Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Характеристика меланинсодержащих биологически активных веществ 8
1.1. Свойства природных меланинов 8
1.1.1. Источники природных меланинов 8
1.1.2. Характеристика физико-химических свойств меланинов 11
1.1.3. Методы выделения меланинов 18
1.2. Биологическое значение меланинов 22
1.2.1. Роль грибов в почвенных процессах гумусообразования 32
Глава 2. Методы и объекты исследований 42
2.1. Методы исследований 42
2.1.1. Биотехнологический метод получения чистых грибов 42
2.1.2.Микробиологические методы тестирования препаратов на антифунгальную активность 43
2.1.3. Метод определения ростостимулирующей активности 44
2.1.4. Метод оценки биологической эффективности препаратов 45
2.2.1. Метод определения биоантиоксидантных свойств 45
2.3. Методика проведения полевых опытов 46
2.4. Характеристика объектов исследования 48
Глава 3. Теоретическое обоснование использования меланинов в качестве основного компонента для получения препаратов с і^* с полифункциональными свойствами 51
Глава 4. Разработка технологии получения комплексных биопрепаратов с полифункциональным действием 57
4.1. Выделение и исследования свойств меланинов различной природы 57
4.2. Разработка технологии получения биопрепаратов с полифункциональными свойствами на основе меланинов уп и пиразолинов
4.3. Физико-химические показатели выделенного меланина грибного происхождения 88
Глава 5.Исследование биологической активности препарата из грибного меланина, пиразолина и комплексного препарата на их основе 92
5.1. Изучение ростостимулирующей активности комплексных
препаратов на основе меланина и пиразолина 92
5.2. Изучение биоантиоксидантной активности препарата на основе меланина 97
5.3.Исследование влияния препаратов на мицелий и споры фитопатогенных грибов in vitro 99
5.4. Расчет эффективности производства комплексного препарата и его применения в растениеводстве
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Библиографический список 122
Приложение 137
- Характеристика физико-химических свойств меланинов
- Биотехнологический метод получения чистых грибов
- Теоретическое обоснование использования меланинов в качестве основного компонента для получения препаратов с і^* с полифункциональными свойствами
Введение к работе
Актуальность темы. Важнейшим направлением современной биотехнологии является разработка технологии получения биологически активных веществ, в частности, меланинов, которые находят широкое применение в медицине, фармакологии, пищевой и других отраслях промышленности.
В природе распространены меланины животного и микробиологического происхождения, проявляющие высокую биологическую активность, отличающиеся широким разнообразием по химическому составу, физиологическим свойствам.
Актуальным представляется поиск наиболее перспективного сырьевого источника для выделения меланинов и разработка на его основе биотехнологии получения препарата, с полифункциональными свойствами и с максимальным сохранением комплекса природных соединений.
Анализ литературных источников за последние 20 лет, указывает на ограниченное число публикаций по применению меланинсодержащих препаратов в качестве активных регуляторов роста растений. В связи с этим возникает необходимость разработки препарата на основе меланинов, а также комплекса исследований данного препарата с оценкой экономической эффективности его применения в растениеводстве.
Цель работы - разработка технологии получения комплексного препарата с полифункциональным действием на основе природного меланина и пиразолинов, изучение его биологической активности и проведения исследований по применению данного препарата в растениеводстве.
Задачи исследования: - изучить влияние сырьевого источника на выход меланина, и его биологическую активность, исследовать ростостимулирующую и фунгицидную активность синтетических препаратов на основе пиразолинов;
провести исследования с целью установления оптимального сырьевого источника меланина, оптимальных концентраций компонентов препарата и их соотношение;
разработать технологию получения комплексного препарата на основе меланина и пиразолина, изучить его состав и провести стандартизацию;
исследовать ростостимулирующие и фунгицидные свойства комплексного препарата и его компонентов в лабораторных условиях, исследовать действие препарата на продуктивность агрокультуры и его влияние на качество продукции;
оценить экономическую и энергетическую эффективность, экологическую безопасность разработанной технологии получения комплексного препарата и его применении в растениеводстве.
Научная новизна работы. Впервые установлен эффект ростостимулирующеи активности природного меланина при действии на семена озимой пшеницы. Установлено, что меланин грибного происхождения рода Penicillium по ростостимулирующеи активности значительно превосходит активность меланинов растительного происхождения и данный сырьевой источник обеспечивает значительный выход пигмента и его высокую биологическую активность.
Впервые исследованы ростостимулирующая и фунгицидная активности 22-х препаратов на основе пиразолинов, среди которых наибольшую антифунгальную активность проявляют 5 производных пиразолинов.
