Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 5
1.1. Биохимические основы действия фибринолитической и свертывающей систем крови 5
1.1.1. Современные представления о механизме свертывания крови и тромбообразования 5
1.1.2. Фибринолитическая система крови 14
1.2. Предварительная обработка крови убойных животных 18
1.2.1. Стабилизация крови 18
1.2.2. Консервирование крови 20
1.2.3. Совмещенные способы стабилизации и консервирования крови 24
1.3. Прикладные аспекты использования крови на лечебные и пищевые цели 28
1.3.1. Биологическая ценность крови убойных животных 28
1.3.2. Биологические препараты из крови 31
1.4. Метал л опор фирины 33
1.4.1. Строение металлопорфиринов 36
1.4.2. Способы получения порфиринов и металлопорфиринов 41
1.4.2.1. Гем крови как источник порфиринов 42
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ 50
Цель и задачи исследования 51
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53
2.1. Объекты исследования и схема проведения эксперимента 53
2.2. Методы исследования 57
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 61
3.1. Исследование влияния продуктов жизнедеятельности Lactobacillus acidophilus на свертывающую систему крови 61
3.1.1. Теоретические предпосылки использования молочной сыворотки в качестве антикоагулянта и консерванта 61
3.1.2. Исследование влияния компонентов молочной сыворотки на процесс коагуляции крови 65
3.1.3. Электрофоретические исследования белков смеси кровь : молочная сыворотка 71
3.1.4. Исследование бактериостатического действия молочной сыворотки 76
3.2. Разработка способа выделения гема 84
3.2.1. Исследование влияния молочной сыворотки на степень гемолиза клеток крови 84
3.2.2. Оценка степени деградации гемоглобина 88
3.3. Разработка рациональных режимов выделения гема 92
3.3.1. Влияние условий термостати рования на степень расщепления гемоглобина исследуемой смеси кровь : молочная сыворотка 92
3.3.2. Оптимизация процесса получения препарата гема крови 98
3.4. Исследование аминокислотного состава выделенных белков смеси кровь : молочная сыворотка 113
3.5. Сравнительный анализ разработанного способа получения гема с методом Шалфея -Ненского 116
3.6. Идентификация гема крови методом ИК-спектроскопии 118
ВЫВОДЫ 120
ПРИЛОЖЕНИЯ 121
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
- Биохимические основы действия фибринолитической и свертывающей систем крови
- Объекты исследования и схема проведения эксперимента
- Исследование влияния продуктов жизнедеятельности Lactobacillus acidophilus на свертывающую систему крови
Введение к работе
Кровь, как внутренняя среда организма выполняет весьма важные функции - транспорт газов, питательных веществ, конечных продуктов обмена, координацию и регуляцию биохимических процессов гемостаза и другие. Наличие в крови ответственных за эти процессы белков, ферментов, гормонов и других физиологически активных веществ обуславливает ее высокую биологическую ценность и специфические свойства. Поэтому кровь сельскохозяйственных животных относится к перспективным сырьевым источникам для производства пищевой, кормовой, медицинской и технической продукции.
Среди большого числа биологически активных веществ крови, которые можно с полным правом назвать «молекулами жизни», особое место принадлежит комплексным соединениям порфиринов с рядом металлов. К числу таких металлопорфиринов, в первую очередь, относится простетическая группа гемоглобина крови - гем или протопорфирин.
Особые свойства металлопорфиринов, в том числе и протопорфирина нашли широкое применение в разнообразных областях научных исследований, в промышленности красящих пигментов, полупроводников, катализаторов, биосенсеров.
Успехи в области практического использования, в частности, гема в значительной степени определяются способами его получения или выделения из крови. Практикуемые в настоящее время способы выделения гема из крови убойных животных, не позволяют достичь его максимально возможного выхода, и базируются на жестком физико-химическом воздействии на кровь, и не рассчитаны на переработку больших объемов крови. В последнем контексте проблемными становятся процессы разрушения гема до билирубина в результате порчи крови как
микробиологической, так и автол итической, а также процессы предпочтительной ее механической стабилизации.
