Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Получение мутантного штамма 75
1.1. Естественная изменчивость продуцента 75
1.2. Получение мутантного штамма Streptomyces griseinus 11-84 77
1.3. Сравнительная характеристика исходного и мутантного штаммов 81
Глава 2. Разработка оптимального состава питательной среды 87
2.1. Влияние специфических субстратов на биосинтез литических ферментов мутантным штаммом 87
2.2. Влияние биомассы микроорганизмов в питательной среде на биосин- 93
тез литических ферментов
2.3. Оптимизация состава питательной среды с использованием методов математического планирования эксперимента 98
Глава 3. Разработка рациональных режимов глубинного культивирования 104
Str. griseinus 11-84
3.1. Влияние посевного материала на биосинтез литических ферментов... 104
3.1.1. Отработка условий поддержания штамма в активном состоянии 104
3.1.2. Исследование влияния количества и возраста мицелиальной посевной культуры на биосинтез литических ферментов 106
3.1.3. Хранение культуры на сыпучих зерновых субстратах 108
3.2. Влияние начального рН среды на биосинтез литических ферментов... 109
3.3. Влияние температуры культивирования 111
3.4. Зависимость образования литических ферментов от аэрирования питательной среды 113
3.5. Динамика биосинтеза ферментов литического комплекса 118
Глава 4. Разработка условий выделения препарата литических ферментов 124
4.1. Изучение стабильности литических ферментов в фугате культуральной жидкости 124
4.2. Изучение процесса очистки и концентрирования литических ферментов методом ультрафильтрации 126
4.2.1. Выбор ультрафильтрационных мембран 127
4.2.2. Влияние предварительной очистки культуральной жидкости на 129
скорость ультрафильтрации
4.2.3. Влияние рН фугата на процесс ультрафильтрации 130
4.2.4. Исследование оптимальной степени концентрирования фугата культуральной жидкости 132
4.3. Разработка условий осаждения комплекса литических ферментов из концентрата и получение препарата 135
4.3.1. Влияние рН концентрата на осаждение литических ферментов 135
4.3.2. Влияние концентрации этанола на литическую активность препарата 136
4.4. Испытание технологии получения препарата... 138
4.5. Описание технологической схемы получения препарата Лизофунгин.. 139
Глава 5. Изучение некоторых свойств препарата 145
5.1. Оптимальные условия действия препарата 145
5.2. Влияния солей некоторых металлов на литическую активность препарата.. 152
5.3. Характеристика ферментного комплекса препарата Лизофунгин 154
5.4. Изучение спектра действия Лизофунгина на микроорганизмы 157
Глава 6. Области применения препарата 161
Выводы 172
Список литературы 174
Приложения 199
- Естественная изменчивость продуцента
- Влияние специфических субстратов на биосинтез литических ферментов мутантным штаммом
- Отработка условий поддержания штамма в активном состоянии
Введение к работе
Проблема лизиса клеточных стенок микроорганизмов различных таксономических групп с целью повышения их питательной ценности и получения в недеградированном виде биологически активных веществ, содержащихся в протоплазме микробных клеток, является актуальной и имеющей народохозяйственное значение.
Для разрушения микробной биомассы известны различные физические и биохимические способы. Ферментативный способ разрушения клеточных стенок, в отличие от физико-химических способов, позволяет осуществлять контролируемое воздействие на клетки и извлекать из них целевые продукты.
Среди ферментов, продуцируемых микроорганизмами, особое место занимают литические ферменты, катализирующие биохимические реакции последовательной деградации структурных элементов микробной клеточной стенки.
Применение препаратов литических ферментов позволяет интенсифицировать выделение из микробной биомассы многих ценных физиологически активных веществ: ферментов, витаминов, аминокислот и др. Известно, что клеточная стенка кормовых дрожжей препятствует усвоению цитоплазматических веществ клетки при скармливании ее животным. Биомасса кормовых дрожжей после ферментативного лизиса клеточных стенок обладает повышенной питательной ценностью,, что дает возможность более эффективно использовать её в кормопроизводстве, в том числе в составе заменителей цельного молока для молодняка сельскохозяйственных животных.
Также литические ферменты могут быть использованы в технологиях охраны окружающей среды, на этапах утилизации микробной биомассы, являющейся отходом микробиологических производств.