Впервые разработана технология получения комплексного препарата,
включающая этапы микробиологического синтеза, дезинтеграции грибного
мицелия, экстракции в щелочной среде меланинов с последующим осаждением
продукта и смешиванием с производным пиразолина (4-(5-гидрокси-3-метил-1-
фенил-4,5-дигидро-1Н-пиразол-4-илазо) бензол сульфокислота). Осуществлена
стандартизация препарата по биологической эффективности,
биоантиаксидантной активности, уровню оптической плотности, определены условия сохранения стабильности препарата в течение трех лет.
Установлен эффект синергизма в комплексном препарате на основе грибного меланина и пиразолина, который проявляется в увеличении
6 всхожести семян озимой пшеницы до 100% и в способности подавлять прорастание спор фитопатогенных грибов в 2-2,5 раза интенсивнее контроля.
Выявлен положительный эффект действия комплексного препарата на основе меланина и пиразолина, проявляющейся в стимуляции роста и развития растений, повышении устойчивости растений к заболеваниям при предпосевной обработке семян озимой пшеницы.
Научно-практическая значимость. В ходе исследований были получены экспериментальные данные по оптимизации стадий биотехнологии получения комплексного препарата с поли функциональными свойствами. Препарат стандартизирован по биологической эффективности, установленной проявлением ростостимулирующей активности на семена агрокультур, уровню оптической плотности, биоантиоксидантным свойствам.
Проведенные производственные испытания препарата на основе меланина и 4-(5-гидрокси-3-метил-1-фенил-4,5-дигидро-1Н-пиразол-4-илазо) бензолсульфокислоты показали, что при обработке семян пшеницы препаратом при дозировке 2 л/т наблюдается эффект повышения на 12,3% продуктивности растений, установлено значительное улучшение качественных показателей продукции растениеводства, что подтверждено актом внедрения.
Основные положения диссертации использованы в учебном процессе по курсу «Основы биотехнологии» студентов агрономических специальностей в Ставропольском государственном аграрном университете.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты сравнительных исследований по проявлению
ростостимулирующей активности меланинов микробиологического и
растительного происхождения.
2. Синтез препарата на основе пиразолина 4-(5-гидрокси-3-метил-1-
фенил-4,5-дигидро-1Н-пиразол-4-илазо) бензолсульфокислота, с установлением
его ростостимулирующей активности при действии на растение и фунгицидной
активности при действии на споры фитопатогенных грибов.
3. Разработка технологии получения комплексного препарата на основе
меланина и пиразолина, включающая этапы микробиологического синтеза,
дезинтеграции грибного мицелия, экстракции меланинов в щелочной среде, с
7 последующим осаждением пигмента и смешиванием с производным пиразолина.
4. Результаты исследований по выявлению в комплексном препарате на основе меланина и пиразолина, с усилением ростостимулирующей активности, фунгицидных и биоантиоксидантных свойств, обеспечивающих повышение продуктивности агрокультуры при использовании препарата для предпосевной обработки агрокультуры.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на научно-практических конференциях Ставропольского Государственного Аграрного Университета в 2002, 2003, 2004, 2005 годах; Международной научной конференции «Повестка дня на XXI век: Программа действия - экологическая безопасность и устойчивость развития» (Ставрополь, 2003); Всероссийской научной конференции «Биотехнология 2003» (Сочи, 2003); научно-методической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2004); 68-й научно-практической конференции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (Ставрополь, 2004); Всероссийской научной практической конференции посвященной 40-летию факультета защиты растений (Ставрополь, 2004); 50-й научной конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, библиографического списка, примечаний. Работа изложена на 136 страницах, содержит 9 рисунков, 25 таблиц. Библиографический список состоит из 156 наименований.
Характеристика физико-химических свойств меланинов
Характеристика физико-химических свойств меланинов К меланинам относятся высокополимерные соединения, образующиеся при ферментативном окислении фенолов, главным образом пирокатехина, и последующей окислительной полимеризацией этих соединений. Таким образом, меланины могут быть азотсодержащими и безазотистыми соединениями (Мирчинк, 1988).
С физико-химической точки зрения меланины представляют собой сложные гетерополимеры, различающиеся не только по связям, но и по мономерным единицам. Меланин - единственный природный полимер с сильно развитой системой полисопряжения, хотя биомолекулы, построенные из частично сопряженных систем (гормоны, витамины, нуклеиновые кислоты и белки), известны биохимикам, как соединения участвующие в фундаментальных живых системах (Лях,1981). В настоящее время установлено, что меланины являются полимерами хиноидных соединений. Классическая структура меланина - это длинноцепочечный полимер, состоящий из индолин - 5,6 хиноновых единиц (Бриттон,1986).
