Введение к работе
з *
Актуальность работы. В настоящее время в мировой клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности -противоопухолевой (онкологические заболевания системы кровообращения), противовирусной (гепатит С, герпес и др.), иммуносупрессорной (рассеянный склероз, трансплантация костного мозга). Терапевтический эффект использования препаратов на основе модифицированных нуклеозидов при лечении злокачественных поражений системы кроветворения достигает 80% полных ремиссий после одного курса монохимиотерапии. Модифицированные нуклеозиды успешно сочетаются с препаратами последнего поколения на основе моноклональкых антител (Rituximab и САМРАТН-1Н). Ведутся работы по изучению комплексной терапии рассеянного склероза и опухолевых поражений системы кроветворения кладрибином и стволовыми клетками.
В России зарегистрированы для клинического использования множество препаратов на основе аналогов модифицированных нуклеозидов, например флудара** ("Fludara", Shering AG, Jonson&Jonson), рибавирин (ICN Pharraa). Стоимость курса лечения кладрибином (50-70 мг) составляет 3500 долларов США, а курс лечения флударабином (1.3-1.5 г) обойдется пациенту в 6500 долларов США, поэтому в широкой клинической практике они практически не используются.
Все вышеперечисленные препараты получены методами многостадийного химического синтеза, имеющего ряд принципиальных недостатков - большие затраты сырья и реагентов, необходимость утилизации экологически небезопасных токсических отходов химического производства. Это не соответствует тенденциям современной биоиндустрии, особенно с учетом требований по охране окружающей среды.
Учитывая все вышеизложенное, очевидна крайняя необходимость создания современных отечественных технологий получения лекарственных препаратов на основе модифицированных нуклеозидов для широкого применения в практической медицине.
В руководстве работой принимала участие научный сотрудник ИБХ РАН, к.х.н. Константинова И. Д. ** Список сокращений: Ас-АТА - 3-ацетамидо-1,2,4-триазол; Ado - аденозин; Ага-А - 9-P-D-apa6mro-фуранозиладенин (видарабин), Ara-U - l-P-D-арабинофуранозилурацил; ATA — 3-амино-1,2,4-триазол; CdA - 2-хлор-2'-дезоксиаденозин (кладрибин); 1-Р-Ага - l-a-D-арабинозилфосфат; 2-ClAde - 2-хлораденин; 2-ClAdo - 2-хлораденозин; 2-С1-Ага-А - 9-р-0-арабинофуранозил-2-хлораденин; 2-FAde - 2-фтораденин; 2-FAdo - 2-фтораденозин; Flud - 9-Р-0-арабинофуранозил-2-фтораденин (флударабин); Ino -инозин; Ме-ТКА - 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; Thd - тимидин; ТКА - 1,2,4-триазол-З-карбоксамид; Vir - 1-р-П-рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамид (рибавирин); НФ -нуклеозидфосфорилазы; ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза; ТФ - тимидинфосфорилаза; УФ -уридинфосфорилаза; ФСП - фармацевтическая статья предприятия; ТКА - 1,2,4-триазол-З-карбоксамид; Ме-ТКА. - 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; Guo - гуанозин; Suc-ATA - З-сукцинимидо-1,2,4-триазол; ДМСО - диметилсульфоксид; флудара - 5'-фосфат флударабина
Экспериментальные работы по теме диссертации осуществлялись при поддержке Федеральных целевых научно-технических программ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники» на 2002-2006 гг. (грант № 43.073.11.2516), «Национальная технологическая база» на 2007-2011 гг. (госконтракт № ГП/07/439УНТБ/К) и Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ 04-04-08115, 05-04-08013,07-04-13573).
Цель работы. Разработка химико-ферментативного способа синтеза как уже известных модифицированных нуклеозидов, так и принципиально новых соединений с использованием генно-инженерных ферментов нуклеозидфосфорилаз.
Научная новизна. Созданы биотехнологии получения субстанций лекарственных препаратов 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (кладрибина) и 5'-фосфата 9-рЧЭ-арабинофуранозил-2-фтораденина (флудары) с использованием генно-инженерных ферментов. Впервые синтезированы аналоги 1-р-В-рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамида (рибавирина) и 9-P-D-арабинофуранозиладеішна (видарабина), модифицированные по гетероциклическим основаниям. Исследована субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду гетероциклических оснований с целью получения новых аналогов нуклеозидов и поиска новых ингибиторов ферментов нуклеинового обмена Впервые показана принципиальная возможность синтеза с помощью нуклеозидфосфорилаз нуклеозидов, замещенных по 6 положению пуринового основания.
Практическая значимость. В настоящей работе предлагается эффективный биотехнологический способ синтеза модифицированных нуклеозидов с использованием ферментов генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз, что позволяет заменить стадию гликозилирования в химических технологиях синтеза нуклеозидов на ферментативную. Использование данного подхода значительно упрощает общую технологическую схему производства, повышает эффективность процесса. Разработаїпше биотехнологии синтеза нуклеозидов хорошо воспроизводятся, легко масштабируются и могут быть внедрены на предприятиях медико-биологического профиля.
Показана принципиальная возможность получения по разработанным технологиям новых модифицированных нуклеозидов, замещенных по гетероциклическим основаниям различного типа (пуринового, 1,2,4-триазола).
Синтезированы и переданы на биологическое тестирование аналоги известных противовирусных препаратов (рибавирина и видарабина).
Полученные предварительные данные по противовирусной активности синтезированных соединений позволили сделать заключение о взаимосвязи «структура-
5 биологическая активность», что необходимо для создания новых эффективных противовирусных и противоопухолевых соединений.
Основные положения, выносимые на защиту.
Разработка и оптимизация ферментативных способов получения субстанции кладрибина и флудары с помощью генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз.
Синтез аналогов рибавирина и видарабина, модифицированных по гетероциклическим основаниям, для исследования их противовирусной активности.
Исследование субстратной специфичности ігуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду замещенных по 2-, б- и 8- положениям пуриновых оснований с целью получения новых модифицированных нуклеозидов и поиска новых ингибиторов ферментов нуклеинового обмена.
Проведение биологического тестирования синтезированных соединений на противовирусную активность.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008)
Публикации. По материалам работы опубликовано 2 статьи, тезисы доклада на конференции и подана заявка на получение патента РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 70/ стр. машинописного текста, содержит 7_ рисунков, __ таблиц, ? схем, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего '/-^ссылок.
