Введение к работе
Актуальность работы. Фермент лактаза (Р-галактозидаза), расщепляющий лактозу молока имеет особое значение в раннем детстве, так как дисахарид лактоза, содержащийся в молоке является основным источником галактозы, которая участвует в синтезе галактоцереброзидов, необходимых для нормального развития ЦНС и сетчатки глаза. Уменьшение количества лактозы и производных её гидролиза может послужить развитию синдрома мальабсорбции (СМА), который выражается, в частности, в недостаточности лактазы и в сопряжённом с этим состоянием лактозонепереносимости [Ладодо К.С., 2000]. Наиболее эффективным способом профилактики и лечения СМА, является промышленное создание безлактозных продуктов, либо приём ферментных препаратов (мезофильная Р-галактозидаза), расщепляющих лактозу.
Получение безлактозных молочных продуктов до сих пор остаётся достаточно трудоёмким процессом, базирующимся на длительном осаждении белка обезжиренного молока, растворении осажденного белка в щелочи или растворах щелочных солей и последующей распылительной сушке, после которой экстракцией специально подобранными растворителями удаляют собственно лактозу.
Получение ферментных препаратов для гидролиза Р-галактозидов также сводится к трудоёмкой химической очистке фермента, приводящей к его инактивации. Кроме того для использования в пищевой промышленности и медицине фермент должен нормироваться посодержанию ряда веществ, используемых для иммобилизации и элюции. Также, использование мезофильных ферментов, ограничено в тех случаях, когда производственный процесс необходимо проводить при повышенной температуре (выше 60С).
Принципиально новым подходом к получению препаратов Р-галактозидаз с улучшенными характеристиками является биотехнологический приём, называемый fusion - технологией или технологией слитных (химерных) конструкций, когда в одной рамке трансляции объединяются генные последовательности разных белков [Miller, R. С, Kiltmrn, D. G. et al., 1989; Gurvits,
I. D., Velikodvorskaya G. A. et al., 2007]. Использование подобной технологии позволило создать фермент, обладающий улучшенными свойствами: повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимыми субстратами, такими как декстран [Cavataio F. et al., 2005].
Положения, выносимые на защиту. 1. Рекомбинантная белковая конструкция ДСД-сп-Р-ГАЛ содержащая декстрансвязывающий домен и каталитическую последовательность фермента термо стабильной Р-галактозидазы и её штамм-продуцент. 2. Разработка методов очистки рекомбинантных белков, основанная на сочетании использования термостабильности целевого продукта и его декстрансвязывающих свойств. 3. Созданный плазмидный вектор с регуляторными областями и геном химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ. 4. Декстран-белковый комплекс на основе белка ДСД-сп-Р-ГАЛ и декстранового сорбента для гидролиза бета-галактазидов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание гибридной (химерной) рекомбинантной белковой конструкции ДСД-сп-Р-ГАЛ, имеющей декстрансвязывающий домен и активность термостабильной бета-галактозидазы, её штамма-продуцента и исследование физико-химических свойств данного белка.
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:
Получение мутантного гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.
Создание генной последовательности химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ. с геном ДСД и геном термостабильной Р - галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus, объединёнными через спейсер.
Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего эффективную экспрессию химерного рекомбинантного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ.
Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-СП-Р" ГАЛ.
Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-Р-ГАЛ.
Оптимизация условий получения комплекса декстрана и белка ДС Д-сп-Р-ГАЛ. для гидролиза бета-галактозидов.
Научная новизна. На базе концепции слитных генно-инженерных конструкций впервые был спланирован и сконструирован рекомбинантный плазмидный вектор pGD-ІО, позволяющий осуществлять индуцированный биосинтез гибридного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, обладающего одновременно декстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной Р-галактозидазы.
Впервые были получены бактериальные продуценты конструкции ДСД-сп-Р-ГАЛ E.coli[pGD-10], обеспечивающие экспрессию целевого белка на уровне 10% от тотального белка клеток.
Впервые была предложена высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ на декстрановом сорбенте, основанная на уникальных свойствах декстрансвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 90%.
Практическое значение работы. Разработанная схема получения штамма-продуцента химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов для профилактики синдрома мальабсорбции. Также комплекс данной белковой конструкции с декстраном может быть использован в пищевой промышленности при реализации схем получения безлактозных продуктов.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 14 октября 2009г. на заседании кафедры ЭиПБ МГУИЭ. Основные результаты исследований были представлены на XII Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7-14 сентября 2009, С 17., на VI Молодёжной науч. конф. «Биотехнология в