Поскольку в образование меланинов участвуют разнородные по строению исходные мономеры без строгой закономерности в их чередовании, строение меланинов весьма сложно и разнообразно. Следует отметить, что элементный состав отдельных меланинов сильно варьирует из-за большой неоднородности данной группы веществ. Тем не менее, при изучении элементного состава отдельных меланинов разных групп организмов выявилась определенная закономерность: меланины животных всегда азотсодержащие соединения, а растительные меланины, или фитомеланины либо полностью лишены азота, либо содержат его в незначительных количествах. Так, в меланинах животных содержание азота колеблется от 5 до 8%, тогда как в фитомеланинах оно составляет 0,3-0,7% или азот полностью отсутствует.
Биотехнологический метод получения чистых грибов
Микробиологический посев почвы и отделения грибов в чистую культуру проводили по методикам почвенной микробиологии и биохимии Д.Т. Звягинцева (1980).
Перед микробиологическим посевом проводили предварительную подготовку почвы. В почвенной суспензии, из которой производится посев, должны содержаться только одиночные свободноплавающие клетки. Для этого производили диспергирование, путем растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния.
Для получения и учета почвенных микроорганизмов проводили поверхностный посев на чашки Петри. В чашки наливали расплавленную среду Чапека, в каждую чашку по 20-30 мл среды. После застывания среды, чашки помещали в простерилизованный и нагретый до 80 С сушильный шкаф, после чего их охлаждали до комнатной температуры и в тот же день проводили посев.
После предварительного диспергирования почвы, готовили разведение почвенной суспензии. Посев производили из разведения 1:10. Засеянные чашки переворачивали вверх дном и помещали в термостат при температуре 28 С, грибы подсчитывали через 7 суток. Проводили идентификацию колоний грибов, для дальнейшего выделения их в чистую культуру.
Для выращивания чистой культуры грибов использовали жидкую среду Чапека, содержащую на 1 литр дистиллированной воды: К2НР04 - 0,2 г; MgS04 7Н20 - 0,2 г; КС1 - 0,1 г; NH4NO3 - 2 г; глюкозы - 30 г. посев производили нанесением небольшого количества посевного материала (спор или мицелия) специальной иглой в виде крючка в питательную среду. Фитопатологическую экспертизу семян озимой пшеницы проводили микробиологическим методом в соответствии с требованиями ГОСТа 12044-93 и по методике Н. А. Наумовой (1970).
Материалы, реактивы оборудование и аппаратура соответствовали стандарту. Посуду и питательные среды для проведения анализов стерилизовали автоклавированием.
Теоретическое обоснование использования меланинов в качестве основного компонента для получения препаратов с і^* с полифункциональными свойствами
Одним из современных направлений биотехнологии является разработка эффективных биопрепаратов и стимуляторов роста растений, применение которых в растениеводстве обеспечит повышение урожайности и качественных показателей экологически чистой продукции.
В биотехнологии микробиологический метод является перспективным направлением в получение биопрепаратов и продуктов метаболизма микроорганизмов. По сравнению с химическими, биологические препараты, полученные на основе микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, отличаются их экологичностью и низкой себестоимостью (Брыкалов, 2003).
Свойство микробиопрепаратов и регуляторов роста стимулировать иммунную систему и индуцировать неспецифическую устойчивость растений к различным болезням представляет особую ценность. Это позволяет использовать их для создания экологических систем защиты культур от патогенов (Чершова, 2000; Ларионов, 2001).
Разработка комплексных препаратов с полифункциональными свойствами является актуальной задачей. Важнейшими аспектами решения данной проблемы является оптимизация состава компонентов, проявляющих ростостимулирующие, фунгицидные свойства при условиях снижения пестицидной нагрузки, соблюдение экологичности и экономической целесообразности. Перспективным направлением представляется поиск новых ростостимулирующих компонентов природного происхождения на основе растительных и грибных пигментов меланинов.
Анализ литературный данных, приведенных в главе 1, позволяет получить представление о строении и свойствах меланинов.
Грибные меланины являются сложными природными полимерами, сборка их происходит стохастически и, как правило, из различных мономерных единиц. По мнению Г. Бриттона (1986) любой образец меланина состоит из смеси макромолекулярных веществ. Биосинтез меланинов включает две стадии: 1) на начальном этапе происходит ферментативное окисление фенольных или полифенольных предшественников с образованием хинонов; 2) высокореакционноспособные хиноны легко подвергаются полимеризации или сополимеризации, приводящей к образованию окрашенных меланиновых молекул.
