Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Механизм действия антимикробных пептидов. Образование трансмембранных пор 8
1.2. Биологическая активность фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae 14
1.3. Образование трансмембранных пор сирингомицином Е 17
1.4. Связь каналоформерной активности сирингомицина Е с его биологической активностью 19
1.5 Взаимодействие цитоскелета с цитоплазматической мембраной. Регуляция связывания актина 22
1.5.1. Взаимодействие актина с мембраной через актин-связывающие белки 27
1.5.2. Непосредственное взаимодействие актина с липидным бислоем.. 31
1.6. Влияние цитоскелета на ионный транспорт
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Материалы 35
2.2. Методы исследования 37
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Эффект G- и F-актина на проводимость токсин-модифицированных БЛМ 40
3.2. Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий в "эффекте актина" 50
3.3. Влияние заряженных полимеров на проводимость СМЕ-канала при цис-и транс-добавке 57
3.4. Кооперативная адсорбция на БЛМ соединений, увеличивающих каналоформерную активность СМЕ 67
3.5. Анализ процесса увеличения размеров агрегатов, образованных актином, ПЛТ или ПК 72
3.6. Заключение 79
Выводы 82
Приложение 83
Список литературы 85
- Биологическая активность фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae
- Взаимодействие цитоскелета с цитоплазматической мембраной. Регуляция связывания актина
- Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий в "эффекте актина"
- Кооперативная адсорбция на БЛМ соединений, увеличивающих каналоформерную активность СМЕ
Введение к работе
Актуальность исследования
Антимикробные пептиды природного и синтетического происхождения являются предметом многочисленных исследований, направленных на установление молекулярных механизмов их биологической активности (Zasloff, 2002). Модель взаимодействия пептида с клеткой-мишенью предполагает, что липиды внешнего монослоя цитоплазматической мембраны участвуют в образовании трансмембранных пор при встраивании пептида в мембрану. Активность многих пептидов зависит от заряда липидных молекул, их спонтанной кривизны, а также от наличия стеринов в составе мембраны, что определяет селективность их действия (Matsuzaki, 1999; Sobko et al., 2006). Типичным представителем антимикробных пептидов является группа фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae - сирингомицин E (СМЕ), сирингопептин 22А, сирингостатин А и сиринготоксин Б. Цитотоксичность вышеуказанных липодепсипетидов определяется их способностью образовывать ионные поры в плазматической мембране клеток-мишеней (Zhang and Takemoto, 1986; Hutchison et al., 1995; Carpaneto et al., 2002; Гурьнев и др., 2002a).
Использование бислойных липидных мембран (БЛМ) дает возможность моделировать плазматическую мембрану и изучать взаимодействия белков и пептидов с мембраной, а также ответить на вопрос о факторах, влияющих на биологическую активность экзогенных каналоформеров. Введение фитотоксина с одной (цис-) стороны бислойной липидной мембраны приводит к образованию ионных каналов (Feigin et al., 1996; Щагина и др., 1998). Каналы, образуемые фитотоксинами, характеризуются потенциал-зависимостью их открывания/закрывания, преимущественно анионной селективностью, зависимостью проводимости от липидного состава БЛМ и трансмембранной разности потенциалов (Щагина и др., 1998; Malev et al., 2002). Свойства каналов зависят от стеринового состава мембран, так в холестерин-содержащих бислоях
5 скорость формирования каналов, образованных сирингомицином Е (СМЕ-каналов), гораздо ниже, чем в мембранах, содержащих эргостерин (Feigin et al., 1997). Сравнение коэффициентов проницаемости модифицированных СМЕ эритроцитарных мембран и БЛМ для катионов при одинаковых молекулярных соотношениях токсин/липид показало, что ионная проницаемость эритроцитарных мембран существенно выше, чем БЛМ. Можно предположить, что, помимо липидного состава мембран, активность сирингомиципа Е определяется внутриклеточными структурами, например, элементами цитоскелета, взаимодействующего с мембраной. Известно, что функционирование многих ионных каналов клетки зависит от белков цитоскелета. Предварительные исследования показали, что мембранная активность сирингомиципа Е зависит от присутствия глобулярного актина с противоположной введению токсина стороны БЛМ (Gurnev et al., 2003).
