Содержание к диссертации
Введение
1. Рекомбинантные а-интерфероны человека: продукция и пути усовершенствования (обзор литературы) 11
1.1 Классификация интерферонов 12
1.2 Интерферон-альфа 13
1.2.1 Рецептор интерферона-альфа и сигнальная трансдукция 14
.1.2.2 Молекулярный механизм действия интерферона 17
1.2.3 Биологическая активность интерферона-альфа и его место в иммунном ответе 18
1.2.4 Клиническое применение 20
1.3 Интерфероны-альфа пролонгированного действия 23
1.3.1 Пегилирование 23
1.3.1.1 Физико-химические свойства ПЭГ и пегилированных белков 23
1.3.1.2 Фармакокинетические и фармакодинамические свойства ПЭГ-модифицированных пептидов 25
1.3.1.3 Достоинства и недостатки ПЭГ-модифицированных пептидов 28
1.3.2 Липидизирование 29
1.3.3 Химерный белок "Альбумин-ИФН-а" 29
1.4 Создание продуцентов гетерологичных белков на основе микроорганизмов 35
1.4.1 Экспрессия гетерологичных эукариотических генов в дрожжах 37
1.4.2 Производство гетерологичных белков в метилотрофных дрожжах Р. pastoris 38
1.5 Секреция рекомбинантных белков в дрожжах P. pastoris 46
1.5.1 Процессинг синальной последовательности 47
1.5.2 Гликозилирование 48
1.5.3 Фолдинг секреторных белков в ЭПР 52
1.5.3.1 ШапероныЭПР 54
1.5.3.2 Формирование дисульфидиых связей и цис-транс-пептидилпролин изомеризация . 57
1.5.3.3 Деградация неправильно сложенных белков 60
1.5.3.4 UPR - Реащия несвернутых белков 61
1.5.4 Внутриклеточные и экстраклеточные протеазы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris 66
1.5.4.1 Сериновые протеазы 66
1.5.4.2 Аспарагиновые протеазы семейства япсинов 67
1.5.4.3 Способы снижения активности протеолитических ферментов в дрожжевых системах экспрессии 69
2. Материалы и методы 73
2.1 Материалы 73
2.1.1 Штаммы 73
2.1.2 Условия культивирования штаммов 73
2.1.3 Плазмиды 76
2.2 Методы 78
2.2.1 Трансформация бактерий Е. coli 78:
2.2.2 Трансформация дрожжей по методу PLATE 78
2.2.4 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 79
2.2.6 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 80
2.2.8 Полимеразная цепная реакция 80
2.2.9 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей 81
2.2.10 Определение концентрации белка 81
2.2.11 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS 81
2.2.13 Выделение фракции микросом и белков клеточной оболочки из клеток дрожжей P. pastoris 84
2.2.14 Осаждение белков 85
2.2.15 Разделение белков в растворе. Гель-фильтрация 85
2.2.16 Разделение белков путем адсорбции. Хроматографические методы...86
2.2.17 Определение биологической активности Альбуронаїб 87
3. Результаты 89
3.1 Создание штамма дрожжей P. pastoris - продуцента химерного белка Альбуронаїб 89
3.1.1 Создание вектора экспрессии pPIC9AbFN 89
3.1.2 Получение трансформантов дрожжей P. pastoris, несущих химерный renAbFNie 93
3.1.3 Анализ продукции гетерологичного химерного белка трансформантами P. pastoris 96
3.2 Изучение динамики синтеза и секреции химерного белка 99
3.3 Изучение влияния условий культивирования штамма GS115AbFN16 на уровень секреции 102
3.3.1 Влияние аэрации и способа культивирования на выход биомассы клеток и уровень синтеза белка : 102
3.3.2 Влияние неорганического фосфата на продукцию химерного белка... 106
3.3.3 Влияние температуры и времени культивирования на уровень продукции химерного белка 107
3.3.4 Анализ продуктов протеолиза 109
3.3.5 Анализ влияния рН, температуры, ЭДТА, ЭГТА, PMSF и состава культуральной среды на активность экстраклеточных протеаз дрожжей Р. pastoris 113
3.4 Выделение и очистка химерного белка Альбуронаїб ...119
3.4.1 Очистка Альбуронаїб из среды ВММ 119
3.4.2 Очистка Альбуронаїб из среды ВММ2 129
4. Обсуждение 137
Выводы 161
Список литературы 162
Приложение 195
- Фармакокинетические и фармакодинамические свойства ПЭГ-модифицированных пептидов
- Формирование дисульфидиых связей и цис-транс-пептидилпролин изомеризация
- Выделение фракции микросом и белков клеточной оболочки из клеток дрожжей P. pastoris
- Влияние аэрации и способа культивирования на выход биомассы клеток и уровень синтеза белка
Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие генной инженерии позволило получать
белки медицинского назначения в различных системах экспрессии.
