Содержание к диссертации
Введение
Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И ПАТЕНТОВ 11
1.1 Мониторинг перспективности выбранного направления исследований 11
1.2 Микроорганизмы как продуценты белка 22
1.2.1 Рост и развитие микробных культур 26
1.2.2 Фазы роста микроорганизмов при периодическом культивировании 27
1.2.3 Двухфазность развития популяций в условиях процесса брожения 29
1.3 Структура клеточной стенки и биохимический состав дрожжевой клетки 30
1.4 Перспективные способы деструкции клеточной стенки дрожжей 40
1.5 Основы ферментативного гидролиза клеточной стенки дрожжей 46
1.6 Применение белковых препаратов, полученных на основе микробной биомассы в пищевой промышленности 51
1.6.1 Использование цельной биомассы 51
1.6.2 Использование частично облагороженной биомассы микроорганизмов 52
1.6.3 Белковые изоляты 52
1.6.4 Использование аминокислотных смесей в качестве пищевых и биологически активных добавок 54
Глава II ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 58
2.1 Цель и задачи исследования 58
2.2 Материалы и методы исследования 59
2.2.1 Методы определения биохимических показателей 60
2.2.2 Методы определения каталитической способности ферментных препаратов
2.2.3 Методы определения функциональных характеристик получаемых продуктов
2.2.4 Методика математической обработки экспериментальных данных
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава III СКРИНИНГ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНОГО ПРОДУЦЕНТА БЕЛКА- 70
3.1 Изучение продуктивности штаммов хлебопекарных дрожжей 70
3.1.1 Отбор штаммов дрожжей, отличающихся высокой скоростью роста 70
3.1.2 Влияние начальной концентрации растворимых углеводов в сусле на скорость роста и накопление биомассы дрожжей 73
3.1.3 Исследование влияния рН пшеничного сусла на скорость роста и накопление биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae 85
3.1.3.1 Влияние различных значений рН на скорость 4 роста дрожжей в разных точках кривой роста 86
3.1.3.2 Влияние исходных значений рН пшеничного сусла на скорость роста и накопление биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.1.4 Исследование влияния различных солей, внесенных в пшеничное сусло, на скорость роста и накопление биомассы дрожжей
Глава IV ИЗУЧЕНИЕ БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ РАЗЛИЧНОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 97
4.1 Определение состава ферментного комплекса ферментных препаратов микробного происхождения 100
4.2 Изучение механизма гидролиза клеточной стенки дрожжей с применением ферментных препаратов 105
4.2.1 Модельные опыты по биокатализу 105
индивидуальных субстратов — структурных полимеров клеточной стенки дрожжей
4.2.1.1 Модельные опыты по биокатализу полисахаридов клеточных стенок 106
4.2.1.2 Модельные опыты по биокатализу полимеров клеточной стенки дрожжей под действием различных ферментативных систем 108
4.2.1.3 Модельные опыты, направленные на подбор оптимальной мультиэнзимной композиции для эффективного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей 110
4.2.2 Исследование процессов ферментативной 115
деструкции клеточных стенок дрожжей при
получении препарата белка (I стадия)
4.2.2.1 Исследование процессов деструкции В-глюканов и белковых полимеров клеточных стенок дрожжей (I стадия) 116
4.2.2.2 Изучение динамики деструктивных воздействий ферментных препаратов на клеточную стенку дрожжей на I стадии ферментолиза 124
4.2.2.3 Исследование процессов деструкции полисахаридов клеточных стенок дрожжей (II стадия) 128
4.2.2.4 Изучение возможности повышения проницаемости клеточной стенки дрожжей поверхностно-активными веществами 134
4.3 Результаты электронно-микроскопического исследования дрожжевых клеток после воздействия ферментных препаратов 137
Глава V ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК 139
5.1 Подбор эффективного осадителя для извлечения 139
белковых фракций из супернатанта
5.2 Фракционирование белковых веществ дрожжей 141
Глава VI ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНО ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ- 145
Глава VII ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 153
ВЫВОДЫ 157
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 159
ПРИЛОЖЕНИЯ 172
- Мониторинг перспективности выбранного направления исследований
- Методы определения биохимических показателей
- Изучение продуктивности штаммов хлебопекарных дрожжей
Введение к работе
Актуальность. Актуальность выбранного направления исследований обусловлена сложившимся дефицитом белка в структуре питания населения России. Продовольственная проблема, связанная с недостатком биологически полноценных продуктов, со временем не только не теряет своей остроты, но и становится одной из актуальнейших. Эффективность решения этой проблемы определяется использованием качественно новых методов производства пищи, а также привлечением новых сбалансированных источников пищевого белка, одним из которых является белок микроорганизмов. Работы многих ученых посвящены вопросам изучения возможности использования микроорганизмов как источников белковых веществ (Коновалов В.А., 1975; Беликов В.М. 1977; Шкляр Б.Х.,1977; Латов В.К., 1990; Римарева Л.В., 1993; Иванова Л.А., 1998; Неклюдов А.Д., 2000; и
ДР-)-
Наиболее перспективным источником пищевого белка является дрожжевая
биомасса, что объясняется полноценностью белковых веществ, аминокислотный^
скор которых приближается к животному белку, а также безопасностью» и
абсолютным отсутствием токсичности дрожжей. Кроме того, наличие витаминов,
ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать дрожжи как
перспективные субстраты для получения биологически активных добавок. Более
того, к настоящему времени разработано много способов производства белковых
концентратов и изолятов микробного происхождения. Однако, до сих пор не
созданы эффективные методы выделения белка из дрожжевой клетки, которые
обеспечивали бы его полноценное усвоение. Существующие физические и
химические методы биотрансформации клеточной стенки дрожжей имеют ряд
недостатков технического и технологического характера и не обеспечивают
получение качественного белкового продукта с высокой биологической ценностью.