Практическая значимость гема, а также отсутствие доступного способа его производства определяют актуальность разработки способа получения гема на основе комплексного подхода к процессам стабилизации, консервирования крови убойных животных.
Биохимические основы действия фибринолитической и свертывающей систем крови
Свертывание крови представляет собой ряд процессов, приводящих к переходу крови из жидкого состояния в гелеобразное, т.е. к тромбообразованию. В жизнедеятельности организма феномен тромбообразования может иметь различное значение. С одной стороны, благодаря формированию тромба при нарушении целостности кровеносных сосудов, организм защищается от кровопотери. С другой стороны, тромбообразование внутри сосуда ведет к нарушению кровотока и трофики жизненно важных органов и тканей, что является важным этапом в патогенезе многих заболеваний [49, 55].
В свертывании крови (гемостазе) различают 2 звена: клеточный и плазменный гемостаз. Под клеточным гемостазом понимается склеивание форменных элементов крови между собой (агрегация), их прикрепление к сосудистой стенке или чужеродной поверхности (адгезия), а также высвобождение из форменных элементов веществ, активирующих плазменный гемостаз. Плазменный гемостаз представляет собой каскад реакций, в которых участвуют факторы свертывания крови, завершающийся процессом фибринообразования. Образовавшийся фибрин подвергается далее разрушению под влиянием плазмина (фибринолиз) [49, 73].
Среди клеток крови, участвующих в процессах агрегации и адгезии лучше всего изучены изменения, происходящие в тромбоцитах. Между тем, следует отметить, что важную роль в образовании первичного тромба играют и лейкоциты. Тромбоциты и лейкоциты являются «силами быстрого реагирования», образующими агрегаты и адгезирующими к поверхности несколько быстрее, чем возникают отложения фибрина. Нельзя также умалять роль эритроцитов в образовании тромба и нарушении микроциркуляции. В силу больших размеров эритроциты, склеиваясь, могут существенно нарушать капиллярный кровоток. Следует, однако, отметить, что механизмы участия лейкоцитов и особенно эритроцитов в образовании тромба еще недостаточно изучены. В силу этого практически во всех современных руководствах изложение материалов о клеточном гемостазе вынуждено ограничиваться описанием изменений, происходящих в тромбоцитах, составляющих основную массу первичного тромба [13, 49].
В последние два десятилетия знания о биохимических основах адгезивно-агрегациошюй реакции тромбоцитов существенно расширились. Показано, что в физиологических условиях тромбоциты не агрегируют между собой и не приклеиваются к сосудистой стенке в силу того, что последняя постоянно генерирует простациклин (простагландин 12). Простациклин образуется из арахидоновой кислоты. Это наиболее мощный физиологический антиагрегант. Механизм действия простациклина связан с активацией аденилатциклазы, фермента, превращающего АТФ в ц-АМФ. ц-АМФ в свою очередь активирует ферменты, приводящие к перемещению кальция из цитоплазмы в электрон но плотные гранулы, где он прочно связывается с белками.
Определенное значение в поддержании суспензионной стабильности тромбоцитов имеет белок тромбомодулин, а также некоторые пептиды. При повреждении эндотелия обнажается субэндотелий, происходит экспрессия адгезивных белков и рецепторов на поверхности клеток, уменьшение генерации простациклина, антиагрегационной активности тромбомодулина и др. К белкам субэндотелия, связывающим клетки крови, относятся коллаген, фактор Виллебранда, тромбоспондин, фибронектин и др.
