевых генов при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) .46
3. Горизонтальный гель-электрофорез ДНК .48
4. Выделение суммарной ДНК из дрожжей S. cerevisiae .49
5. Выделение плазмидной ДНК из E.coli методом щелочного лизиса .50
6. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции .52
7. Выделение ДНК из агарозного геля .52
8. Реакция лигирования .52
9. Приготовление электрокомпетентных клеток E.coli и электропорация...53
10. Трансформация дрожжей 53
11. Получение мутантных линий дрожжей .54
12. Получение линии клеток, в которых ген URA3 находится под контролем HO промотора .55
13. Измерение устойчивости клеток S. cerevisiae K6001 к стрессу, вызванному низким рН, в зависимости от репликативного возраста 58
14. Измерение устойчивости клеток S. cerevisiae к стрессу в зависимости от репликативного возраста 59
15. Измерение доли клеток, образовавших споры на бедной среде, в зависимости от репликативного возраста .60
16. Измерение доли клеток, образовавших псевдогифу в ответ на бутанол, в зависимости от репликативного возраста .60
17. Прочие микроскопические методы 60
18. Статистическая обработка данных .61
Результаты и их обсуждение .62
1. Возрастное распределение культуры клеток дрожжей
2. Устойчивость клеток дрожжей к стрессу в зависимости от репликативного возраста 62
3. Зависимость стрессоустойчивости клеток дрожжей от размера .67
4. Стресс-специфический характер зависимости устойчивости клеток дрожжей в зависимости от репликативного возраста .70
5. Активация транскрипционных факторов ответа на стресс в зависимости от репликативного возраста 75
6. Характеристика ранневозрастных изменений клеточных органелл S. cerevisiae .77
7. Поиск генов, связанных с ранним снижением стрессоустойчивости клеток дрожжей 79
8. Способность к дифференцировке клеток дрожжей в зависимости от репликативного возраста 85
9. Получение и описание штамма, в котором оротидин 5 -фосфат декарбоксилаза находится под контролем НО промотора .88
Заключение 97
Выводы .100
Список использованной литературы
- Различие длин фаз клеточного цикла материнской и дочерней клетки S. cerevisiae
- Выделение суммарной ДНК из дрожжей S. cerevisiae
- Измерение устойчивости клеток S. cerevisiae к стрессу в зависимости от репликативного возраста
- Поиск генов, связанных с ранним снижением стрессоустойчивости клеток дрожжей
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, находясь в экспоненциальной фазе роста, размножаются почкованием, то есть делятся асимметрично. Исходную клетку принято называть материнской, а новообразованную — дочерней. Известно, что материнская клетка дрожжей способна дать ограниченное количество дочерних (Mortimer and Johnston, 1959). При этом с каждым последующим делением размер клетки увеличивается, а последние несколько клеточных циклов проходят значительно дольше предыдущих (Mortimer and Johnston, 1959). Этот феномен был назван репликативным старением дрожжей, а количество дочерних клеток, образованных материнской, ее репликативным возрастом. В последнее время опубликовано много работ, указывающих на сходство репликативного старения дрожжей и старения высших эукариот.
Примером является ограничение калорийности питания, увеличивающее как продолжительность жизни высших эукариот, так и репликативную продолжительность жизни (РПЖ) дрожжей. Другим примером является дрожжевой ген SIR2 – NAD+-зависимая деацетилаза гистонов, гомолог SIRT1 млекопитающих, который дозо-зависимо продлевает РПЖ дрожжей, а также оказывает влияние на старение высших эукариот (Kaeberlein et al., 2013). Поэтому репликативное старение дрожжей считается моделью для исследования старения высших организмов.