Поэтому перспективным направлением является использование ферментативных
процессов, которые позволяют в «мягких» условиях получать пищевые белковые
добавки с функциональными свойствами для решения проблемы коррекции питания
населения и получения сбалансированных биологически полноценных продуктов.
8 Цель и* задачи исследования. Цель настоящих исследований состояла в
разработке научно обоснованного способа получения белкового препарата на основе
направленного ферментативного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей.
Для достижения поставленной цели исследований предусмотрено решение ряда
задач:
на основе анализа структуры строения клеточной стенки дрожжей и возможных способов, ее деградации научно обосновать состав ферментативной системы, необходимой для деструкции дрожжевой клетки и экспериментально исследовать степень воздействия1; индивидуальных ферментов на структурообразующие биополимеры клеточной стенки;
провести сравнительные исследования ферментных препаратов отечественного и импортного производства по составу основных и минорных ферментов комплекса; уровню их активностей и осуществить скрининг наиболее перспективных;
разработать эффективную мультиэнзимную композицию (МЭК)« с научно-обоснованным соотношением ферментов в составе выбранного комплекса для трансформации биополимеров клеточной стенки дрожжей;
- исследовать процессы выделения белковых веществ протоплазмы клеток и
разработать принципиальную схему получения белковых продуктов с
использованием энзиматической деструкции дрожжевой биомассы с
максимально возможным выделением белковых веществ из исследуемого сырья;
охарактеризовать полученный белковый препарат по биохимическим и функционально-технологическим показателям;
разработать научно-техническую документацию для производства белкового препарата.
Научная новизна- работы. Получен новый экспериментальный материал, позволивший выявить закономерности биокатализа структурообразующих полимеров клеточной стенки дрожжей. Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены состав МЭК и условия ферментативной деструкции полимеров клеточной стенки. Выявлен синергизм действия ферментов
9 МЭК, повышающий степень деградации биополимеров. На основе установленной
зависимости выхода белка от состава МЭК и уровня в нем ферментативных
активностей (протеазы, Р-глюканазы, маннаназы и хитиназы) разработан
принципиально новый способ направленного ферментативного гидролиза клеточной
стенок,дрожжей с выделением белковых веществ протоплазмы.
Практическая значимость. Осуществлен скрининг продуктивного по белку
штамма дрожжей и разработаны оптимальные МЭКи и условия ферментативной
деструкции клеточных стенок.
Разработана технологическая схема получения, белковых препаратов из
биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, позволяющая:
- исключить применение химических реагентов (кислот и щелочей) в результате
использования подобранного МЭК для деструкции клеточных стенок;
повысить выход белковых веществ в сравнении с технологией без применения ферментативной обработки;
улучшить качество целевого продукта за счет сохранения полимерности структуры белка и повышения его биологической полноценности;
получать белковый препарат (67% белка), обладающий влагоудерживающей. (1:2,5) и жироудерживающей (1:0,7) способностью.
Разработана нормативная документация на технологический процесс и получаемую продукцию (Технологическая инструкция по производству белкового препарата на основе биомассы дрожжей, Технические условия на препарат белковый дрожжевой). Проведены производственные испытания и наработаны опытные партии белкового препарата на Мичуринском экспериментальном заводе и во ВНИТИБП- ЗАО «Биопрогресс».