Связывание агонистов с рецепторами приводит к освобождению кальция из внутритромбоцитарных депо или способствует входу ионов кальция в тромбоциты. Свободный кальций, вышедший в цитоплазму из органелл или проникший из плазмы, активирует ряд протеаз, усиливает экспрессию рецепторов ІІЬ/ІІІа на плазматической мембране, вызывает сокращение контактильных белков и освобождение из а-гранул тромбоцитов фактора Виллебранда, фибриногена, тромбоспондина, фактора V, тромбоцитарного фактора 4, b-тромбоглобулина и др. (реакция высвобождения). Наряду с кальцием из электронноплотных гранул выходят АДФ и серотонин. Кальций активирует фосфолипазу А2 и арахидоновая кислота начинает превращаться в простагландины G2, Н2 , а затем в более мощный естественный индуктор агрегации тромбоксан А2. Из арахидоновой кислоты образуется также 12-гидроксиэйкозатетраеновая кислота, аттрактант, включающий в первичный тромб нейтрофилы. Освобождается также фактор агрегации тромбоцитов (ФАТ) - продукт биотрансформации фосфолипидов, АДФ, серотонин, простагландини G2 , 1 , тромбоксан А2 , ФАТ, взаимодействуя с соответствующими рецепторами, повышает концентрацию ионов и экспрессируя рецепторы ПЬЛПа, активируют агрегацию и адгезию тромбоцитов. Таким образом, активация клеточного, в частности, тромбоцитарного гемостаза, имеет характер цепной реакции. Один активированный тромбоцит активирует много других. Высвобождаемые из тромбоцитов белки - фактор Виллебранда, фибриноген, тромбоспондин служат клеем, который связывает тромбоциты друг с другом и между собой. Тромбоспондин связывает тромбоциты с фибрином, коллагеном, эндотелиоцитами, моноцитами и макрофагами. Моноциты и макрофаги (как и ряд других клеток) сами также синтезируют и секретируют тромбоспондин. Именно благодаря тромбоспондину агрегация приобретает необратимый характер. Фибронектин также синтезируется различными типами клеток. Он связывается не только с рецепторами форменных элементов крови и эндотелиальных клеток, но и с фибрином, что способствует упрочнению тромба.
Объекты исследования и схема проведения эксперимента
Исходным сырьем для получения гема и комплекса белков служили:
1 - вторичное сырье мясоперерабатывающих предприятий - кровь крупного рогатого скота;
2 - вторичное сырье молокоперерабатывагощих предприятий обезжиренное молоко;
3 - культура молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 20Т.
Молочную сыворотку получали путем фракционирования сквашенного при 37С чистыми культурами Lactobacillus acidophilus обезжиренного молока до достижения титруемой кислотности 260-270Т. Выход сыворотки составлял 70%.
Молочнокислые продукты как правило вырабатываются с кислотностью 80-120Т. Превышение допустимых пределов титруемой кислотности регламентируется НТД. В связи с чем, молочную сыворотку титруемой кислотностью 260-270Т относят к некондиционному сырью. В таблице 5 представлены экспериментальные данные по химическому составу молочной сыворотки с титруемой кислотностью 260-270Т.
Кровь убойных животных получали и стабилизировали молочной сывороткой в условиях цеха первичной переработки скота ОАО «Бурятмясопром» (г. Улан-Удэ) и ООО «Алексис» (г. Усолье-Сибирское»).
Культура молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 20Т приобретена во ВНИИМП.
Выбор данной культуры обусловлен тем, что она относится к пробиотикам [160], является энергичным кислотообразователем, что важно для решения проблемы консервирования и стабилизации крови. Предельная кислотность ее составляет 255Т [53].
Lactobacillus acidophilus относительно кислотоустойчива, способна расти на средах с низким значением рН (3,8 и ниже) [41, 62, 63]. Обладает незначительным воздействием на белки и жиры, что позволяет сохранить БАВ крови. Способна расти на молоке, содержащем 0,4% фенола, резистентна к желчи (до 40%), что позволяет ей выживать в неблагоприятных условиях, обусловленных данными соединениями или их производными [52, 53].
Данный пробиотик тормозит рост дрожжевых микроорганизмов Candida albicons, кишечной палочки и других вредных бактерий, помогая организму вырабатывать интерферон, усиливая иммунную функцию [122, 134, 135, 152]. В основном Lactobacillus acidophilus обитают в тонком кишечнике [52, 126].