Степень разработанности темы. Асимметричное деление приводит к тому, что дочерняя клетка сильно отличается от материнской. Примерами таких отличий является разница в профиле экспрессии некоторых генов между материнской и дочерней клетками (Cosma et al., 2004), а также то, что клеточная стенка дочерней клетки синтезируется de novo (Mortimer and Johnston, 1959). Существует также ряд потенциально токсичных факторов, которые наследуются преимущественно материнскими клетками: карбонилированные белки (Aguilaniu et al., 2003) и экстрахромосомальные рибосомальные кольцевые ДНК (Sinclair et al., 1997). Более того, ранее было показано, что такая асимметрия формируется в результате работы
специальной системы, одним из компонентов которой является комплекс белков, называемых полярисомой (Liu et al., 2010).
Асимметричное распределение ряда факторов между материнской и дочерней клетками, по-видимому, приводит к тому, что такие факторы накапливаются в материнских клетках с каждым последующим делением, как это было показано для экр-ДНК (Sinclair et al., 1997) и карбонилированных белков (Aguilaniu et al., 2003). Считается, что именно эти факторы приводят к тому, что репликативная продолжительность жизни дрожжей ограничена (Nystrom, 2014). Интересно, что отсутствие асимметрии деления по этим факторам приводит к снижению репликативной продолжительности жизни до 10-15 делений (Kaeberlein et al., 1999). Однако в экспоненциальной фазе роста культура клеток дрожжей будет более чем на 95% представлена клетками в возрасте от 1 (дочерних клеток) до 5 (материнских клеток, давших 4 дочерних). Отсюда возникает вопрос: какова функция асимметрии деления, если ее отсутствие не сказывается на выживаемости подавляющей фракции клеток дрожжей, находящихся в экспоненциальной фазе роста? В данной работе мы показали, что эффект отсутствия асимметрии деления проявляется в стрессовых условиях.
С другой стороны, асимметрия деления приводит не только к тому, что дочерние клетки дрожжей сильно отличаются от материнских, но и материнские клетки разного репликативного возраста серьезно отличаются друг от друга по ряду параметров. Как оказалось, культура клеток дрожжей дифференцирована по своей устойчивости к тепловому шоку, что связано с концентрацией белка Tsl1p, ответственного за биосинтез трегалозы (Levy et al., 2012). Более того, эти исследователи обнаружили накопление клетками дрожжей Tsl1p уже после первых делений, и это накопление приводило к снижению скорости роста (Levy et al., 2012). Получается, что культура клеток дрожжей дифференцирована с целью разделения рисков (от англ. «bet hedging»): часть клеток делятся быстро, а часть в ущерб скорости удвоения накапливают Tsl1p, на случай резкого повышения температуры. Другие исследователи, используя данные Леви и соавторов (2012) подтвердили преимущества такой стратегии с помощью математического моделирования (Hartwell et al., 2014).
Действительно, стратегия разделения рисков – явление встречающееся и среди бактерий (Rainey et al., 2011), и среди растений (Childs et al, 2010). Поэтому изучение этой стратегии с использованием такого детально изученного объекта как пекарские дрожжи, может представлять широкий научный интерес. Более того, разделение рисков у дрожжей в форме возраст-зависимой дифференцировки, тесно связано с репликативным старением, которое, в свою очередь, является экспериментальной моделью старения высших эукариот.
Цели и задачи. Целью настоящей работы было усовершенствование дрожжевой модели старения эукариотической клетки. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить характер зависимости устойчивости к различным типам стресса от репликативного возраста дрожжей S. cerevisiae.
-
Найти факторы, которые влияют на характер зависимости стрессоустойчивости от репликативного возраста.