Апробация работы. Основные положения работы были представлены > на следующих конференциях:
- XII Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы создания
продуктов здорового питания. Наука и технологии», Углич, 2006 г;
10 -V Юбилейной школе - конференции «Высокоэффективные пищевые технологии,
методы и средства для их реализации» Московский Государственный университет
пищевых производств, 2007г;
Научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий», Углич, 2007г;
X Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы мясной промышленности: инновации, качество, управление», ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова, Москва, 2007г.
Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», ВНИТИБП, Щелково, 2007г.
4-м Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях», Москва, 2008г. Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и патентов, экспериментальной части, состоящей из 7 глав, выводов, списка литературы, включающего 140 наименования работ отечественных и иностранных авторов и приложения. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 34 рисунков.
Мониторинг перспективности выбранного направления исследований
В настоящее время разработана масса методов получения белковых продуктов на основе использования микробной биомассы. В данном разделе литературного обзора была поставлена цель провести анализ существующих методов воздействия на микробные продуценты белка и разработать стратегию наиболее перспективного пути получения белковых препаратов.
Дрожжи как источник высококачественного микробного белка занимают особое место в биотехнологических производствах мира и используются как в качестве кормовых добавок при изготовлении комбинированных кормов, так и в пище человека. Биомасса дрожжей состоит наполовину из белка и усваивается организмом человека на 85 - 88%, занимая по этому показателю промежуточное положение между белками растительного и животного происхождения [Иванова с соав., 2003; Доценко с соав., 2002]. Кроме того, у представителей рода Saccharomyces не найдено ни одного патогенного штамма, что немаловажно при получении из них биологически активных добавок пищевого и медицинского назначения [Ларионов В.Л., 1985]. Поэтому проблема полноценного использования дрожжей в качестве продукта питания человека остро стоит на повестке дня в связи с высоким содержанием белка и наличием в нем необходимых аминокислот, а также богатого комплекса витаминов.
Существуют различные методы трансформации микробной клетки. Одним из немаловажных факторов является степень (глубина) гидролиза дрожжевой биомассы, а также способ гидролиза. Так, при длительном (более 5 часов) кислотном гидролизе лизин может переходить в недоступную для человека форму [Pellet P.L.,et al., 1980], может происходить протонирование серосодержащих аминокислот, а также аминокислот, содержащих ароматическое кольцо [Науменко Н.И., с соавт.,1985]. Кроме того, химических рацематов, а аминокислоты D-формы не усваиваются организмом человека. В связи с этим, возникает необходимость разработки способов воздействия на микробные субстраты, позволяющие максимально сохранить ценность природных ресурсов при наиболее полном извлечении целевого продукта.
Анализ литературных источников и патентный поиск показал, что работы многих авторов посвящены вопросам эффективной деструкции клеточных стенок микроорганизмов, разработан ряд способов воздействия на клеточную стенку с целью выделения внутреннего содержимого дрожжевой клетки.
Известен способ получения двух типов дрожжевых экстрактов, используемых в качестве пищевкусовых и белковых добавок в пищевой и медицинской промышленности. Дрожжевой экстракт, полученный на первой стадии, содержит 35-45% белка, 10-15% нуклеиновых кислот, 15-20% углеводов и имеет пищевую ценность 75-80%. Выход экстракта составляет 75-80%. Это достигаете» тем, что при способе получения дрожжевых экстрактов на первой стадии биомассу микроорганизмов обрабатывают 0.01-2Н раствором соляной кислоты при температуре 80-100С в течение 30-45 минут, доводят до рН2.5-5.0, разделяют кислотный экстракт и клеточный концентрат. На второй стадии клеточный концентрат обрабатывают 0.1-1Н раствором соляной кислоты при температуре 120-160С в течение 1-3 минут, доводят до рН не менее 3.0 и отделяют дрожжевой экстракт.
При предлагаемой обработке получают два целевых продукта, на первой стадии получается дрожжевой экстракт с повышенным содержанием нуклеиновых кислот, который может использоваться как пищевая добавка, улучшающая вкусовые качества и пищевую ценность продукта.
На второй стадии получается дрожжевой экстракт с пониженным содержанием нуклеиновых кислот, который может использоваться в качестве белковой добавки с повышенной пищевой и биологической ценностью.