Наибольший интерес представляют интерфероны (ИФН) - группа
биологически активных белков, синтезируемых клетками в ходе защитной реакции в ответ на вирусное воздействие. Многообразие физиологических функций ИФН указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранении гомеостаза. ИФН обладают противовирусными, антимикробными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами. В геноме человека присутствуют 13 структурных генов ИФН-а (INFA) . Для некоторых генов (INFA1, INFA2, INFA4) обнаружено явление полиморфизма (Hussain et al., 1997; Pestka, 2000). Несмотря на высокую степень гомологии ИФН-а, спектр активностей может различаться. Например, ИНФ-а8 и ИНФ-а17 оказались более эффективными в лечении ряда вирусных заболеваний, чем наиболее изученный ИНФ-а2Ь (Garcia et al., 2006; Escuret et al., 2006). ИФН-а16 интересен тем, что этот белок относится к подтипу ИФН-а4, который совместно с ИФН-а1 и ИФН-а2 составляет основную фракцию интерферонов в индуцированных лейкоцитах (Hiscott et al., 1984). Доклинические испытания рекомбинантного ИФН-а16 человека показали, что белок имеет более высокую антивирусную активность по сравнению с Реафероном (ИФН-а2а). Изучение различных представителей семейства интерферонов-альфа позволит установить особенности происхождения генов INFA, причины многообразия свойств ИФН-а и определит наиболее эффективные области их практического использования.
В настоящее время существуют лекарственные препараты, созданные на основе Escherichia coli, основой которых являются рекомбинантные интерфероны-альфа: а2а, а2Ь, а2с. Длительное применение рекомбинантных ИФН бактериального происхождения сопровождается побочными эффектами. Поэтому улучшение фармакологических свойств рекомбинантных ИФН весьма актуально. Существуют два пути решения этой проблемы. Использование эукариотических систем экспрессии, в часности, дрожжевых, позволяет осуществлять корректную посттрансляционную модификацию рекомбинантных белков, препараты не содержат бактериальных пирогенов и эндотоксинов, что позволяет снизить спектр побочных эффектов и значительно улучшить качество жизни пациентов в период длительного лечения. Увеличение периода полужизни рекомбинантного ИФН для снижения частоты инъекций препарата достигается модификацией молекулы белка. Перспективным подходом является создание химерных молекул, содержащих ИФН-а, ковалентно сшитый с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или альбумином. При создании химерных белков следует учитывать, что их свойства могут зависеть от выбранной системы экспрессии, способа создания "гибридного" гена и от условий выделения и очистки.
Очевидно, что оптимальным является использование двух предложенных подходов.
В последнее время для производства рекомбинантных белков различного происхождения используют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris, которые обеспечивают высокий уровень продукции и корректную посттрансляционную модификацию гетерологичных белков и позволяют получать секреторные белки, практически аутентичные белкам млекопитающих (Cereghino et al., 2002). Регуляция экспрессии генов, влияние особенностей метаболизма на уровень синтеза гетерологичных белков в дрожжах P. pastoris изучены недостаточно.
Цель и задачи работы. Цель работы состояла в создании штамма метилотрофных дрожжей P. pastoris продуцента химерного белка "Альбумин-ИФН-а16" и изучении факторов, влияющих на уровень секреции и биологическую активность рекомбинантного белка. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
Создание вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и секрецию химерного белка "Альбумин-ИФН-а16" в дрожжах і3, pastoris.
Получение штамма дрожжей P. pastoris, секретирующего химерный белок "Альбумин-ИФН-а16".
Изучение динамики синтеза химерного белка и его влияния на жизнеспособность штамма-продуцента.
Анализ влияния условий культивирования дрожжей на уровень секреции рекомбинантного белка и его биологическую активность.
5. Разработка схемы очистки химерного белка из культуральной среды.
Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей Р.
pastoris, продуцирующий химерный белок "Альбумин-ИФН-а16"
(Альбуроніб). Показано, что, в отличие от дрожжей Saccharomyces cerevisiae,
синтез гибридного белка не оказывает токсичного действия на клетки дрожжей
P. pastoris, при этом белок не накапливается в клетке и секретируется в
биологически активной форме. Продемонстрировано, что использование 0,5 М
неорганического фосфата, снижение температуры и аэрации на стадии
индукции синтеза повышает уровень продукции Альбуронаїб. Установлено,
что химерный белок способен агрегировать за счет гидрофобных
взаимодействий. Обнаружено, что дрожжи P. pastoris в норме секретируют
протеолитические ферменты, которые способны расщеплять гибридный белок.
Предложена гипотеза, объясняющая возможные причины появления протеаз в
культуральной жидкости и их роль в метаболизме дрожжевых клеток.
Практическая ценность. Созданный штамм дрожжей P. pastoris продуцент
рекомбинантного химерного белка Альбумин-ИФН-а16 GS115AbFN16 может
быть использован для производства отечественного препарата Альбуронаїб,
обладающего улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с
^модифицированными рекомбинантными интерферонами. Условия
оптимизации процессов культивирования полученного штамма-продуцента и
схемы очистки рекомбинантного белка могут быть положены в основу
технологического регламента для такого производства. Полученные в работе
данные о влиянии различных факторов на уровень секреции и биологическую
активность химерного белка, а также разработанные схемы очистки могут быть
использованы для создания штаммов дрожжей P. pastoris продуцентов других сшитых с альбумином белков - ИФН-|3, интерлейкин-2, и др. Положения, выносимые на защиту:
Присоединение альбумина к ИФН-а16 без линкерных аминокислот не снижает биологическую активность интерферона.
Дрожжи P. pastoris осуществляют корректный фолдинг химерного белка. Синтез гетерологичного белка не влияет на жизнедеятельность клеток.
Протеазы, в норме секретируемые дрожжами P. pastoris, специфически расщепляют альбумин, что необходимо учитывать при использовании данной системы экспрессии для получения сшитых с альбумином рекомбинантных белков.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на III Московском международном конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" (Москва, Пущино, 2006), XI международной школе-конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (Москва, 2007), международной конференции Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting (Торонто, 2008), V съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2009), III международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, 2009).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов. Список литературы включает 306 источников (17 публикаций отечественных авторов и 289 публикаций иностранных авторов). Работа изложена на 198 страницах машинописного текста и содержит 50 рисунков и 6 таблиц.
Фармакокинетические и фармакодинамические свойства ПЭГ-модифицированных пептидов
ПЭГ - модифицированные пептидные препараты имеют на сегодняшний день большие перспективы при лечении таких заболеваний, как ферментные дефициты, лейкемия, хронические воспалительные заболевания, онкология, хронические вирусные инфекции, кардиоваскулярная патология. Пегилированные лекарственные препараты пептидной структуры обладают рядом весомых и несомненных преимуществ по сравнению с природными аналогами: усиление биологической активности, удлинение периода "эффективной" полужизни, замедление выведения, отсутствие пиков плазменной/тканевой концентрации, понижение токсичности и иммуногенности (Knauft et al., 1988; Baker, 2001). Кроме этого, было показано, что ПЭГ-модифицированные ИФН-а2а и ИФН-а2Ь не индуцируют развитие депрессии, которая является следствием инъекции ИФН (Loftis et al., 2006). Однако было бы неверным считать, что пегилирование имеет только положительный результат, а ПЭГ-коньюгаты по всем параметрам превосходят природные пептиды. Основным недостатком ПЭГ - коньюгированных пептидов является возможное уменьшение активности белка, связанное с выбором "неправильного" размера или структуры ПЭГ; с этой же причиной может быть связано и возможное удлинение времени элиминации пептида (Никитин и Сторожаков, 2001). Нуклеофильное присоединение ПЭГ по аминогруппам полипептида носит вероятностный характер, и зачастую приводит к получению в растворе изомерных форм ПЭГ-модифицированных белков (Dhalluin et al., 2005). При этом физико-химические, биологические и фармакологические свойства таких изомеров могут сильно отличаться, что делает необходимым использование многочисленных стадий очистки белка в ходе его производства. Конечный выход биологически активного препарата оказывается очень низким. Поэтому в настоящее время активно ведутся исследования по оптимизации процесса присоединения ПЭГ к различным молекулам, и разрабатываются новые способы конъюгации белка с ПЭГ, например, с участием тиоловых групп (Balan et al, 2007). Длительная терапия пегилированным интерфероном в некоторых случаях вызывает симптомы волчанки. При этом до сих пор нет данных о подобных эффектах ИФН-а или ФНОа (Yilmaz a. Akar Cimen, 2009). Иногда лечение гепатита С ПЭГ-интерферонами оказывается абсолютно неэффективным (Forde a. Reddy, 2009).