-
Изучить изменения, которые происходят в клетках дрожжей S. cerevisiae на ранних этапах репликативного старения Научная новизна. Впервые было показано, что отсутствие асимметрии деления
дрожжей сказывается на выживаемости клеток в стрессовых условиях. В данной работе также было показано, что снижение выживаемости с увеличением репликативного возраста клеток дрожжей, находящихся в стрессовых условиях, начинается уже после 4-го деления. Данные представленной работы позволяют предположить, что такое снижение стрессоустойчивости связано с митохондриальной дисфункцией. В ходе данного исследования был получен штамм дрожжей, в котором ген оротидин фосфат декарбоксилазы находится под контролем НО промотора, и с помощью этого штамма было показано, что в старых клетках дрожжей снижена вероятность экспрессии НО, что свидетельствует в пользу того, что в старых клетках дрожжей с меньшей вероятностью происходит спонтанная смена типа спаривания.
Теоретическая и практическая значимость работы. Учитывая то, что репликативное старение дрожжей считается моделью старения высших организмов, можно предположить, что данные полученные в ходе представленного исследования
могут быть использованы в исследовании процессов старения млекопитающих. Наши данные также свидетельствуют в пользу того, что культура клеток дрожжей, даже находясь в экспоненциальной фазе роста, дифференцирована в следствие асимметричного деления. Это, в свою очередь, может быть полезно многим исследователям, использующим пекарские дрожжи как модельный объект.
Методология и методы исследования. В качестве объекта исследования использовали пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамм W303. Дрожжи растили на богатой среде содержащей 2% глюкозы, 2% пептона и 1% дрожжевого экстракта. Для получения мутантных штаммов использовали синтетические селективные среды, либо богатую среду с добавлением антибиотика (генетицин 250 мкг/мл). Получение мутантных штаммов дрожжей проводили по стандартному протоколу с использованием полиэтиленгликоля и литий-ацетатного буфера. Генетические конструкции были получены стандартными молекулярно-биологическими методами (ПЦР, рестрикция, лигирование). Клетки E. coli трансформировали электропорацией. Для получения микрофотографий клеток дрожжей использовали флуоресцентный микроскоп Olympus BX51. Почечные рубцы визуализировали с помощью калькофлуора белого.
Положения, выносимые на защиту:
-
Клетки S. cerevisiae в культуре, находящейся в экспоненциальной фазе роста, дифференцированы по своей стрессоустойчивости в зависимости от репликативного возраста.
-
Асимметрия деления дрожжей необходима для повышения стрессоустойчивости дочерних клеток S. cerevisiae.
-
Старые клетки дрожжей хуже приспособлены к такой смене условий, как повышение температуры и недостаток питательных веществ.
-
Делеция генов ретроградной сигнализации RTG1 и RTG3 приводит к снижению стрессоустойчивости репликативно старых клеток.
-
В репликативно старых клетках S. cerevisiae снижена экспрессия НО промотора, по сравнению с репликативно молодыми.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: Биология - наука XXI века. 14 международная пущинская
школа-конференция, (Пущино, 2010); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010», (Москва, 2010); Microbial stress from molecules to systems, (Бельджирате, Италия, 2012); 9th International Meeting on Yeast Apoptosis, (Рим, Италия, 2012); 3-ий съезд микологов в России, (Москва, 2012); Рецепторы и внутриклеточная сигнализация, (Пущино, 2013).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований, анализе результатов. Основные результаты получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых международных журналах, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 1 статья в рецензируемом международном журнале и 5 материалов отечественных и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Различие длин фаз клеточного цикла материнской и дочерней клетки S. cerevisiae
Как известно, клетки пекарских дрожжей размножаются почкованием, то есть делятся асимметрично (Hartwell 1977). При этом одну из клеток в литературе принято называть материнской, а новообразовавшуюся клетку – дочерней.
Известно, что при почковании клеточная стенка дочерней клетки синтезируется de novo (Mortimer et al. 1959). Одна материнская клетка может произвести несколько дочерних, и после каждого деления на материнской клетке будет оставаться зона округлой формы, обогащенная хитином по сравнению с остальной поверхностью клетки. В литературе эту зону обычно называют «почечным рубцом» (от англ. bud scar). Известно, что почечные рубцы можно визуализировать при помощи флуоресцентного красителя – калькофлуора белого, который связывается с хитином (Pringle 1991). Было показано, что почка на дрожжевой клетке не образуется в одном и том же месте дважды (Mortimer et al. 1959). Поэтому по количеству почечных рубцов можно определить количество дочерних клеток, которые дала материнская клетка. Эта характеристика дрожжевой клетки называется ее репликативным возрастом.