В данной работе изучено влияние белков цитоскелета на мембранную активность сирингомиципа Е (СМЕ) и его аналогов. Данные, свидетельствующие о связи между динамическими перестройками цитоскелета и активностью ионных каналов в мембране, позволяют говорить о непосредственном участии белков цитоскелета в процессах ионного транспорта (Negulyaev et al., 2000; Staruschenko et al., 2005). Тем не менее, мало известно о возможности влияния внутриклеточных белков на функционирование экзогенных соединений, что определяет актуальность данного исследования.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы - установление механизма влияния белков цитоскелета на каналоформерную активность сирингомицина Е и его аналогов в бислойных липидных мембранах. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
1) исследовать изменение проводимости БЛМ, модифицированных сирингомицином Е и его аналогами, при введении в околомембранный раствор G- или F-актина, других белков цитоскелета, а также
синтетических полимеров, моделирующих различные участки белковых молекул;
2) провести сравнительный анализ характеристик ионных каналов,
образуемых токсином в отсутствие и в присутствии вышеуказанных белков
и полимеров;
3) изучить кинетику тока при различной последовательности введения СМЕ
и соединений, увеличивающих каналоформерную активность токсина, а
также зависимость трансмембранного тока от концентрации актина и
полимеров.
4) разработать теоретический подход, описывающий механизм сорбции
актина и синтетических полимеров на мембране.
Научная новизна
Впервые показано, что каналоформерная активность липодепсипептидов СМЕ, СП22А, ССА и СТБ в модельных липидных мембранах регулируется актином, но не альфа-актинином или винкулином - белками, также входящими в состав цитоскелета. Сорбция актина на бислойной липидной мембране имеет кооперативный характер и сопровождается образованием агрегатов сорбирующегося вещества, главным образом, за счет гидрофобных белок-липидных взаимодействий. Предложен механизм влияния актина на каналоформерную активность фитотоксинов, согласно которому агрегаты актина изменяют структуру мембраны, что приводит к увеличению числа предшественников фитотоксиновых каналов и (или) константы скорости их открывания. Данные, полученные в ходе работы, показывают, что биологическое действие липодепсипетидов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae, может регулироваться внутриклеточными компонентами клеток-мишеней.
Теоретическое и практическое значение
Полученные данные о влиянии актина на каналоформерную активность фитотоксинов в модельных мембранах развивают
7 представления о роли кортикального актина в регуляции активности ионных каналов и образовании экзогенными соединениями липидных пор в клеточных мембранах. Несомненную ценность представляют сведения о возможности непосредственного взаимодействия глобулярного и фибриллярного актина с мембраной. Показано, что амфифильные синтетические полимеры - полианион Кенига и полилизинтриптофан, могут быть использованы для тестирования вклада заряженных и гидрофобных групп белковых молекул при их взаимодействии с мембраной. Результаты, полученные в ходе исследования, показали, что актин формирует на мембране агрегаты, и способность к агрегации является необходимым условием влияния на активность СМЕ.
Биологическая активность фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae
Фитотоксины продуцируются патогенными микроорганизмами, которые поражают растения и вызывают заболевания клеток (Mittal et al., 1995; Barzic and Guittet, 1996). Вместе с тем, как грибковые, так и бактериальные патогенные микроорганизмы выделяют ряд вторичных метаболитов, токсичных для растений, но не участвующих в развитии заболеваний. В результате были выработаны критерии, определяющие участие токсинов в том или ином заболевании: 1) токсин должен вызывать те же симптомы заболевания, что и весь микроорганизм; 2) должна наблюдаться взаимосвязь концентрации токсина и его патогенности; 3) выработка токсина бактерией происходит при развитии заболевания; 4) отсутствие эффекта у нетоксичных штаммов (Bender et al., 1999).