В недавних исследованиях был предложен оригинальный способ модификации ИФН-а, который состоит в обратимом ковалентном соединении цистеинового остатка интерферона с остатком пальмитиновой кислоты. Такое изменение молекулы также продлевает время ее полужизни в плазме крови. Особенностью этого подхода является то, что освобождение ИФН-а от жирной кислоты интенсивно происходит в печени, что приводит к локальному повышению концентрации свободного препарата и делает его «нацеленным» на определённый орган. Это свойство может быть особенно полезным при лечении хронических вирусных гепатитов, где желаемым является наибольшее поступление препарата в печень (Yuan et al., 2008).
Многочисленные эксперименты по улучшению фармакокинетических свойств ИФН-а привели к созданию химерного белка, в котором к молекуле ИФН "пришита" молекула альбумина человека, основного компонента плазмы крови. Сывороточный альбумин человека (HSA) - это глобулярный белок, состоящий из 585 АК и имеющий молекулярную массу около 66 кДа. Период его полужизни около 19 дней. В организме альбумин является ключевым элементом в регуляции осмотического давления и гомеостаза, может выступать в качестве антиоксиданта (Roche et al., 2008). Сывороточный альбумин обладает рядом ценных свойств, главным из которых является его способность связывать и транспортировать эндо- и экзогенные лиганды (ионы металлов, жирные кислоты, холестерол, пигменты, белки). Таким образом, он играет роль естественного стабилизатора и переносчика белков плазмы крови. По этой причине его активно используют в медицине (в виде ко-инъекций) в качестве вспомогательного вещества, улучшающего фармакологические характеристики основного лекарственного препарата (Otagiri a. Chuang, 2009). Помимо непосредственного применения в терапии, альбумин является обязательным компонентом в составе большинства лекарственных препаратов белковой природы. Многие биологически активные белки, например интерлейкины или факторы роста, даже при небольших концентрациях (50 мкг/мл для ИФН-ріЬ) легко агрегируют в растворе при физиологическом значении рН или адсорбируются на поверхности ампулы. По этой причине такие белки называют гидрофобными цитокинами. При длительном хранении белки могут полностью потерять свою активность. Добавление в раствор универсального и неиммуногенного стабилизатора - альбумина — предотвращает агрегацию белков и улучшает фармакологические свойства препарата (Hawe a. Friess, 2007; Hawe a. Friess, 2008). Ранее альбумин уже использовали в экспериментах по созданию химерных белков, применяемых в терапии ("альбумин-хирудин", "альбумин-СВ4"). Все эти белки имели длительный период полужизни и обладали высокой стабильностью (Yeh et al., 1992; Syed et al., 1997). Создание активного препарата Альбуферона позволило объединить высокую иммунологическую активность ИФН-а2Ь (Intron-A; Schering Plough Corp., Kenilworth, NJ) с фармакокинетическими преимуществами альбумина (Fleer etf al, 1999). Альбуферон - белок с молекулярной массой около 85,7 кДа. К С-концу рекомбинантного альбумина с помощью методов генной инженерии "пришит" N-конец рекомбинантного ИФН-а2Ь (рис. 5). Альбуферон (ZALBIN), продуцируемый дрожжами Kluyveromyces lactis, в настоящее время проходит последние стадии клинических испытаний, которые продемонстрировали значительные его преимущества в сравнении с рекомбинантным ИФН-а2Ь (Chemmanur a. Wu, 2006; HGSI Press Release, 2009).