С увеличением репликативного возраста также несколько увеличивается размер клетки (Powel et al. 2003).
Таким образом, культура клеток S. cerevisiae, находящаяся в экспоненциальной фазе роста, будет гетерогенна, т.к. будет состоять из клеток с разным репликативным возрастом. 3. Асимметричность деления дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Асимметричное деление S. cerevisiae приводит к тому, что образовавшиеся клетки существенно отличаются друг от друга по множеству параметров. Рядом авторов было показано, что поддержание асимметрии формируется уже при образовании почки на материнской клетке. Затем по мере роста клетки асимметрия поддерживается за счет специальных механизмов. Это приводит к тому, что в материнской и дочерней клетках различаются: (1) профили экспрессии некоторых генов, (2) длины некоторых фаз клеточного цикла, (3) концентрация окисленных (карбонилированных белков), (4) концентрация экстрахромосомальных кольцевых рДНК. Также было показано: (5) асимметричное распределение органелл между материнской и дочерней клетками, в частности, митохондрии с функциональной аконитазой наследуются преимущественно дочерними клетками (6) дочерняя клетка наследует только полноценные ядерные поры (7) после удвоения полюс веретена деления остаётся в материнской клетке.
4. Асимметричное наследование макромолекулярных комплексов клетками S. сerevisiae
В 2013 году Menendez-Benito et al. предложили систему для наблюдения за включением новых белков в различные компартменты клеток дрожжей в режиме реального времени (система RITE). Система состоит из индуцируемой -эстрадиолом Cre-рекомбиназы и кассеты, которая тэгирует интересующий ген. Схематически работа системы изображена на рисунке 1.
Данная касета трансформируется в геном дрожжей. При этом дрожжи экспрессируют целевой ген, в виде гибридного белка с GFP. Затем добавляется -эстрадиол, индуцируется Сre-рекомбиназа, происходит рекомбинация по LoxP сайтам, имеющимся в кассете, и участок, кодирующий GFP выщепляется, а на его месте оказывается RFP, таким образом после добавления -эстрадиола клетки экспрессируют целевой ген в виде гибрида белка уже с RFP, и становится возможным отличить новообразованные белки.
Авторы этой работы с использованием системы RITE исследовали распределение новосинтезированных белков во многих клеточных органеллах S. cerevisiae, и получили, что в большинстве органелл новые и старые белки распределены равномерно. Однако были и исключения. Так, например, новосинтезированные белки, формирующие ядерную пору, не перемешивались с белками, синтезированными до добавления -эстрадиола (рисунок 2). Интересно, что ново- и старосинтезированные ядерные поры наследовались между материнскими и дочерними клетками равномерно.
Выделение суммарной ДНК из дрожжей S. cerevisiae
Итак, материнская клетка S. cerevisiae может сделать ограниченное количество делений, после чего умирает. В научной литературе существует ряд возможных объяснений этого феномена. Одним из них, как описано выше, является накопление факторов репликативного старения.