Lactobacillus acidophilus обладает механизмами защиты от токсичных форм кислорода, такими как псевдокаталаза, супероксиддисмутаза. Кроме толерантности к кислороду она обладает устойчивостью к спирту, перекиси водорода [33, 52. 150].
Объектами исследования служили:
1 - смеси, полученные в результате смешивания молочной сыворотки с кровью в разных соотношениях 2,5:1,0; 1,5:1,0; 1,0:1,0; 1,0:1,5; 1,0:2,5;
2 - молочная сыворотка с титруемой кислотностью 260-270Т;
3 - кровь, стабилизированная фосфатами;
4 - сухой препарат гема;
5 - концентрат белков.
Экспериментальные исследования проводились на базе кафедры «Биотехнология», Гематологического детского центра при ВСМП, Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск, апробация и внедрение биотехнологического способа обработки крови в условиях предприятия ООО «Алексис» (г. Усолье-Сибирское).
Исследование влияния продуктов жизнедеятельности Lactobacillus acidophilus на свертывающую систему крови
Кровь в норме стерильна. Исключить ее контаминацию микрофлорой окружающей среды во время обескровливания животных, даже полым ножом, не представляется возможным. Следовательно, необходимо создать и поддерживать неблагоприятные условия для развития тех микроорганизмов, оптимальной средой для которых является кровь.
Одним из способов подавления контаминирующей микрофлоры является формирование антагонизма микроорганизмов, обусловленного биосинтезом неспецифических антимикробных веществ, таких как органические кислоты, перекиси, спирты и т.п. [126]. Образование органических кислот микроорганизмами имеет двоякое значение. С одной стороны, это специфическое приспособление к созданию благоприятных условий для развития продуцента кислот, с другой - резкий сдвиг рН субстрата в кислую зону, что в свою очередь служит средством устранения конкурентной микрофлоры [36, 72].
Естественными продуцентами органических кислот и антагонистами гнилостной микрофлоры являются молочнокислые бактерии - пробиотики [117, 155, 159]. Еще И.И. Мечников показал способность молочнокислых бактерий, обитающих в кишечнике человека вытеснять гнилостные микроорганизмы. Основным из продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий, обладающих антагонистическим действием, является молочная кислота. Вероятно, определенный вклад вносят перекись водорода и антибиотические вещества, образуемые этими бактериями [5, 128, 165]. Поэтому для длительного сохранения пищевых продуктов и их защиты добавляют 0,1-0,3% (1-3 мг/мл) молочной кислоты и ее натриевой или кальциевой солей [52, 117], т.е. это концентрации при которых проявляется бактериостатическое действие.
Естественно кровь не является питательной средой для развития молочнокислых микроорганизмов. Однако имеются сведения об их жизнеспособности [41, 52, 160] на данной среде. При этом отмечается наличие синтеза псевдокаталазы. Очевидно, что молочнокислые бактерии способны синтезировать апоэнзим каталазы, но не ее коферментную часть (геминовую группу). На активность такой каталазы не влияет изменение рН среды от 7,0 до 4,5 [52].
Оценка свойств составных компонентов крови и практического опыта в области ее предварительной обработки позволила сделать вывод о возможности использования продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий не только для консервирования [41], но и для процесса стабилизации ее жидкого состояния.
Текучее состояние крови в сосудах поддерживается благодаря наличию в организме противосвертывающей и фибринолитической систем. Антикоагулянты блокируют активность компонентов свертывающей системы. При этом их действие распространяется лишь на активированные факторы свертывания, не влияя на профакторы. Фибринолитическая способность реализуется через фибринолизин - плазмин, находящийся в неактивной форме в виде плазминогена [49,55].
В норме молоко [31, 74], как секреторная жидкость, содержит активатор плазминогена, способствующий поддержанию проходимости секреторных протоков, также как бактериальная стрептокиназа приобретает активность, комплексуя с плазминогеном.
Похожие диссертации на Влияние молочной сыворотки на свертывающую систему крови убойных животных и разработка биотехнологического способа получения протопорфирина
