Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1. Авермектинсодержащие препараты в борьбе с паразитозами животных 9
1.1 Препараты на основе ивермектина: 9
Ивомек, Баймек, Ивертин и др.
1.2 Препараты на основе натуральных авермектинов: Аверсект-1, Ниацид, Ниацид-гранулы, Аверсект, Авертин и др. 19
1.3 Дектомакс 23
1.4 Препараты, содержащие в качестве действующего вещества 24
моксидиктин и милбемицин
2. Различные лекарственные формы авермектинсодержащих препаратов28
II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
1 . Материалы и методы 33
2 Эпизотология наиболее распространенных паразитозов в Рязанской области34
3. Технология получения нового противопаразитарного препарата ниацид-премикс на основе авермектинов. 41
3.1 Культивирование продуцента, выделение из биомассы и химическая очистка авермектинов 41
3 2 Подбор ингридиентов и оптимизация рецептуры препарата 44
3.3 Оптимизация последовательности операций при изготовлении 53
препарата.
4. Изучение основных характеристик препарата ниацид-премикс. 54
4.1 Сохранность и стабильность препарата. 54
4.2 Токсикологические параметры препарата. 56
4.2.1. Острая токсичность. 5 6
4.2.2. Хроническая токсичность. 57
4.3 Действие препарата ниацид-премикс на иммуннобиологические показатели организма животных 58
4.3.1. Показатели клеточного и гуморального иммунитета 58
4.3.2. Действие препарата на показатели естественной резистентности 59
4.3.3. Гематологические и биохимические показатели крови животных. 61
4.4 Переносимость препарата ниацид-премикс 63
5. Изучение противопаразитарной эффективности ниацид премикс. - 65
5.1 Эффективность препарата при лечении паразитозов свиней. 65
5.2 Эффективность ниацид-премикс против эктопаразитов крупного рогатого скота. 68
6. Экономическая эффективность препарата 69
III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 72
IV. ВЫВОДЫ 79 У.ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ 80
VI. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ 80
ВЫВОДОВ
VI. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 81
VII. ПРИЛОЖЕНИЯ 109
- Авермектинсодержащие препараты в борьбе с паразитозами животных
- . Материалы и методы
- Культивирование продуцента, выделение из биомассы и химическая очистка авермектинов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди широкого круга лекарственных средств, применяемых против паразитозов в ветеринарии в последнее время, ведущее место занимают препараты авермектинового ряда. Это связано с тем, что препараты на основе авермектинов обладают широким спектром действия и более экологически чистые, чем известные химические аналоги. Ранее во многих странах мира наиболее широко применялся препарат Ивомек, созданный учеными фирмы MSD (W.C. Campbell, V.W. Benz, 1984; W.C. Campbell, M. Easterbrook, 1985; J.C.J.W. Knox, K.S. Marbury and others, 1989) и содержащий в качестве действующего вещества (ДВ) комплекс химически модифицированных, т.е. гидрированных авермектинов В]а и Btb - ивермектин.
Ивермектин используется в качестве действующего начала большинства и других зарубежных противопаразитарных препаратов (Ивомек плюс, Баймек, Пандекс, Ивомек пурон и др.).
Работы по созданию отечественной технологии биосинтеза авермектинов были начаты в конце 80-х годов учеными МГП «Бифидум» и успешно завершились созданием препаратов Аверсект-1, Ниацид, Аверсект-2 ( Мосин В.А., Дриняев В.А., Мирзаев М.Н.,1992; 1994; Мирзаев М.Н., Девришов Д.А., Савченков, 1995). Научно-техническая информация, полученная при этом, послужила основой создания других отечественных авермектинсодержащих препаратов для защиты растений и животных от широкого круга паразитов (клещи, вши, тли, колорадский жук, гельминты). В ранних публикациях по авермектиновой проблеме отмечалось, что препараты на основе модифицированных авермектинов менее токсичны и более эффективны, но это оказалось не совсем соответствующим действительности. На самом деле, как показывают публикации последнего времени, препараты Аверсект-2, Ниацид, Авертин, содержащие в своем составе натуральные авермектины, относятся к IV ^ классу токсичности и в терапевтических дозах безвредны для животных.