Некоторые исследователи считают, что определяющим репликативную продолжительность жизни является геометрический фактор – размер клетки (Zadragecza et al. 2009, Yang et al. 2011), т.е. материнская клетка продолжает делиться, пока не достигнет определенного размера. В пользу такой теории свидетельствуют данные о том, что штаммы дрожжей с меньшим размером клетки имеют большую репликативную продолжительность жизни, и наоборот, больший размер клетки приводит к сокращению продолжительности жизни. Однако такая возможность ранее была исключена другими исследователями в результате простого эксперимента: клеточный цикл дрожжей арестовали половым феромоном альфа-фактором на 4 часа. За это время размер клеток увеличился более чем вдвое. Через четыре часа клетки отмыли от альфа-фактора и измерили их репликативную продолжительность жизни: оказалось, что она осталось точно такой же, какой была у неарестованных контрольных клеток (Kennedy et al. 1994). Поэтому, мы считаем, что хотя размер клетки, теоретически, и может ограничивать продолжительность жизни, в нормальных условиях он не является лимитирующим фактором. 12. Методы определения репликативной продолжительности жизни
Один из основных способов определения репликативной продолжительности жизни является растаскивание материнской и дочерней клетки после цитокенеза при помощи микроманипулятора. Соответственно, количество дочерних клеток, отделенных от материнской и будет репликативной продолжительностью жизни. Впервые это было сделано Мортимером и коллегами в 1959 году (Рисунок 11). Такой способ позволяет определить этот параметр напрямую, однако является достаточно трудоемким и может использоваться только на твердой среде, таким образом, становится затруднительно исследовать влияние некоторых веществ на репликативную продолжительность жизни.
Измерение репликативной продолжительности жизни дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Источник – Mortimer and Johnston, 1959.
Этот способ измерения продолжительности жизни можно значительно упростить. Для этого можно использовать К6001 штамм S. cerevisiae (Bobola et al. 1996, Jarolim et al. 2004). Этот штамм устроен так, что на среде с глюкозой дочерние клетки не делятся. Таким образом, при переносе на такую среду материнской клетки она сформирует микроколонию, количество клеток в которой будет равно её репликативной продолжительности жизни. Такая особенность клеток К6001 штамма обусловлена тем, что ген CDC6, кодирующий фермент, входящий в состав пре-репликативного комплекса ДНК, содержится в геноме этого штамма в двух копиях, причем одна копия под индуцибельным галактокиназным промотором, а вторая под HO-промотором. Поэтому на среде, содержащей галактозу, будут делиться как материнские клетки, так и новообразованные дочерние клетки, а на среде с глюкозой будут делиться только материнские клетки, в которых идет экспрессия генов, находящихся под НО-промотором. В дочерних же клетках практически не будет экспрессии CDC6, т.к. будет наблюдаться репрессия Ash1p фактором, поэтому дочерние клетки не смогут осуществлять переход из G1 в S фазу клеточного цикла. Однако иногда некоторые дочерние клетки К6001 штамма продолжают делиться на среде с глюкозой, т.к. НО-промотор может активировать фактор Swi5p, наследуемый равномерно между материнской и дочерней клеткой (Bobola et al. 1996).
Используя К6001 штамм S. cerevisiae можно измерять среднюю репликативную продолжительность жизни клеток в жидкой среде (Jarolim et al. 2004). Для этого в жидкую среду с глюкозой помещается фиксированное количество клеток, а после определенного времени определяется финальное количество клеток, например, по оптической плотности. Соответственно, если разделить количество клеток в конце эксперимента на количество клеток в начале, можно получить среднюю репликативную продолжительность жизни материнских клеток.
В теории К6001 штамм можно использовать для обогащения культуры клеток материнскими клетками с большим репликативным возрастом для их изучения. Для этого просто достаточно инкубировать клетки в среде с глюкозой такое время, за которое они не успеют достигнуть репликативной продолжительности жизни, т.е. будут способны давать дочерние клетки.
В 2012 году другие исследователи предложили еще один способ измерения репликативной продолжительности жизни, основанный на использовании нового микроструйного устройства (Рисунок 12). В основе его действия лежит физическое удерживание материнских клеток в специальных отсеках, в то время как новообразованные дочерние клетки вымываются потоком свежей среды. Затем проходит детекция количества смытых дочерних клеток с использованием специальных флуоресцентных зондов
Измерение устойчивости клеток S. cerevisiae к стрессу в зависимости от репликативного возраста
Более того, было показано, что снижение митохондриальной функции происходило не из-за невозможности белковой деградации в менее кислых вакуолях, но, скорее, из-за невозможности накопления в таких вакуолях аминокислот. Причем, судя по всему, именно невозможность накопления нейтральных аминокилот в вакуолях приводит к дисфункции митохондрий.