Кроме того, на основе литических ферментов в последнее время разрабатываются антимикробные лекарственные средства, в том числе для лечения дерматомикозов, которые имеют ряд преимуществ перед химически синтезируемыми фунгицидами. Получены положительные результаты при использовании их для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных. Применение литических ферментов перспективно при борьбе со стафилококковой инфекцией, при лечении кариеса зубов.
Особый интерес для создания промышленного производства ферментов представляют термотолерантные микроорганизмы, в том числе актиномицеты-продуценты литических ферментов, которые обладают высокой скоростью роста и устойчивостью к изменениям температуры культивирования. Также важно, что термотолерантные культуры часто оказываются более конкурентоспособными по сравнению с мезофильными продуцентами в отношении инфицирующей микрофлоры.
Несмотря на большой интерес, проявляемый к проблеме ферментативного лизиса микроорганизмов, промышленное производство препаратов литических ферментов в России отсутствует. Поэтому изучение условий биосинтеза литических ферментов термотолерантным актиномицетом Str. griseinus 11-84 и разработка технологии получения ферментного препарата литического действия для использования в различных отраслях народного хозяйства и медицине, является актуальной и перспективной.
Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в разработке технологии получения препарата литических ферментов широкого спектра действия на основе полученного мутантного штамма термотолерантного актиномицета Streptomyces griseinus 11-84, а также в изучении физико-химических и каталитических свойств препарата.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- изучение естественной и индуцированной изменчивости актиномицета,
- изучение физиологических особенностей мутантного штамма Str. griseinus 11-84, полученного методами индуцированной селекции,
- оптимизация условий культивирования продуцента для направленного биосинтеза литических ферментов,
- разработка методов выделения литических ферментов и разработка научно-технической документации на получение препарата,
- изучение физико-химических свойств, специфичности действия препарата и условий гидролиза клеточных стенок микроорганизмов.
Научная новизна.
1. С использованием методов индуцированной селекции получен высокопродуктивный штамм литических ферментов Str. griseinus 11-84, ферментативная активность которого превышает активность исходной культуры в 2,5 раза. На штамм получено авторское свидетельство №1362012 (1987 г.)
2. Показана индукция факторами питательной среды биосинтеза внеклеточных литических ферментов и установлено, что продукты ферментолиза полисахаридов клеточных стенок дрожжей и микроскопических грибов значительно интенсифицируют биосинтез ферментов.
3. Разработана технология получения очищенного препарата литических ферментов Лизофунгин из культуральной жидкости мутантного штамма Str. griseinus 11-84.
4. Установлены диапазоны рН и температуры, а также активаторы и ингибиторы, влияющие на активность и стабильность литических ферментов в полученном препарате.
5. Установлено, что основными компонентами ферментативного комплекса, обеспечивающего лизис клеточных стенок дрожжей, являются активности Р-глюканазы и протеазы.
6. Определен спектр литического действия препарата на микроорганизмы, показано, что препарат активно разрушает клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов, в том числе патогенных микроорганизмов.
Практическая значимость работы. Разработана технология получения очищенного препарата литических ферментов. Разработана и утверждена нормативно-техническая документация, в том числе опытный технологический регламент на получение препарата Лизофунгин. Технология апробирована в стендовых и опытно-промышленных условиях, получены экспериментальные партии препарата. Доказана его высокая эффективность при разрушении клеточных стенок дрожжей и микроскопических грибов. Показана перспективность применения препарата для лизиса дрожжей и микроскопических грибов, в том числе дерматофитов. Показана эффективность использования ферментолизатов дрожжей для замены молочного белка в составе заменителя цельного молока для молодняка сельскохозяйственных животных.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на международных и Российских научно-технических конференциях, симпозиумах и конгрессах, в том числе на Международной конференции «Биокатализ - 2000» (Москва, 2000 г); II Международной научно-практической конференции (Ялта, 2001 г); I съезде микологов России (Москва, 2002 г); I, II, VI Международных конгрессах «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005 г.г.); на заседаниях Ученого совета НТЦ Лекбиотех.
Публикации. По результатам исследований опубликовано 12 печатных работ, а также получено 2 авторских свидетельства СССР, в которых отражены основные положения диссертации.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений. Материал изложен на 212 страницах, содержит 27 рисунков и 29 таблиц, список литературы включает 280 наименований.