Формирование дисульфидиых связей и цис-транс-пептидилпролин изомеризация
Этот процесс является АТФ-зависимым и требует взаимодействия Каг2р с J доменом белка Sec63p, представителем Hsp40 семейства (Lyman a. Schekman, 1995). Каг2р совместно с Hsp40 шаперонами Scjlp и Jemlp обеспечивает корректный фолдинг белковой молекулы, начиная с момента присоединения корового комплекса [Glc3Man9GlcNAc2] и заканчивая транспортом гликопротеина в AT (Silberstein et al., 1998). У млекопитающих в работе ВІР также участвуют кошапероны: HSP40, который стимулирует АТФазную активность ВІР, и GrpE - участвует в АДФ/АТФ цикле (Dorner a. Kaufman, 1990). Были обнаружены координирующие взаимодействия шаперонов ВІР и Lhslp: Lhslp является фактором обмена нуклеотидов для ВІР, в свою очередь ВІР запускает АТФазную активность Lhslp (Steel et al., 2004). Частично свернутая полипептидная цепь может взаимодействовать с белками семейства HSP90, в частности GRP94. Белок GRP94 не имеет АТФазной активности (в отличие от цитозольного HSP90). Роль этого шаперона заключается в связывании не полностью свернутых белков с целью стабилизации и предотвращения их агрегации в ходе фолдинга другими шаперонами (Wandlinger et al., 2008). При этом сам GRP94 никак не влияет на третичную структуру белка, то есть является холдазой. Другая функция GRP94 заключается в связывании неправильно свернутых белков и направлении их по пути деградации (Курганов, 2002; Rosser et al., 2004; Strudwick a. Schroder, 2007). У млекопитающих следующим этапом, в котором полипептидная цепь принимает конечную третичную структуру, является фолдинг белка шаперонами группы лектинов. К ним относятся кальнексин, кальмегин и кальретикулин. Эти белки имеют глобулярный N-концевой олигосахарид связывающий домен и С-концевой Р-домен, выполняющий функцию шаперона (Strudwick a. Schroder, 2007). Кальнексин и кальмегин являются трансмембранными белками, в то время как кальретикулин находится в полости ЭПР в свободной форме. Как было сказано выше, многие белки котрансляционно гликозилируются в ЭПР. На первом этапе гликозилирования к аспарагину (в случае N гликозилирования) присоединяется олигосахаридный кор - [Glc3Man9GlcNAc2]. У млекопитающих после присоединения кора две терминальные глюкозы отщепляются а-глюкозидазами I и П. Кальнексин и кальретикулин обладают способностью связываться с такими моноглюкозилированными олигосахаридами. Отщепление третьей глюкозы а-глюкозидазой II стимулирует диссоциацию комплекса белок/кальнексин-кальретикулин. Присоединение УДФ-глюкозы ферментом УГГТ (УДФ-глюкоза:гликопротеин глюкозилтрансфераза) в случае неправильного свертывания белка (реглюкозилирование) стимулирует повторное сворачивание белка шаперонами [кальнексин-кальретикулин]. Цикл связывания и диссоциации шаперонов может повторяться несколько раз до тех пор, пока белок не примет "правильную" конформацию. Как оказалось, у дрожжей есть гомолог кальнексина Cnelp, но не обнаружен гомолог УГГТ (Xu et ah, 2004). Существует предположение, что лектины в этом случае функционируют как холдазы, т.е. непосредственно не изменяют третичной структуры белков, но предотвращают их агрегацию (Lederkremer а. Glickman, 2005; Ruddock a. Molinari, 2006). 1.5.3.2 Формирование дисульфидных связей и цис-транс-пептидилпролин изомеризация Реакции формирования и изомеризации дисульфидных связей катализируются обширным семейством протеиндисульфидизомераз - PDI. Замыкание -S-S-связей между цистеинами в белке сопровождается восстановлением -SH связей фермента и наоборот. У млекопитающих при формировании дисульфидных мостиков восстановительные эквиваленты передаются от PDI на систему ФАД зависимых вспомогательных белков: Erolp, EROl-La, ERO-lLp\ Erv2p. Конечным
При повышении в клетке концентрации активных форм кислорода (АФК), около 25% АФК нейтрализуется за счет эквивалентов, образующихся при замыкании дисульфидных связей белка. Это явление получило название оксидативный фолдинг белка (Tu a. Weissman, 2004; Haynes et al., 2004). В случае, если замыкание -S-S- связей произошло некорректно, PDI восстанавливает ошибочно связанные цистеины белка, а цикл формирования дисульфидных связей повторяется. Для поддержания пула восстановленной формы PDI клетка использует восстановительные эквиваленты глутатиона (рис. 136). Таким образом, процесс изомеризации дисульфидных связей не зависит от Егоір-оксидаз. Было обнаружено, что функции PDI не ограничиваются реакциями восстановления-окисления дисульфидных связей белка. Оказалось, что PDI может выступать в роли шаперона и участвовать в фолдинге белка в качестве холдазы или RedOx-регулируемой фолдазы (Tsai et al., 2001; Wilkinson a. Gilbert, 2004).