Интересно, что рестрикция по калориям, возможно, увеличивает репликативную продолжительность жизни дрожжей как минимум отчасти за счет того, что снижает вакуолярный рН.
Даже несмотря на то, что рН в вакуолях репликативно старых матерей повышен, в дочерних клетках, которые они образуют, рН будет такой же как в дочерних клетках от молодых материнских клеток. Таким образом, и в плане вакуолярного рН дочерние клетки рождаются обновленными, а защелачивание вакуолей, по-видимому, можно считать еще одним фактором репликативного старения (Hughes et al., 2012).
Cейчас многие исследователи изучают факторы, влияющие на репликативную продолжительность жизни дрожжей: проводятся скрининги в поисках генов, способных снижать или повышать репликативную продолжительность жизни, проводится поиск новых факторов репликативного старения (Nystrom et al., 2014). Однако, такие исследования направлены в первую очередь на измерение максимального количества почек, которые способна дать клетка. Для дикого типа дрожжей этот параметр составляет порядка 25 делений. Однако, доля клеток с таким репликативным возрастом в популяции дрожжей крайне мала. И даже отсутствие асимметрии деления в штамме Asir2 приводит к снижению репликативной продолжительности жизни до 10-15 (Kaeberlein et al. 1999), но и клеток с таким репликативным возрастом в культуре дрожжей крайне мало, потому что 95% культуры, находящейся в экспоненциальной фазе роста составляют клетки в возрасте от 1 до 5. Исходя из этого, важно исследовать изменения, которые происходят с клетками уже на первых делениях. Причем изменения, которые претерпевает дочерняя клетка хорошо изучены и подробно описаны выше, но изменения, происходящие в клетках при последующих делениях изучены значительно хуже, и внимание им стало уделяться не так давно. Так, например, Леви и коллеги в 2012 году показали, что культура клеток дрожжей гетерогенна по экспрессии TSL1, который отвечает за регуляцию биосинтеза трегалозы. Вообще, трегалоза -основной углевод, выполняющий запасающую функцию в S. cerevisiae, который также участвует в формировании стрессоустойчивости к осмотическому, окислительному и тепловому шоку (Pereira et al, 2001). И из данных Леви следует, что концентрация Tsl1p положительно коррелирует с возрастом уже на самых ранних этапах репликативного старения. Более того, высокая концентрация Tsl1p приводила к снижению скорости роста и повышению стрессоустойчивости клеток. Отсюда авторы сделали вывод, что клетки в культуре клеток дрожжей дифференцированы: часть клеток направлены на быстрое удвоение и высокую скорость роста, а часть клеток – на высокую стрессоустойчивость. Такую стратегию в литературе называют разделение рисков (от англ. «bet hedging»).
В 2014 году уже другие авторы, используя данные Леви и соавторов при помощи моделирования показали, что штамм, использующий стратегию по разделению рисков, будет иметь преимущество перед штаммом, у которого такой стратегии не имеется (Hellweger et al, 2014). Выполняется это, безусловно, в том случае, если культура клеток периодически подвергается сильному стрессу.
Дифференцировка культуры клеток дрожжей в результате асимметрии деления далеко не единственна. На настоящий момент описаны несколько возможных способов дифференцировки клеток дрожжей. При росте на твердой агаризованной среде дрожжи формируют микроколонии. На богатой всеми питательными веществами среде такие колонии будут выглядеть округлыми, гладкими, без выраженной морфологии (Рисунок 18 (Granek 2010)).