Это свидетельствует о том, что, выбранное отечественными учеными направление по созданию противопаразитарных препаратов на основе немодифицированных авермектинов, оказалось весьма полезным и перспективным. Сказанное подтверждается и тем, что в настоящее время в РФ зарегистрирован ряд отечественных авермектинсодержащих препаратов (Аверсект-2, Авертин, Ниацид), хорошо зарекомендовавших себя в ветеринарии при лечении и профилактике широкого спектра паразитозов животных. ч В то же время нельзя не отметить наличие определенных недостатков у известных препаратов отечественных и зарубежных производителей -Ч они неудобны для применения крупным животным, когда вводят более 5-6 мл препарата и приходится делать инъекции в разных местах. Кроме того, известно, что длительное применение одних и тех же препаратов ведет к адаптации паразитов к ним, т.е. отбору резистентных форм паразитов. Поэтому не вызывает сомнений актуальность исследований, направленных на создание новых форм и композиций авермектинсодержащих препаратов широкого спектра действия.
Цель и задачи работыЦелью работы является разработка технологии получения новой композиции противопаразитарного препарата в форме , премикса и изучение основных параметров безопасности и эффективности
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: -оптимизировать компонентный составав препарата, содержащий авермектины и другие ингредиенты; -изучить острую и хроническую токсичность препарата; -изучить действие препарата на основные иммунобиологические показатели организма животных; -установить эффективность препарата против паразитов животных; і, - испытать препарат в производственных условиях; -разработать проект нормативно-технической документации на препарат;
Научная новизна. Впервые разработана технология получения новой композиции противопаразитарного препарата в форме премикса не имеющего аналогов нигде в мире. На основе авермектинов, продуцируемых Streptomycis avermitilis, пшеничных отрубей и биологически активных минералов типа цеолитов. Цеолиты — обладают сорбционными, каталитическими, молекулярно-ситовыми, » ионообменными свойствами. Они способны адсорбировать на себя и выносить из кишечника токсические вещества, нормализуют баланс ч минеральных компонентов в организме.
Практическая ценность работы. Для профилактики и лечения паразитозов крупного рогатого скота предложена новая форма препарата, содержащего в качестве действующего вещества натуральные авермектины.. Результаты работы вошли в разрабатываемую в настоящее время нормативно-техническую документацию (НТД) — Технические условия на производство препарата и Наставления по его применению в ветеринарной практике.
Положения, выносимые на защиту:, Технология получения новой формы противопаразитарного препарата на основе немодифицированных авермектинов, циалитов и отрубей пшеничных.
Данные по изучению токсикологической и \\иммунобиологической\\ характеристики препарата.
Результаты апробации препарата в лабораторных и производственных условиях.
Апробация. Результаты диссертационной работы представлены на международной практической конференции посвященной 80-летнему юбилею ветеринарной службы Монголии, г.Улан-Батор, 2003г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы, который включает 203 источников, в том числе 73 иностранных, и приложение. Иллюстрационный материал диссертации включает 10 рисунков и 19 таблиц.
Авермектинсодержащие препараты в борьбе с паразитозами животных
Ивермектин — комплекс химически модифицированных (гидрированных) авермектинов В і а, В]Ь (см. рис. 1), является действующим началом большинства зарубежных противопаразитарных препаратов (Баймек, Ивомек, Ивомек плюс, Пандекс, Ивомек пурон и др.)
Ивомек инъекционный. Как отмечалось выше, Ивомек является первым препаратом, созданным на основе метаболитов Streptomyces avermitilis.
Многочисленные исследования показали безвредность и исключительно высокую эффективность Ивомека при экто- и эндопаразитозах животных при подкожном введении в дозе 1 мл/5 Окг массы, а для свиней — 1 мл/33кг.
Так, изучая острую токсичность ивермектина на белых беспородных мышах, И. М. Гаджиев [37] установил, что ивермектин относится к малотоксичным соединениям, а его LD5o=80 мг/кг почти в 400 раз превышает терапевтическую дозу. При этом препарат не проявил мутагенного и эмбриотоксического действия.
При изучении токсичности Ивомека и его влияния на некоторые показатели крови установлено, что в терапевтической и в 25 раз ее превышающей дозах препарат не вызывает токсикоза [101, 126]
При двукратной подкожной инъекции с интервалом 14 суток в дозе 0,2 мг/кг по действующему веществу у овец не происходит изменения форменных элементов крови, белкового и азотистого обменов в организме.
Результаты исследований фирмы МСД (Ivomec, 1987) показывают исключительно низкую токсичность ивермектина (Ивомека). Однократное введение крупному рогатому скоту Ивомека в дозе, в 30 раз превышающей терапевтическую, не вызывало никакого токсикоза. Только 40-кратное увеличение дозы приводило к отравлению с признаками слабости, апатии и нарушения координации движения. При 100-кратном увеличении дозы Ивомека, инъецированного свиньям, наблюдалась атаксия, тремор, затрудненное дыхание и мышечная дрожь. ЛД50 ивермектина (мг/кг) составила: при пероральном введении - для мышей 25, крыс 50, крысят 2-3, собак 80; при внутри брюшинном введении — для мышей 30, крыс 55. При пероральном введении взрослым мышам препарат оказался более токсичным для самцов, чем для самок. У собак признаки токсикоза проявлялись мышечной дрожью, тремором, атаксией и обильным слюнотечением.