У дрожжей обнаружены три PDI - Pdilp, Euglp и Erolp, а также три PDI-подобных белка - Mpdlp, Mpd2p, Yia5p. Pdilp дрожжей, подобно ферментам млекопитающих, обладает дисульфидизомеразной и оксидоредуктазной активностями и содержит два каталитических тиоредоксиновых домена, а также домен, отвечающий за белок-белковые взаимодействия (Zapun et al., 1999; Frand a. Kaiser, 1999).
Известно, что пептидные связи белка планарны и реализуются в двух формах - цис- и транс- конфигураций. Транс-конфигурации энергетически выгоднее и поэтому в белках такие связи встречается в 1000 раз чаще. Однако если одной из аминокислот является пролин (Х-Рго), величины свободной энергии двух форм пептидной связи практически выравниваются (рис. 14).
Цис-$транс-изомеризация пептидной связи вблизи остатков пролина является медленным процессом, тормозящим переход белка в нативное состояние при складывании in vitro. В 1997 году были открыты ферменты, катализирующие медленную изомеризацию пептидных связей на участках Х-Pro как in vivo, так и in vitro. Эти ферменты, названные пептидилпролилизомеразами (PPI) были обнаружены во всех организмах, и представлены в ядре, ЭПР и цитоплазме (Мюльберг, 2004). Существует три семейства PPI: циклофиллины, РК506-связывающие белки (FKBP) и парвулины. Все эти белки выполняют ifuc-транс-изомеризацто пептидной связи по N-терминальной стороне остатков пролина (Hunter, 1998). В дрожжах есть 8 членов циклофиллинового семейства (CPR1-8) и 4 белка семейства FKBP (FPR1-4). У млекопитающих обнаружено 16 циклофиллинов, 6 FKBP и 1-2 парвулина (Hunter, 1998; Shaw, 2002; Мюльберг, 2004; Wang а. Heitman, 2005). РРІазьі могут также вовлекаться в сборку-разборку белковых комплексов, транспорт белков и регуляцию их активности, регулировать транскрипцию и сайленсинг некоторых генов (Shaw, 2002; Мюльбег, 2004).
Выделение фракции микросом и белков клеточной оболочки из клеток дрожжей P. pastoris
Для подтверждения того, что секретируемый белок размером 86 кДа является химерным белком Альбурономіб, мы проводили иммуноблоттинг с антителами к ИФН-а2 и HSA. Использование антител к ИФН-а2 объясняется тем, что аминокислотные последовательности и пространственная структура различных видов ИФН-a характеризуются значительной гомологией (Pestka, 2000). Поэтому моноклональные антитела, полученные в реакции иммунизации одним видом ИФН-a (например, ИФН-а2), могут связываться с эпитопами других видов интерферонов (ИФН-а 16, в частности). Результаты экспериментов приведены на рис. 25(6, в). Как видно из рисунка, белок с молекулярной массой 86 кДа из культуральной жидкости штамма GS115AbFN16, дает положительную реакцию с моноклональными антителами к ИФН-а2 и HSA.
