Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 58
1.1. Характеристика объекта исследований 58
1.2. Условия культивирования и питательные среды 58
1.3. Методы получения очищенного ферментного препарата 62
1.4. Методы, использованные при исследовании свойств препарата 64
1.5. Методы определения активности ферментов 64
1.6. Прочие методы 66
ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА НАПРАВЛЕННЫЙ БИОСИНТЕЗ КСИЛАНАЗЫ МИКРОСКОПИЧЕСКИМ ГРИБОМ Trichoderma viride 44-11-62/3 69
2.1. Некоторые сведения о штамме-продуценте - микроскопическом грибе Trichoderma viride 44-11 -62/3 69
2.2. Влияние различных источников углерода на синтез кси-ланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 71
2.3. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза ксиланазы с использованием методов математического планирования эксперимента 75
2.4. Влияние предварительной ферментативной обработки углеродсодержащих субстратов питательной среды на биосинтез ксиланазы 90
2.5. Заключение. 97
ГЛАВА 3. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА КСИЛАНАЗЫ УСЛОВИЯМИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Trichoderma viride 44-11-62/3... 98
3.1. Влияние возраста и дозы посевного материала на рост и биосинтетическую активность продуцента 98
3.2. Влияние температуры культивирования на биосинтез ксиланазы 102
3.3. Влияние начального значения рН питательной среды
на биосинтез ксиланазы 104
3.4. Влияние интенсивности аэрирования на синтез ксиланазы 108
3.5. Динамика культивирования микроскопического гриба Tr. viride 44-11 -62/3 при оптимальных условиях 115
3.6. Интенсификация биосинтеза ксиланазы с помощью подпитки углеродсодержащими субстратами питательной среды 118
3.7. Заключение 125
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА КСИЛАНАЗЫ 127
4.1. Изучение стабильности ксиланазы в фильтратекультуральной жидкости 127
4.1.1. Влияние температуры фильтрата культуральной жидкости на стабильность ксиланазы при хранении 127
4.1.2. Влияние рН фильтрата культуральной жидкости на стабильность ксиланазы при хранении .; 128
4.2. Исследования процесса очистки и концентрирования ферментного раствора ксиланазы методом ультрафильтрации 130
4.2.1. Выбор ультрафильтрационных мембран 131
4.2.2. Влияние предварительной очистки фильтрата культуральной жидкости на скорость ультрафильтрации... 134
4.2.3. Влияние рН фильтрата культуральной жидкости на процесс ультрафильтрации 136
4.2.4. Исследование оптимальной степени концентрирования ферментного раствора ксиланазы 138
4.3. Сушка препарата ксиланазы 141
4.4. Испытание технологии получения препарата 144
4.5. Описание технологической схемы получения препарата «Ксилозим»
4.6. Заключение 150
ГЛАВА. 5. ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА «КСИЛОЗИМ» 151
5.1. Оптимальные условия действия препарата 151
5.2. Характеристика ферментного комплекса препарата 154
5.3. Заключение 158
ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА «КСИЛОЗИМ» 159
6.1. Исследование ферментного препарата «Ксилозим» при производстве хлебобулочных изделий 159
6.2. Применение ферментного препарата «Ксилозим» в виноделии 163
6.3. Применение ферментного препарата «Ксилозим» в составе мультиэнзимной композиции для обработки комбикормовой продукции 164
6.4. Заключение 165
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ 167
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 169
ПРИЛОЖЕНИЯ 202
- Условия культивирования и питательные среды
- Некоторые сведения о штамме-продуценте - микроскопическом грибе Trichoderma viride 44-11 -62/3
- Влияние возраста и дозы посевного материала на рост и биосинтетическую активность продуцента
Введение к работе
Актуальность темы. Интерес к ксиланазам - ферментам, расщепляющим растительные полисахариды - ксиланы, неуклонно растет благодаря огромному потенциалу их использования в сельскохозяйственном производстве и ряде отраслей промышленности, ориентированных на переработку растительного сырья. Ксиланы являются наиболее распространенными гемицеллюлозами, составляют более 30 % сухого веса растительной биомассы и занимают второе место по распространенности после целлюлозы.