При накожном введении ЛД50 составила для кроликов 406, для крыс более 660 мг/кг. Таким образом, Ивомек относится к малотоксичным веществам.
В то же время при применении ивермектина внутрь для лечения собак в дозе 800 мкг/кг проявлялся острый токсический синдром в виде депрессии, дрожания конечностей, атаксии, ступоре, слюнотечении, коме [188]. Самой большой оральной дозой, не вызывавшей последствий, была 0,2 мкг/кг; для продолжающейся в течение 14 недель дачи препарата в дозе 0,5 мкг/кг. Доза 5 мг/кг вызывала судороги, в то время как более серьезные признаки, включая атаксию, проявлялись при оральной дозе 10,0 мг/кг. Подкожная инъекция ивермектина в дозе 4,7 мг/кг вызвала слюнотечение, а депрессия, атаксия и смерть происходили при дозе 9,4 мг/кг [193].
Оказалось, что некоторые собаки породы колли особенно восприимчивы к токсическим дозам ивермектина [154]. В контрольном исследовании 8 колли, которые были подвержены глазной аномалии, и 8 колли, у которых не наблюдалось глазной аномалии, были изучены с целью определения является ли ивермектин более токсичным для собак породы колли. Группам давали ивермектин перорально в дозе 50, 200 и 600 мкг/кг. У двух собак, получавших ивермектин в дозах 200 и 600 мкг/кг, проявились признаки интоксикации, включая атаксию депрессию, судороги, потерю движений; одна собака умерла, другая была умерщвлена. Две другие собаки в этих группах проявили кратковременные признаки депрессии, атаксии и т.д. Анализ тканей двух умерших собак показал высокую концентрацию ивермектина в ЦНС [188].
Необоснованное использование Ивомека, рекомендованного для крупных животных, служит причиной смерти и интоксикации у собак. [193].
Высокую антипаразитарную эффективность Ивомека в форме 1%-ного раствора показали многие исследователи против смешанных нематодозов крупного рогатого скота (остертагии, кооперии, трихостронггош, нематоды, диктиокаулы и др.) и получили высокую эффективность в дозе 0,2 мг/кг по ДВ при однократном подкожном введении [135,137, 139,143, 81, 58, 10, 74, 90, 76, 54].
Материалы и методы
Работа выполнена в Научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина в период 1999-2004 г.г. Опыты по изучению эффективности препарата при лечении паразитозов животных проводили в хозяйствах Рязанской области и Республики Калмыкия. При изучении вопросов, связанных с оптимизацией условий биосинтеза, продуцент авермектинов Streptomyces avermitilis-56 культивировали в глубинных условиях, в качалочных колбах при вращении 220-240 об/мин., а также в колбах объемом 2500 мл поверхностно на увлажненном пшене при температуре 28С. Количество авермектинов определяли спектрофотометрически на СФ 46 при 243-246нм и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в режимах: 246 нм, микроколонка, носитель ацетонитрил-метанол. В динамике развития продуцента авермектинов контролировали рН культуральной жидкости, накопление биомассы и целевого продукта. Количество биомассы определяли весовым методом путем высушивания ее в сушильном шкафу при температуре 105С, чистоту культуры в процессе культивирования контролировали путем микроскоп ирования образцов культуральной жидкости (КЖ) и высевом в МПБ и на МПА.
Авермектиновый комплекс из биомассы извлекали путем 3х кратной экстракции этиловым или изопропиловым спиртом, сопутствующие липиды осаждали вымораживанием при -20С в течение 12-16 часов. В экстракте определяли содержание авермектинов и на вакуумвыпарной установке концентрировали до необходимого значения ( 1-2%).
Полученное таким образом действующее вещество (комплекс натуральных авермектинов), а также биомассу продуцента с известным количеством действующего веществ (ДВ), вводили в состав препарата.
При исследовании параметров токсичности препарата опыты проводили на беспородных белых мышах массой 16-23 г и кроликах массой 2,2-2,7 кг. Подопытные и контрольные животные содержались по возможности в одинаковых условиях, токсическое действие препарата оценивали известными методами [96].
Действие препарата на иммунобиологические показатели организма животных оценивали по таким параметрам, как бактерицидная активность сыворотки ( способность задерживать рост тест-культуры в жидкой среде), активность лизоцима ( способность фермента лизировать тест-культуру Micrococcus lysodekticus). При изучении действия препарата на гематологические и биохимические параметры крови были использованы общеизвестные методами с применением Гемометра Сали, камеры Горяева, анализатора ELAN-6160.