Оценку количества секретируемого гетерологичного белка проводили по методу Брэдфорд, а также анализируя электрофореграммы с помощью компьютерной программы «ImageJ1.32» (URL: http://rsb.info.nih.gov/ij/). В качестве контроля использовали культуральную среду исходного штамма GS115 дрожжей P. pastoris. Мы проанализировали культуральную жидкость трансформантов и обнаружили, что количество секретируемого рекомбинантного белка было различным (рис. 26). По предварительным данным, полученные трансформанты секретировали в культуральную среду от 10 до 25 мг химерного белка на 1 литр культуральной жидкости. Для дальнейшей работы мы отобрали трансформант, синтезирующий максимальное количество Альбуронаїб. уровнем секреции Альбуронаїб. 1,2- маркеры молекулярной массы Таким образом, нами получен штамм дрожжей P. pastoris GS115AbFN16, который синтезирует и секретирует в культуральную среду химерный белок, состоящий из альфа 16-интерферона и альбумина человека. При сравнении кривых роста полученного штамма с исходным штаммом дрожжей, оказалось, что интеграция экспрессионнои кассеты в локус АОХ1 хромосомной ДНК не оказывает существенного влияния на параметры роста клеточной культуры (рис. 27). Кроме того, ПЦР-анализ хромосомной ДНК полученного штамма в течение 4 лет показал, что клетки сохраняют фенотип His+Muf и не теряют интегративную кассету при многократном пассировании. Таким образом, полученный нами штамм является жизнеспособным, стабильным и продуктивным, что делает возможным использование его в промышленном культивировании и выделении из его культуральной среды химерного белка Альбуронаїб. Одним из основных преимуществ систем экспрессии на основе P. pastoris является то, что рекомбинантные белки, секретируемые этими дрожжами, сохраняют свою нативную пространственную структуру и не оказываются 100 гипергликозилированными, как в случае использования секреторных продуцентов на основе S. cerevisiae (Macauley-Patrick et al., 2005). Известно, что нарушение процессов ко- и посттрансляционных модификаций белков в ходе их синтеза и секреции может привести к накоплению белка в клетке, заякориванию в мембранах (ЭПР, АГ, на поверхности клетки), агрегации и образованию "телец включения", что в конечном итоге будет служить сигналом для начала UPR и клеточной гибели (Schroder, 2007). Особенно сложно предугадать влияние синтеза химерных белков на метаболизм клетки-продуцента, поскольку природных аналогов этих молекул не существует. Велика вероятность того, что гибридный белок будет "неправильно" сложен, останется заякоренным в мембране или агрегирует. Поэтому при создании штаммов-продуцентов эукариотических гетерологичных белков, в особенности химерных молекул, необходимо изучить динамику синтеза и секреции рекомбинантного белка. Как уже упоминалось ранее, экспрессионная кассета, интегрированная в локус АОХ1 хромосомной ДНК штамма GS115AbFN16, сконструирована таким образом, что после трансляции мРНК на N-конце химерного белка находится последовательность, кодирующая MFal. Этот пептид служит сигналом транслокации белка в ЭПР, транспорта в АГ, к плазматической мембране и его секреции в культуральную среду. В ходе этого процесса MFal отщепляется от белка сигнальными пептидазами. Мы провели ряд экспериментов, целью которых было: 1)проследить секреторный путь химерного белка Альбуронаїб; 2)проверить, не накапливается ли белок в цитоплазме в случае не распознавания клеткой сигнала секреции; 3)проверить, не остается ли белок заякоренным на поверхности клетки; 4)определить оптимальную продолжительность индукции синтеза белка. Клетки дрожжей культивировали в среде BMG до стационарной фазы роста и переносили на среду ВММ. Через 4, 24 и 48 часов анализировали культуральную среду, белки клеточной оболочки и белки микросомальной фракции методом электрофореза в ПААГ с SDS и иммуноблоттинга с моноклональными антителами к ИФН-а2 (рис. 28). Мы показали, что химерный белок Альбуроніб появляется в культуральной жидкости и присутствует в микросомальной фракции через 24 часа после добавления метанола. Через 48 часов концентрация рекомбинантного белка возрастала в культуральной жидкости, а в микросомальной фракции присутствовали следовые количества, т. е. белок не задерживался в ЭПР. Среди белков клеточной оболочки рекомбинантный белок не был обнаружен. Таким образом, можно говорить о том, что экспрессия гетерологичного гена в дрожжах P. pastoris не оказывает влияния на механизмы транспорта и секреции белка в культуральную жидкость, что делает возможным дальнейшее использование этих дрожжей в качестве секреторных продуцентов гетерологичных белков.
Известно, что уровень продукции рекомбинантных белков зависит от условий культивирования штаммов-продуцентов. При использовании секреторных продуцентов также следует учитывать вероятность протеолиза синтезируемого белка за счет возможного присутствия в среде протеолитических ферментов. Поэтому особенно важным для изучения штаммов-продуцентов гетерологичных белков и использования их в практической деятельности является оптимизация процесса культивирования клеток, как на стадии роста, так и на стадии индукции синтеза белка. Мы изучили влияние температуры, состава и рН культуральной среды, аэрации, а также продолжительности периода индукции на продукцию химерного белка Альбуронаїб.
