Введение к работе
Актуальность темы: В последнее время возросло внимание к
макролидным антибиотикам, связанное со значительными успехами в области
химической и биологической трансформации их молекул и проявлением новых
терапевтических свойств у модифицированных антибиотиков (Walsh С, 2003;
P. Katz L., Ashley G. W., 2005; McDaniel R., et. al. R., 2005). Получены, в
частности, новые производные эритромицина А, показавшие не только
измененный спектр антимикробного действия, но и антипаразитарный,
антиопухолевый, иммуносупрессантный, нейротрофический и
антивоспалительный эффект (Сазыкин Ю.В., и др. 2000). Поэтому является актуальным получение новых штаммов макролидных антибиотиков с повышенной продуктивностью и совершенствование технологии производства на стадии ферментации.
Одной из основных проблем, которую необходимо решить при работе со штаммами Saccharopolyspora erythraea и Streptomyces fradiae, является получение монопродуцента, так как данные культуры образуют антибиотические комплексы. Получение чистого целевого продукта (эритромицина А, тилозина) является необходимым для дальнейшего получения синтетических производных данных макролидных антибиотиков и в значительной степени облегчит стадии выделения и очистки. Для решения этих проблем проводились исследования в двух направлениях: отбор мутантов с улучшенным компонентным составом и уровнем продуктивности и изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотического комплекса, включая ионы кальция и состав питательных сред. В данной работе изучалось влияние различных генетических и физиологических факторов на биосинтез антибиотиков штаммами Sa erythraea и S. fradiae: мутации устойчивости к антибиотикам; возможная активация лимитирующих путей биосинтеза антибиотиков и присоединение Сахаров к лактонной части молекулы; влияние
ионов кальция (Norris V. et.al., 1996; Д|нвоснцлцИоДй,дь?Ш?) изучение
БИБЛИОТЕКА |
СП.
о»
уте!
возможной связи продукции тилозина и эритромицина с протеинкиназами; влияние ингибиторов протеинкиназ.
Цели и задачи исследования: Основная цель диссертационной работы состояла в изучении факторов, влияющих на компонентный состав образуемого антибиотического комплекса у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: изучено влияние различных факторов на биосинтез и антибиотическую продуктивность штамма 5. fradiae 25А; получены и охарактеризованы мутанты штамма 5. fradiae 25А в отношении уровня и спектра продукции тилозинового комплекса; проведено сравнительное изучение исходного штамма 5 fradiae 25А и полученного 5. fradiae 36 (kanr-Ca2+); отобраны и охарактеризованы мутанты штамма Sa. erythraea в отношении антибиотической продуктивности, компонентного состава эритромицинового комплекса и спектра устойчивости к различным антибиотикам; проведена идентификация Са2+-зависимых протеинкиназ у S. fradiae25A и изучена корелляция с биосинтезом тилозинового комплекса. Научная новизна работы: Впервые показано влияние ионов кальция (Са2+) и выявлена возможная роль Са2+- зависимых серин/треониновых протеинкиназ на компонентный состав тилозинового комплекса у штамма 5 fradiae. Разработаны новые методы селекции, основанные на получении мутантов в сигнал-трансдуцирующих системах, регулирующих биосинтез макролидов, и на их основе получены штаммы 5 fradiae и Sa. erythraea с улучшенным содержанием целевых продуктов (тилозина и эритромицина А). Практическая значимость и реализация результатов работы: В ходе исследований получены и охарактеризованы мутанты с улучшенным компонентным составом у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина за счет увеличения целевого продукта. Получен капг-Са2+-зависимый штамм 5 fradiae 36, способный синтезировать 7,7 г/л тилозина (что составляет 96% его в
синтезируемом антибиотическом комплексе) и превышает в 1,5 раза уровень целевого продукта в исходном штамме. Получен монопродуцент целевого продукта тилозина штамма S fradiae.
Получен monr-Ca """-зависимый штамм Sa erythraea 60, способный синтезировать 7,0 г/л эритромицина А (что составляет 80% его в синтезируемом антибиотическом комплексе) Продуктивность в отношении эритромицина А полученного мутанта в 1,3 раза выше по сравнению с таковой у исходного штамма Sa erythraea 254-К Осуществлена оптимизация ферментационной среды и разработаны основы метода регулируемого по углеводам биосинтеза, позволяющего получать преимущественно целевой продукт - эритромицин А.
Созданные штаммы и технологии биосинтеза антибиотиков эритромицина и тилозина могут бьпь использованы при организации конкурентноспособного производства этих антибиотиков на заводах России. Разработанные новые методы селекции могут быть использованы при создании высокопродуктивных штаммов других макролидных антибиотиков. Апробация работы: Основные положения работы докладывались на Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г.Саранск, 2001г.) и на 1-ом и 3-ем Международном конгрессе «Биотехнология- состояние и перспективы развития» (г.Москва,2002г., 2005г.). Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 работ: 1 статья в сборнике докладов Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», 2 - в сборнике статей 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» и 2 статьи в научных журналах.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, из них иностранных 149