В настоящее время ксиланазы нашли широкое применение в пищевой промышленности для повышения выхода и качества продукции в производствах хлеба, соков, вин, пива, спирта, растительного масла, растворимого кофе и др. Ксиланазы используются с высокой эффективностью в целлюлозо-бумажной промышленности для отбеливания бумажной пульпы. Они улучшают качество грубых кормов для сельскохозяйственных животных и птицы.
Наряду с другими гидролитическими ферментами ксиланазы можно использовать для повышения выхода белковых веществ, пигментов, крахмала, пектина, сахаристых и биологически активных веществ за счет разрушения клеточных стенок растительного сырья.
С каждым годом накапливается все больше данных в пользу экономической рентабельности ферментативного способа получения ксилозы из отходов промышленности и сельского хозяйства. Ксилоза, получаемая при ферментативном гидролизе ксиланов, может быть превращена в ксилит и фурфурол, широко применяемые в химической и фармацевтической промышленности, может служить источником углерода для микроорганизмов с целью получения топлива и различных химических соединений (уксусной кислоты, этанола, бутанола, метана, ацетона и др.), а также белковых кормовых продуктов.
В последние годы производство ксиланаз, наряду с целлюлазами и пектиназами, значительно расширено. Эти ферменты занимают около 20% мирового промышленного производства ферментов (Mantyla et al., 1998). Основными продуцентами, используемыми для производства ксиланаз, являются культуры Trichoderma и Aspergillus (Uhlig, 1998).
В настоящее время промышленное производство препаратов ксиланазы в нашей стране отсутствует. На внутреннем рынке присутствуют препараты ксиланазы зарубежных фирм и комплексные целлюлолитические ферментные препараты, в которых ксиланаза является сопутствующим ферментом.
В связи с этим разработка технологии получения высокоэффективного конкурентоспособного ферментного препарата ксиланазы для пищевой промышленности и других отраслей, перерабатывающих растительное сырье, и создание производства на отечественных заводах является своевременной и актуальной задачей.
В качестве перспективного продуцента ксиланазы в работе был использован микроскопический гриб Trichoderma viride 44-11-62/3, применяемый в настоящее время как продуцент целлюлолитических ферментов, в частности при производстве ферментного препарата «Целловиридин». Данный штамм способен синтезировать ксиланазу, которая при производстве целлюла-зы присутствует как сопутствующий фермент. Известно, что микроорганизмы, в том числе микроскопические грибы, обладают высокой адаптивностью к изменению внешних факторов — источников питания и условий роста, что обусловлено гибкой регуляцией обменных процессов, включая синтез ферментов, принимающих участие в их физиологии питания. Это предполагает возможность направленного изменения соотношения основных деполимераз, образующихся при культивировании микроскопического гриба Tr. viride 44-11-62/3 и повышения активности ксиланазы.
Штамм хорошо изучен с точки зрения его способности синтезировать ферменты целлюлазного комплекса. В то же время следует сказать, что закономерности биосинтеза других компонентов ферментного комплекса, и в частно
сти ксиланазы, изучены неполно. В связи с этим исследование регуляторных механизмов ферментообразования является необходимым условием целенаправленного использования биосинтетического аппарата микроорганизма.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 и условий направленного повышения ее активности, а также разработка технологии получения очищенного ферментного препарата.
Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
• изучить закономерности биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Tr. viride 44-11-62/3 на различных источниках углерода, оптимизировать состав питательной среды и условия культивирования для направленного повышения биосинтеза ксиланазы и изменения соотношения ксиланазы и целлюлазы;
• разработать режимы выделения, очистки, концентрирования и сушки фермента;
• изучить основные физико-химические и биохимические свойства ксиланазы Tr. viride 44-11-62/3;
• разработать нормативно-техническую документацию на получение препарата;
• исследовать эффективность применения полученного ферментного препарата ксиланазы в различных отраслях народного хозяйства. Научная новизна. Впервые выявлены закономерности биосинтеза
ксиланазы микроскопическим грибом Tr. viride 44-11-62/3 на различных источниках углерода.