Естественная изменчивость продуцента
На первом этапе селекции была изучена естественная изменчивость культуры Str. griseinus 11. Культура на 5-е сутки роста на чашках Петри с ага-ризованной средой образует колонии трех морфологических типов с преобладанием одного варианта («серого»). Морфологические варианты, отличающиеся между собой по способности образовывать воздушный мицелий и спорообразованием, характеризуются следующим образом.
«Серый» вариант образует плоские, с выпуклым центром, радиально-складчатые колонии темно-серого цвета. Субстратный мицелий бежевый, воздушный - белый, на 4-5 сутки появляются темно-серые споры. На 3 сутки роста выделяет в среду фиолетовый пигмент.
«Белый» вариант имеет те же морфологические отличия, что и у «серого» варианта, за исключением пониженной способности образовывать споры. Пигмента в среду не выделяет.
«Бежевый» вариант - колонии плоские, складчатость слабо выражена. Растет в виде блестящих плотных пленок бежево-желтого цвета. Отличается от других вариантов отсутствием спорообразующего воздушного мицелия. Пигмента в среду не выделяет. Выявленные варианты различались между собой не только по морфологическим признакам, но и по способности к биосинтезу литических ферментов. В таблице 1 представлены данные рассева, показывающие, что основную часть популяции (64%) составляют «серые» варианты, обладающие наиболее высокой способностью к биосинтезу литических ферментов и низким коэффициентом изменчивости. «Белые» варианты обладают сравнительно высокой биосинтетической способностью, но большим, чем у «серых» вариантов, коэффициентом изменчивости - 51,6%. Доля «бежевых» вариантов в популяции незначительна. Они проявляют самую низкую способность к биосинтезу литических ферментов (53%) от контроля) и высокую изменчивость (42,6%).
Влияние специфических субстратов на биосинтез литических ферментов мутантным штаммом
Подавляющее большинство гидролитических ферментов микроорганизмов образуются при наличии в среде специфического субстрата или метаболита. Многие известные продуценты литических ферментов, в том числе исходная культура Str. griseinus 11, осуществляют индуцированный синтез лизоферментов. В качестве индуктора используются микробные клетки или клеточные стенки (Коновалов, Воротило, 1977; Шкляр, 1977; Захарова, Павлова, 1985).
С целью изучения влияния углеродсодержащих соединений на биосинтез литических ферментов мутантным штаммом Str.griseinus 11-84 культуру выращивали в течение 24 часов на питательных средах, содержащих различные мо-но-, ди- сахара, амилодекстрины (растворимый крахмал). Среды готовились в двух вариантах: с добавлением и без добавления дрожжей С. maltosa.
Было установлено, что выращивание культуры на средах без дрожжей, содержащих лактозу, мальтозу, амилодекстрины обеспечивало хороший рост культуры при невысокой активности литических ферментов (рис 4 а, среды без дрожжей). Внесение дрожжей в среду почти не сказывалось на количестве биомассы, но значительно, в 13-19 раз усиливало биосинтез литических ферментов
Отработка условий поддержания штамма в активном состоянии
Для поддержания штамма-продуцента в активном состоянии большое значение имеют способы хранения, эффективность которых оценивается по та-" ким параметрам, как выживаемость культуры в процессе хранения и сохранение физиологических свойств.
Для обильного спороношения многих актиномицетов необходимы обогащенные органические агаризованные среды. Штамм-продуцент литических ферментов Str.griseinus 11-84 хорошо растет на агаре Эмерсона с растворимым крахмалом и дрожжевым экстрактом (ЭмА), картофельно-глюкозном агаре (КгА), а также на агаризованной среде того же состава, что применяется для глубинного выращивания продуцента (ФА). Эти среды были использованы для изучения длительности хранения культуры в пробирках на скошенном агаре. После хранения культуру пересевали на свежую агаризованную среду и оценивали сохранение биосинтетической способности по активности литических ферментов при выращивании культуры на жидкой ферментационной среде в колбах на качалке.
Хранение культуры на агаризованных средах в течение 1,2, 6 и 12 месяцев показало, что на среде ЭмА биосинтетическая активность культуры была высокой в течение всего срока хранения, на среде ФА после 6 месяцев хранения активность снижалась на 20%. Хранение культуры на картофельно-глюкозном агаре (КгА) приводило к снижению активности культуры после 3 месяцев хранения на 20% и после 6 месяцев хранения на 35%