Поиск генов, связанных с ранним снижением стрессоустойчивости клеток дрожжей
Компетентные клетки готовили следующим образом: заранее растили ночную культуру E.coli, затем разводили 2.5 мл ночной культуры в 250 мл LB и растили на +18С до оптической плотности 0.5 (550 нм). Затем суспензию клеток разливали по 50 мл пробиркам и охлаждали на льду. После этого клетки 4 раза отмывали от среды деионизованной водой, ресуспендировали в 200 мкл 10% глицерина и замораживали в жидком азоте.
Для трансформации клетки размораживали на льду, добавляли ДНК, переносили в предварительно охлажденные кюветы (1 мм) и подвергали действию электрического тока (1800 В). Затем добавляли 500 мкл LB и инкубировали при 30С 30-60 минут. После этого клетки высевали на селективные чашки (Бочарова, 2008).
Подращивали штамм в течение 2-3 часов в жидкой среде или отбирали дрожжи микробиологической петлей с чашки, после чего ресуспендировали в жидкой среде. Центрифугировали суспензию 2 мин, 4000 об/мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 200 мкл Li-ацетатного буфера, после чего инкубировали 15 мин, 30С. Центрифугировали 2 мин, 4000 об/мин, удаляли супернатант. Осадок ресупендировали в 70 мкл Li-ацетатного буфера и инкубировали 15 мин, 30С. К данной суспензии добавляли 4 мкл ДНК-носителя, 0,1-2 мкг ДНК для трансформации и 120 мкл ПЭГ-4000, тщательно перемешивали на вортексе. Оставляли суспензию при 30С. Через 30 мин суспензию дрожжевых клеток подвергали тепловому шоку при 42С, 15 минут, на термостате. Осаждали клетки центрифугированием, супернатант удаляли. Осадок ресуспендировали в 100 мкл Li-ацетатного буфера, после чего рассеивали на чашки Петри с селективной средой. Чашки с трансформированными дрожжами помещали в термостат, 30С, на 2-4 суток (Бочарова, 2008).
Получение мутантных линий дрожжей В ходе работы часто возникала необходимость получить мутантные линии с полностью инактивированным геном. Эту задачу можно решить следующим способом: из штамма коллекции Euroscarf, содержащего кассету KanMX4 вместо нарушенного гена, выделяли ДНК и использовали ее в качестве матрицы для ПЦР. Праймеры для ПЦР конструировали таким образом, что с двух концов последовательности длиной 18-20 нуклеотидов были комплементарны последовательности ДНК, фланкирующей ген, который необходимо было инактивировать. Параллельно конструировали тестовые праймеры, один из которых был комплементарен последовательности ДНК, фланкирующей нарушаемый ген, а другой комплементарен последовательности в кассете KanMX4.
В ходе работы возникала также необходимость охарактеризовать локализацию некоторых белков: сделать так, чтобы клетки дрожжей экспрессировали гибрид данного белка с GFP. Для этого заказывали «длинные» праймеры, сконструированные таким образом, что с одного конца последовательность длиной 50-60 нуклеотидов была комплементарна последовательности ДНК, фланкирующей ген, который необходимо было модифицировать, а с другого конца последовательность нуклеотидов была комплементарна последовательности ДНК, фланкирующей последовательности GFP-HIS3MX6 в плазмиде pFA6a-GFP-HIS3MX6. При этом следили, чтобы при трансформации такой последовательности последовательность GFP попадала в ту же рамку считывания, что и данный ген.
Эффективность ПЦР оценивали методом аналитического электрофореза. ПЦР-продукт переосаждали. Затем клетки соответствующего штамма (как правило, W303) трансформировали продуктом ПЦР и переносили на YPD, содержащую антибиотик генетицин (G418), или, соответственно, на синтетическую селективную среду и отбирали наиболее крупные колонии. Для проверки эффективности трансформации проводили аналитическую ПЦР с тестовыми праймерами и затем электрофорез в агарозном геле (Бочарова, 2008).