Показано, что индуцирующими биосинтез ксиланазы факторами являются ксилан, а также ксилан- и целлюлозосодержащие субстраты, такие как пшеничные отруби, целлюлоза, солодовые ростки и продукты их ферментативного гидролиза, применение которых позволяет интенсифицировать процесс биосинтеза.
Разработаны условия дополнительного введения источника углерода в процессе культивирования продуцента, позволившие увеличить активность ксиланазы на 43 %.
Разработаны приемы регулирования биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Tr. viride 44-11-62/3 за счет использования индукторов биосинтеза и оптимизации условий культивирования гриба, что позволило не только повысить синтетическую активность продуцента, но и существенно изменить соотношение активностей ксиланазы и целлюлазы в культуральной жидкости (с 0,74:1 до 5,3:1), а также сократить время культивирования гриба со 168 до 96 ч.
Впервые охарактеризованы ферментный комплекс и субстратная специфичность полученного препарата и изучены физико-химические свойства ксиланазы Tr. viride 44-11-62/3 (рН , Топт, рН- и термостабильность, субстратная специфичность и др).
Практическая значимость работы. На основании полученных данных разработана технология получения ферментного препарата ксиланазы «Ксило-зим» и утверждена нормативно-техническая документация, включающая опытно-промышленный регламент получения ферментного препарата «Ксилозим» и технические условия на препарат. Получено разрешение Минздрава РФ на использование препарата «Ксилозим» в пищевой промышленности.
Показано, что препарат эффективен в хлебопекарной промышленности. Разработаны рекомендации по его использованию в качестве улучшителя хлеба, получаемого с использованием ржаной и пшеничной муки.
Показана перспективность применения препарата «Ксилозим» в виноделии для повышения выхода виноматериалов и повышения скорости фильтрации сусла.
Разработаны рекомендации по использованию ферментного препарата «Ксилозим» в составе мультиэнзимной композиции МЭК-СХ-3, предназначенной для введения в комбикорма с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов для сельскохозяйственных животных и птицы.
Стоимость препарата «Ксилозим» составляет 480 руб/кг, в то время как стоимость препаратов аналогичной степени очистки фирмы «Novozymes» -20-25 долларов за 1 кг (566,0-707,5 руб). Экономический эффект от использования 1 кг препарата «Ксилозим» в хлебопекарном производстве взамен импортного препарата «Пентопан 500BG» фирмы «Novozymes» при расходе препаратов 0,10 кг на 1 т муки составит 227,5 руб.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на международных и российских научно-технических конференциях, симпозиумах и конгрессах, в том числе на II Международной научно-практической конференции (Ялта, 2001г.); Первом съезде микологов «Современная микология в России» (Москва, 2002 г.); I, II, IV Международных конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развитии» (Москва, 2002, 2003, 2005 г.г.); на заседаниях Ученого совета НТЦ «Лекбиотех».
Публикации. По результатам исследований опубликованы 4 статьи и 4 тезиса докладов, в которых отражены основные положения диссертации.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 222 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 18 таблиц, список литературы включает 303 наименования.
Условия культивирования и питательные среды
Объектом исследования служил штамм микроскопического гриба Trichoderma viride 44-11-62/3. Культура получена в Институте биотехнологии путем индуцированной селекции (Острикова и др., 1989). Штамм депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ГУП ГНЦ РФ ГосНИИ генетика под номером F-374.
Хранение культуры осуществляли на агаризованной ферментационной среде. С целью предотвращения накопления в популяции нежелательных мутантов 1-2 раза в год проводили скрининг с проверкой функциональной активности клеточных клонов, сохраняющих исходные свойства. Для этого суспензию спор рассевали на чашки Петри с агаризованной ферментационной средой, выбирали наиболее типичные колонии и проверяли их на способность к биосинтезу ксиланазы путем высева на ферментационную среду. Самый активный вариант рассевали на агаризованные косяки и получали рабочую партию культуры, которую использовали для получения мицелиаль-ного посевного материала.
1.2. Условия культивирования и питательные среды
1.2.1. Культуру в лабораторных условиях выращивали глубинным способом в колбах Эрленмейера объемом 750 см на круговой микробиологической качалке, в опытных условиях - в ферментерах емкостью 10 дм3 и 100 дм3.