Методы определения биохимических показателей
Содержание влаги в дрожжах определяли высушиванием, после предварительной гомогенизации. Определение вели с помощью прибора Чижовой или высушиванием до постоянного веса при 100-105 С [ГОСТ 171-81, Грачева И.М., Смирнова Т.А. Общая технология микробиологических производств. Приложения к лабораторному практикуму для студентов технологического факультета. //М., 1971. - 170 с].
Содержание общего экстракта
Содержание сухих растворимых веществ в дрожжах определяли рефрактометрическим методом. Для этого экстрагирование ведут в течении 5 часов для сухого сырья и 2 часа для влажного при температуре 80 С при предварительном разрушении клеточной стенки [Грачева И.М., Смирнова Т.А. Общая технология микробиологических производств. Приложения к лабораторному практикуму для студентов технологического факультета. //М., 1971. -170 с].
Определение растворимых сухих веществ Концентрацию сухих веществ на различных этапах работы измеряли с помощью лабораторного рефрактометра марки РЛ, действие которого основано на зависимости показателя преломления раствора от его концентрации.
Содержание белка Для определения содержания! белка использовали метод Лоури, который сочетает в себе биуретовую реакцию (на пептидные связи) и реакцию Фолина — Чокальтеу (на тирозин). В результате реакции растворы приобретают синее окрашивание, далее определяемое на фотоэлектроколориметре [Ермаков А.И., Арасимович В.В. и др. Методы биохимического исследования растений, Малый практикум по биохимии под ред. Юркевича В.В., МГУ им. Ломоносова].
При этом для сокращения времени на? подбор разведений пробы для определения белка использовали более быстрый метод Бредфорда в модификации Абрамова с соавторами. [Абрамов Ш.А., Эфендиева Д.А., Котенко С.Ц. Влияние питательной среды на содержание белка в дрожжах Saccharomyces cerevisiae].
В процессе культивирования дрожжей для определения истинного белка клеток использовали классический метод Къельдаляс (ГОСТ 25011-81), основанный на минерализации органических , соединений биологических объектов с последующим определением общего.азота по количеству образовавшегося аммиака.
Содержание растворимых углеводов
Концентрацию растворимых углеводов в среде при культивировании дрожжей определяли колориметрическим антроновым методом [«Инструкция по технологическому и микробиологическому контролю спиртового производства». 1986, Агропромиздат, Москва].
Определение рН растворов Величину рН питательных сред и культуральных жидкостей, а также растворов белка определяли потенциометрическим методом с использованием универсального рН-метра согласно инструкции к прибору.
Изучение продуктивности штаммов хлебопекарных дрожжей
В работе проведен анализ более 80 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae коллекции музея ГНУ ВНИИЖТ Россельхозакадемии.
Отбор перспективных штаммов: дрожжей Saccharomyces cerevisiae с высокой, скоростью роста проводили по показателю средних значений удельной скорости роста в течение культивирования (рис. 5).
Отобраны 14 штаммов по удельной скорости роста \i, значение которой превышало 0,13 час"1.
Из них наибольшей удельной скоростью роста обладали штаммы дрожжей № 258, 265 и 267 - 0,1715; 0,1725 и 0,1797 час"1 соответственно. При культивировании отобранных 14 штаммов дрожжей на пшеничном сусле подтвердились те же закономерности роста.
В результате работы отобраны 3 штамма по селективному признаку -удельной скорости роста (п.), которая является средним суммарным показателем скорости синтеза белка за период культивирования исследуемых штаммов дрожжей на солодовом сусле. Результаты серии экспериментов показали, что наибольшие величины скорости роста определены у штаммов дрожжей: №№ 258, 265 и 267.
Показатели содержания белкаk в клетках, средние значения скорости роста и конечного количества белка восемнадцатичасовой культуры при использовании в составе питательной среды пшеничного сусла (9% СВ.) у 3-х лучших штаммов дрожжей представлены в таблице 5. Как видно из полученных данных, по исследуемым показателям наиболее высокое содержание белка отмечается у штамма дрожжей № 265. Дальнейшие исследования в настоящей работе проводились с данным штаммом как наиболее высокопродуктивным.
Влияние начальной концентрации растворимых углеводов в сусле на скорость роста и накопление биомассы дрожжей
Исследование динамики потребления углеводов и накопления биомассы дрожжей в зависимости от исходной концентрации растворимых углеводов (РУ) проведены при культивировании на фильтрованном пшеничном сусле, приготовленном «жестким» методом обработки сырья под давлением.
Рост дрожжей изучали- в течение 18 часов в условиях периодического культивирования при аэрации на шейкере «Environmental shaker ES-20» при 250 об/мин и температуре 28С.