Влияние аэрации и способа культивирования на выход биомассы клеток и уровень синтеза белка
Первоначально химерный белок выделяли из культуральной среды по следующей схеме: ультрафильтрация - осаждение 75% сульфатом аммония - гель-фильтрация на Сефакриле S-200 - Псевдо-аффинная хроматография на голубой сефарозе (Cibacron F3GA) - Гель-фильтрация на Сефадексе G-25.
На первой стадии очистки белок концентрировали из культуральной среды ВММ методом ультрафильтрации, используя мембрану АР-0.3-15ПС ("Биотест", Кириши), которая позволяет отсекать вещества с молекулярной массой меньше 15 кДа, что позволило сконценрировать исходную культуральную жидкость в 10 раз и удаляли низкомолекулярные примеси. Для дальнейшей очистки и концентрирования рекомбинантного белка использовали различные методы осаждения. Известно, что при очистке альбумина из плазмы крови используют осаждение сульфатом аммония. При этом белок осаждается при 60% насыщении (Watanabe et al., 2001). Достоинством этого метода является то, что сульфат аммония может предотвращать расщепление белка протеолитическими ферментами. Поэтому осаждение сульфатом аммония было выбрано нами в качестве следующего этапа очистки и концентрирования Альбуронаїб. Белки, осажденные 75% сульфатом аммония, разделяли при помощи гель-фильтрации на Сефакриле S-200. Результаты фракционирования представлены на рис. 406.
Анализ фракций при помощи электрофореза в ПААГ показал, что во фракциях №35-45 содержится рекомбинантный белок Альбуроніб (рис. 40а, б). Гель-фильтрация на Сефакриле S-200 позволила нам избавиться от значительного количества примесных белков. Часть этих белков, возможно, является продуктами протеолиза альбуминовой составляющей химерного белка. Учитывая международные требования к очистке рекомбинантных белков, а именно то, что необходимым условием их применения является максимально возможная очистка препарата от примесных белков и нуклеиновых кислот клетки-хозяина (Steinberg a. Raso, 1998; Walsh, 2003), мы решили использовать дополнительные методы очистки. Известно, что альбумин специфично связывается с голубой сефарозой (Travis et ah, 1976; Leatherbarrow a. Peter, 1980; Watanabe et al., 2001; Altintas a. Denizli, 2006). Исходя из полученных нами данных, мы предполагали, что часть примесных белков культуральной среды штамма-продуцента могла являться продуктами протеолиза Альбуронаїб и, таким образом, иметь в своем составе фрагменты молекулы альбумина. Использование хроматографии на голубой сефарозе позволило бы избавиться от этих белков. Фракции №35-45 наносили на колонку с голубой сефарозой, уравновешенной 20 мМ натрий-ацетатным буфером рН 5,5. После промывки колонки тремя объемами стартового буфера проводили ступенчатую элюцию белков [200 мМ KSCN в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5], [500 мМ KSCN в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5] и [1М KSCN в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5]. Как видно из рисунка, большая часть примесных белков элюируется с колонки 200 мМ и 500 мМ роданистым калием, при этом Альбуроніб элюруется 1 М KSCN. Известно, что при низкой ионной силе и относительно низких значениях рН окрашенные адсорбенты являются катионообменниками (Скоупс, 1985). Поэтому для элюции некоторых белков с голубой сефарозы используют буферные растворы с щелочным значением рН. К тому же, высокая концентрация соли (1 М KSCN) может негативно сказаться на биологической активности белка. По этим причинам в дальнейшем вместо 1 М роданистого калия на последней ступени элюции мы использовали 50 мМ трис-HCl рН 8,5. В результате разработанной схемы концентрирования и очистки нам удалось получить препарат рекомбинантного химерного белка Альбуронаїб, содержание примесей в котором не превышает 10%. На всех этапах очистки определяли биологическую активность белка (табл. 3).
Мы обнаружили, что, несмотря на хороший выход белка при использовании голубой сефарозы в качестве последнего этапа очистки, удельная биологическая активность Альбуронаїб сильно падает. Снижение удельной биологической активности можно объяснить следующими причинами: - уменьшение количества примесных белков, которые являются продуктами протеолиза Альбуронаїб, но обладают при этом биологической активностью (что было показано ранее); - использование в ходе экспериментов "жестких" условий сорбции или элюции белка, что может привести к необратимому изменению его конформации и потере биологической активности; - агрегация белка, следствием которой также может быть снижение биологической активности.