1.2.2. Влияние источников углерода на направленный биосинтез ксиланазы исследовали путем культивирования продуцента в колбах Эрленмейера на круговой микробиологической качалке, содержащих 50 см3 питательной среды, в течение 5 и 7 суток на модифицированной среде Чапека следующего состава, вес. %: (NH4)2S04 - 0,2, КН2Р04 - 0,1, MgS04.7H20 - 0,05, КС1 -0,05, FeS04 -0,001, пептон - 0,2. В качестве источника углерода использова 59
ли глюкозу, рамнозу, арабинозу, лактозу, сахарозу, целлобиозу, ксилозу, мальтозу, ксилан, карбоксиметилцеллюлозу, крахмал нативный, крахмал гидролизованный, пектин - в количестве 1 %; микрокристаллическую целлюлозу, порошок целлюлозы, фильтровальную бумагу, древесную муку, пушонку, солому льняную, пшеничные отруби, свекловичный жом, кукурузную муку, соевую муку, солодовые ростки - в концентрации 3,0 %. Гидролиз крахмала осуществляли ферментным препаратом «Амилосубтилин ГЗХ» в течение 2-х часов при температуре 75+5 С.
Начальное значение рН питательных сред устанавливали на уровне 5,0-5,5 с помощью раствора NaOH или Н3РО4. Среды стерилизовали в автоклаве при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Засев питательных сред осуществляли споровой суспензией, полученной смывом с двухнедельной культуры гриба. Культивирование вели при температуре 30 С на круговой микробиологической качалке с числом оборотов 200 об/мин.
1.2.3. Оптимизацию состава питательной среды для культивирования продуцента осуществляли с помощью методов математического планирования эксперимента (Грачев, 1971; Максимов, Федоров, 1969).
Планирование оптимального состава питательной среды предусматривало осуществление трех этапов эксперимента: 1 - отсеивающий эксперимент; 2- дробный факторный эксперимент; 3 - крутое восхождение по методу Бокса-Уилсона.
Все варианты опытов ставились в одной повторности. Аналитические определения для каждой пробы производились в трех повторностях. Для определения дисперсии воспроизводимости результатов опыта S2{ у} предварительно был поставлен один из вариантов опыта в 10 повторностях, по которым найдена дисперсия воспроизводимости S2{ у г, рассчитанная по следующей формуле:
Некоторые сведения о штамме-продуценте - микроскопическом грибе Trichoderma viride 44-11 -62/3
Анализ литературных данных показал, что в качестве продуцентов ксиланазы, наиболее перспективных для использования в промышленном производстве ферментов, ведущее место занимают мицелиальные грибы. Среди них особое внимание уделяется грибам рода Trichoderma. Интерес к микроскопическим грибам рода Trichoderma как продуцентам ксиланазы обусловлен их преимущественной перед другими микроорганизмами способностью к биосинтезу большого количества сопутствующих ферментов, гидролизующих полисахариды растительного сырья.
Для внедрения в промышленное производство необходимо, чтобы используемый штамм-продуцент отличался определенным набором показателей, свидетельствующих о его технологичности, к которым относятся: скорость роста и способность к активному накоплению биомассы на доступных средах, высокий экономический коэффициент переработки субстрата, попу-ляционная устойчивость и способность к спорообразованию.
Наиболее перспективным продуцентом, который обладает вышеназванными показателями и может обеспечить синтез высокоактивной ксиланазы, с нашей точки зрения, является микроскопический гриб Trichoderma viride 44-11-62/3. Данный штамм является активным продуцентом комплекса целлюлолитических и гемицеллюлолитических ферментов, в том числе ксиланазы (Острикова и др., 1989).
Микроскопический гриб Tr. viride 44-11-62/3 хорошо изучен с точки зрения его способности синтезировать ферменты целлюлазного комплекса. Он используется в промышленности как продуцент целлюлолитических фер
ментов, в частности при производстве ферментного препарата «Целловиридин». Данный штамм способен синтезировать ксиланазу, которая при производстве целлюлазы рассматривается как сопутствующий фермент. Для производства ферментного препарата «Целловиридин ГЗХ» ис пользуется питательная среда следующего состава, вес.%: жом свекловичный -3,0 солодовые ростки -1,43 NaN03 -0,4 КН2Р04 - 0,2 (NH4)2S04 - 0,4 MgS04 -0,03 Вода - остальное Н питательной среды - 5,5.