Фитопатогенные бактерии Pseudomonas syringae {P. syringae) вызывают ряд заболеваний, приводящих к прекращению роста растений и их гибели. При проникновении клеток P. syringae в ткань растений, клетки-мишени подвергаются так называемому "гиперчувствительному отклику", который приводит к их некрозу в течение 12-24 часов. Набор генов, называемый hrp ("hypersensitive response and pathogenicity") областью, содержащийся в фитопатогенных прокариотах, влияет на способность бактерий вызывать "гиперчувствительный отклик" в клетках-мишенях, способность к их росту и размножению внутри или на поверхности растений (Gopalan and Не, 1996). Hrp область ответственна за выработку бактерией фитотоксинов и является причиной патогенности P. syringae по отношению к клеткам растений (Gross, 1991).
Токсины, продуцируемые патогенными бактериями, могут быть специфичными и обладать той же специфичностью, что и сами микроорганизмы, или неспецифичными и быть токсичными по отношении к более широкому спектру растений. Большинство токсинов, продуцируемых P. syringae, являются неспецифичными, и вызывают заболевания, не наблюдаемые при действии самой бактерии. Эти фитотоксины вызывают хлороз (коронатин, фазеолотоксин и табтоксин) или некроз (сирингомицин и сирингопептин) тканей растений. Токсины, выделяемые P. syringae, ответственны за соматическое движение бактерии в растениях (Patil et al., 1974), повреждение тканей и размножение бактерий (Bender et al., 1991). Токсины различаются по структуре и включают в себя Р-лактаны (табтоксин), сульфодиаминофосфинилпептиды (фазеолотоксин), липодепсинанопептиды (сирингомицин) и другие соединения (Mitchell, 1991). Синтез фитотоксинов осуществляется с помощью мультиферментных систем с молекулярной массой от 100 до 1600 кДа и не связан с рибосомальным аппаратом клетки (Grgurina, Mariotti, 1997; Guenzi etal., 1998). Сирингомицины являются типичными представителями класса циклических липодепсинанопетидов, которые состоят из полярной пептидной "головы" и гидрофобного хвоста 3-гидрокси жирной кислоты (Fukuchi et al., 1992) (Рис. 4). Существуют три формы сирингомицинов, которые различаются между собой только длиной хвоста состоящего из остатка декановой, додекановой или тетрадекановой кислоты для сирингомицина А1, сирингомицина Е или сирингомицина G, соответственно. Сирингомицины имеют амфифилыгую структуру, характерную для антимикробных пептидов, взаимодействующих с мембранами клеток-мишеней. Амидная связь соединяет жирнокислотный остаток с N-концом серина, который в свою очередь связан С-концом с 4 хлортреонином, таким образом, замыкая аминокислоты в кольцо. Наличие атома хлора в молекуле сирингомицина важно для его биологической активности (Grgurina et al., 1994). Другой отличительной чертой сирингомицинов является наличие в их составе нестандартных аминокислот: 2,3-дегидроаминомасляной кислоты, 3 гидроксиаспарагиновой кислоты, 4-хлортреонина, 2,4-диаминомасляной кислоты и D-изомера серина (Scaloni et al., 1994). Молекулы сирингомицинов содержат три положительно заряженных (два Dab, один Arg) и один отрицательно заряженный аминокислотный остаток (Asp(3-ОН)), что определяет суммарный заряд молекул равный 2 положительным эл. зарядам при значениях рН, близких к нейтральным. Сирингомицины выделяются большинством штаммов P. syringae pv. syringae. Родственными липодепсинанопептидами являются сиринготоксины, сирингостатины и псевдомицины (рис. 4). Несмотря на некоторые структурные различия, липодепсипептиды проявляют схожую биологическую активность, и любая форма сирингомицина вызывает некроз тканей растений (Backman and DeVay, 1971; Sorensen et al., 1996). В присутствии СМЕ происходит увеличение скорости ионных потоков через мембраны клеток растений и дрожжей. Наблюдается выход 45Са из протопластов (Hutchison and Gross, 1997), увеличение транспорта Ca и H в клетках свеклы и дрожжевых клетках. В последнем случае также наблюдался рост потока К+ через мембрану (Zhang and Takemoto, 1989; Takemoto, 1992). Кроме того, СМЕ вызывает изменение активности Н+-АТФ-азы и кальциевых насосов (Bidwai et al., 1987; Reidl and Takemoto, 1987 Camoni et al., 1995; Hutchison et al., 1995). Еще одним процессом, наблюдаемым в присутствии СМЕ, является фосфорилирование/дефосфорилирование мембранных белков, среди которых находится Н+-АТФ-аза (Bidwai and Takemoto, 1987). Вышеперечисленные данные позволяют предполагать, что плазматическая мембрана клеток-мишеней является объектом действия сирингомицина Е.
