Введение к работе
Актуальность работы. Ферменты широко используются в различных видах деятельности: медицине, сельском хозяйстве, химическом синтезе, пищевой промышленности. Промышленные процессы с применением ферментов внедрены, прежде всего, в фармацевтическую и пищевую промышленность. Повсеместное использование ферментов до последнего времени сдерживалось вследствие ряда причин, таких как снижение каталитической активности в процессе реакции, трудоемкость отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции, нестабильность ферментов при хранении и при действии различных факторов, высокая стоимость чистых ферментных препаратов.
Для их преодоления целесообразно использовать иммобилизованные формы ферментов, которые имеют ряд очевидных преимуществ перед растворимыми катализаторами.
В настоящее время достигнуты значительные успехи в технологии получения иммобилизованных ферментных препаратов для использования в различных областях деятельности. Для их широкого использования необходимо преодолеть ряд трудностей, в первую очередь связанных с использованием дорогостоящих реагентов и использованием многостадийных процессов, требующих значительных временных затрат и соответствующего оборудования.
В качестве носителей для иммобилизации ферментов в последнее время интерес представляют нанообъекты. Повышенное внимание к наноматериалам обусловлено тем, что при переходе в наноразмерное состояние происходит изменение ряда важных свойств вещества. Одним из главных факторов, определяющих физические характеристики наноразмерных объектов, выступает развитая поверхность, что способствует преобладанию поверхностных явлений. Благодаря своим размерам, сопоставимым с размерами клеток, вирусов, белков, ДНК, наночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и связываться с ним. Все вышеизложенное указывает на актуальность настоящего исследования.
Представленные результаты были получены в ходе исследований, проводившихся в 2009-2011 гг. в рамках следующих научных программ и проектов, участником и руководителем которых была соискатель: программа «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК»), государственный контракт №7221р/10112 «Разработка технологии получения циклических аминокислот из молочной сыворотки»; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013, государственный контракт №П2064 «Разработка технологии получения органических наноком-позиционных носителей для выделения и иммобилизации биологических веществ»; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013, государственный контракт №14.740.11.0475 «Разработка специфичных ферментных биосенсоров на основе нанообъектов для контроля качества пищевой продукции».
Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина и
оценка эффективности его использования.
Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:
изучить физические характеристики и химический состав частиц БезО^ используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина;
оптимизировать параметры иммобилизации химотрипсина на немодифи-цированные частицы БезС^ и частицы БезО^ модифицированные амино-и карбоксильными группами;
охарактеризовать физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата;
разработать технологию получения иммобилизованной формы ферментного препарата;
оценить эффективность применения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина при ферментативном гидролизе вторичного ке-ратинсодержащего сырья.
Научная новизна работы. Показано, что реакция гидролиза смеси хлоридов железа (II) и (III) в щелочной среде приводит к получению агломератов диаметром от 0,2 до 80,0 мкм, состоящих из частиц диаметром от 10 до 100 нм.
Установлен химический состав наночастиц, соответствующий формуле Без04. Показано, что обработка наночастиц БезС^ аминопропилтриэтоксисила-ном приводит к модификации поверхности частиц реакционноспособными аминогруппами, а обработка полиакриловой кислотой - к модификации реакционноспособными карбоксильными группами.
Практическая значимость работы заключается в разработке методики, позволяющей упростить модификацию поверхности наночастиц БезС^ реакционноспособными функциональными группами: карбоксильными в случае кар-бодиимидной иммобилизации и аминогруппами - в случае глутаральдегидной иммобилизации. Разработанная методика позволяет удешевить технологию получения иммобилизованного препарата и продуктов, полученных с его использованием.
Разработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.
Основные положения, выносимые на защиту.
Физические свойства и химический состав частиц БезО^ используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина.
Оптимальные параметры иммобилизации химотрипсина на немодифи-цированные наночастицы БезС^ и модифицированные аминогруппами и карбоксильными группами.
Физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата.
Технология получения иммобилизованной формы ферментного препарата химотрипсина.
Оптимальные параметры гидролиза кератина иммобилизованным хи-мотрипсином.
6. Технологическая схема получения кормовой добавки на основе химот-рипсинового гидролизата кератина.
Апробация работы. Материалы по разработке технологии получения иммобилизованного ферментного препарата представлены на II Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово, 2009); на II Международном форуме по нано-технологиям Rusnanotech (г. Москва, 2009); на Всероссийской конференции «Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах» (г. Кемерово, 2009); на XXV Всероссийском открытом конкурсе научно-исследовательских, изобретательских и творческих работ «Национальное Достояние России» (г. Москва, 2010); на III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе в отраслевых журналах, рекомендованных ВАК: «Фундаментальные исследования», «Достижения науки и техники АПК».
Получен патент на изобретение №2425879 «Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ», подана заявка на получение патента №2009138371/10 «Способ иммобилизации протеолитических ферментов на наночастицах БезС^» (приоритет от 16.10.2009).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, организация, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, практическая реализация результатов исследований, выводы, библиографический список и приложения. Основное содержание работы изложено на 128 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 42 рисунка. Список литературы включает 172 наименования.