В лабораторных условия на данной среде на 168 час роста при глубинном культивировании продуцента активность целлюлазы составляла 46 ед/см , ксиланазы - 34 ед/см , при этом соотношение активностей ксила-назы и целлюлазы в питательной среде составляло 0,74:1. Данная среда является оптимальной для биосинтеза целлюлазы. В то же время она не обеспечивает высокого уровня биосинтеза ксиланазы.
Данные по уровню активностей на вышеназванной среде были использованы нами в качестве контроля для оценки направленного процесса биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Tr. viride 44-11-62/3.
Эффективное использование данного штамма в качестве промышленного продуцента ксиланазы зависит от уровня его активности. Известно, что микроскопические грибы способны изменять свой обмен, а, следовательно, и комплекс образующихся ферментов в ответ на действие внешних факторов, т.е. состава питательной среды и условий культивирования. В связи с этим исследование физиолого-биохимических особенностей культуры, изучение регуляции биосинтеза ксиланазы, оптимизация условий культивирования продуцента имеют исключительное значение для интенсификации биосинтетической активности штамма.
Поэтому в задачу исследований входило изучение закономерностей биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Tr. viride 44-11-62/3, позволяющих осуществить направленный биосинтез ксиланазы и повысить ее активность в культуральной жидкости.
Влияние возраста и дозы посевного материала на рост и биосинтетическую активность продуцента
Возраст, точнее физиологическое состояние посевного материала и его количество оказывают существенное влияние на скорость роста микробных культур и динамику накопления метаболитов. От количества и качества посевного материала в значительной мере зависит длительность лаг-фазы развития микроорганизма, продолжительность культивирования, а также уровень биосинтеза ферментов.
Выяснение оптимального возраста и дозы инокулята на биосинтез ксила-назы продуцентом проводили, используя вегетативный посевной материал, имеющий различные сроки культивирования и находящийся в различном физиологическом состоянии. Культуру выращивали в колбах Эрленмейера на качалке на ранее разработанной среде следующего состава, вес. %: отруби пшеничные - 2,0, лактоза - 0,5, диаммоний фосфат - 0,4, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,2, кукурузный экстракт - 0,5. Возраст посевной культуры варьировался от 24 до 48 часов, количество - от 2,5 до 10 %.
При микроскопировании посевного материала в процессе роста культуры на посевной питательной среде можно выявить следующие стадии роста:
4-12 часов роста — набухание спор и прорастание, образование 1-4 проростков. 10-12 часов роста - культура характеризуется формированием боковых гиф и их удлинением.
К 12-14 часам в культуральной жидкости разрастаются многочисленные микроколонии с гомогенной базофильной цитоплазмой. После 18-24 часов роста протоплазма гиф претерпевает изменения. Гифы интенсивно растут в длину, утончаются, слабо ветвятся и образуют густое сплетение мицелия. Протоплазма гомогенна, базофилия ее длительно сохраняется. На 36 час наблюдается дальнейший рост мицелия, сопровождающийся увеличением массы гиф.
К 44-48 часу роста базофилия протоплазмы снижается, в ней появляются гранулы волютина, отдельные гифы переходят в состояние автолиза наряду с формированием новых, более молодых гиф.
Культуру, которую исследовали в качестве инокулята, отбирали в трех точках: в начале экспоненциальной фазы (24 час), в конце экспоненциальной фазы (36 часов) и в стационарной фазе (48 час).
Максимальная продуктивность посевной культуры в отношении ксилана-зы наблюдалась при использовании посевного материала (рис. 5, Б), находящегося в конце экспоненциальной фазы роста в возрасте 36 ч. Данный факт можно объяснить тем, что при засеве питательной среды вегетативным посевным материалом в конце экспоненциальной фазы роста, обрывки гиф с посевного мицелия с базофильной протоплазмой прорастают, и каждый из них дает начало молодой микроколонии.
Похожие диссертации на Направленный биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 и разработка технологии получения ферментного препарата