Противопаразитарная эффективность препарата оценивалась путем учета их количества в фекалиях до и после лечения известными методами гельминтоовоскопии при флотации в насыщенном растворе хлорида натрия.
Производственные испытания опытных партий препарата проводили на телятах , коровах и поросятах.
Действие препарата Ниацид-премикс на иммунобиологические параметры организма животных оценивали по динамике содержания Т- и В-лимфоцитов в крови подопытных животных, которым скармливали препарат в терапевтической дозе- 200 Мкг/кг массы тела. В качестве контроля служила группа животных, которая препаратом не обработана.
Культивирование продуцента, выделение из биомассы и химическая очистка авермектинов
Как известно, авермектиновый комплекс, продуцируемый микроорганизмом S. avermitilis, локализован в биомассе продуцента, т.е. в отличие от многих известных биологически активных веществ, продуцируемых стрептомицетами, авермектины не выделяются в КЖ.
Поэтому, если не проконтролировать процесс биосинтеза, особенно, на конечной стадии, когда начинается лизис мицелия продуцента, возможны большие потери целевого продукта [80].
Для оптимального ведения биосинтеза важным является также правильный подбор исходных условий культивирования продуцентов. Поэтому уточнение влияния инокулята на развитие целевых культур является важным этапом отработки технологических процессов микробиосинтеза.
Для получения авермектинового комплекса микроорганизм Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ -56 культивировали в глубинных условиях (колбы качалочные на 750мл, ферментаторы 250 л) на средах, содержащих в качестве основных ингредиентов:
соевую муку 1,0-1,2%; дрожжи кормовые - 0,4-0,6%; кукурузный
экстракт 0,3-0,4%; глюкоза — 2,0-4,0 %, картофельный отвар — 0,3-0,8%.
В качестве инокулята использовали 36-часовой вегетативный посевной материал (ВПМ), который вносили в ферментационную среду в количестве 3-5% от объема среды. Это количество инокулята является оптимальным для изучаемой культуры и используемых режимов культивирования. Экспериментально показано, что скорость роста микроорганизма возрастает с увеличением количества инокулята, но внесение в среду более 10% инокулята не выгодно. Все изложенное хорошо видно из данных рис. 2, показывающих, что скорость роста продуцента авермектинов в период 0-48 час.при плотности посева 1%, 5%, 10% и 20% составляет 0,8; 1,4; 1,8; 1,9; 2,08;2,02г/л.час.
Влияние количества инокулята на развитие S. avermitilis
Количество инокулята (%)
Рис.2 Процесс развития микроорганизма в глубинных условиях на жидкой питательной среде в относительно оптимальных условиях в течение всего технологического цикла характеризуется стабильными показателями. Наиболее высокая скорость развития и биосинтеза наблюдается в период 48-72 часа. В этот же период начинается биосинтез целевого продукта-авермектинов (вторичный метаболит).
При отработке технологии выделения и очистки синтезированных авермектинов мицелиальную массу микроорганизма отделяли от культуральной жидкости путем фильтрования на НУТЧ-фильтре. Полный технологический цикл, выделения и очистки целевого продукта из биомассы продуцента включает следующие операции: - промывание мицелия от остатков питательной среды непосредственно на фильтре
подкисленной водопроводной водой, подсушивание мицелия или механический отжим до влажности 75%;
-последовательная 3-х-кратная экстракция авермектинов из биомассы органическими растворителями (ацетон, этанол, изопропанол и др.);
-вакуум-выпарка органического растворителя при 45-48 С;
-перераспределение авермектинов в хлороформе и удаление воды.
-выпарка хлороформенного экстракта, растворение в изопропиловом спирте (ИПС) и стандартизация до необходимой концентрации. Основные этапы технологического процесса культивирования, концентрирования (отделения от биомассы S.avermilis) и экстракции авермектинового комплекса представлены на рис. 3. Как видно из данных рис.3 технологическая схема включает традиционные в биотехнологии операции и оборудование. После вьщеления из биомассы, химической очистки и стандартизации авермектиновый "комплекс может быть использован для получения готовых лекарственных препаратов любой необходимой формы. Важным моментом технологического цикла является установление подлинности полученного авермектинового комплекса. Для этого мы использовали как метод ВЭЖХ, так и более доступный и быстрый спектрофотометрический експресс-метод определения авермектинов( 82)
Похожие диссертации на Разработка технологии получения препарата ниацид-премикс и оценка его эффективности против паразитозов животных