Активность сирингомицина Е и родственных ему соединений была также обнаружена по отношению к патогенным для человека бактериям Mycobacterium smegmatis (Buber et al., 2002). To обстоятельство, что фитотоксины значительно менее активны в отношении клеток млекопитающих по сравнению с грибковыми клетками, позволяет рассматривать их в качестве перспективных фармакологических препаратов (Sorensen et al., 1996; Lavermicocca et al., 1997; Buber et al., 2002).
Взаимодействие цитоскелета с цитоплазматической мембраной. Регуляция связывания актина
Белки семейства ERM (эзрин, радиксин и моэзин) содержат консервативный N-концевой мембрано-связывающий домен - FERM (4.1-эзрин-радиксин-моэзин) домен (Hamada et al., 2000; Smith et al., 2003). Этот домен является связующим звеном в белок-белковых и белок-липидных взаимодействиях в плазматической мембране. Белки ERM также содержат F-актин-связывающие домены на С-конце и таким образом способны связывать актиновые филаменты с мембраной, непосредственно с PIPs и с цитоплазматическими доменами трансмембранных белков (Bretscher et al., 2002).
Функционирование ERM белков непосредственно связано с PIPs. Сайт-специфический мутагенез эзрина и анализ кристаллов комплекса FERM домена с PIPs показал, что положительно заряженные остатки, находящиеся на поверхности FERM домена, взаимодействуют с PIPs (Barret et al., 2000; Hamada et al., 2000; Niggli, 2001). В отсутствие сигнала ERM белки находятся в неактивной конформации. Внутримолекулярное взаимодействие между N-концевым и С-концевым доменами ингибирует мембрано- и актин-связывающие домены (Bretscher et al., 2002; Hoeflich et al., 2003). Предполагается, что связывание белка с PIPs вызывает разобщение С- и N-доменов и таким образом, активацию белка. Фивэ с сотрудниками (Fievet et al., 2004) исследовали сигнал-зависимую активацию эзрина в клетках. Из эпителиальных клеток был выделен эзрин дикого типа и мутантный эзрин, у которого лизин 253, 254, 262 и 263 заменен на аспарагин. По сравнению с эзрином дикого типа, мутантный эзрин не локализовался на микроворсинках и не находился в составе цитоскелета. Тем не менее, обнаружено, что PIPs не принимали участия в локализации эзрина на мембране, поскольку N-концевой домен как дикой, так и мутантной форм связывался с мембраной. Поэтому предполагается, что взаимодействие с PIPs является необходимым условием фосфорилирования, а не локализации белка на мембраны.
Винкулин - белок, связывающий F-актин и ряд других белков, таких как альфа-актинин и талин с липидным бислоем, имеет N-концевой домен размером около 80 ADH молекулярной массой в 95 кДа ("голову") и С-концевой домен ("хвост", остатки 879-1066). Винкулин способен регулировать клеточную адгезию и образование выпячиваний на мембране путем сборки актина на фокальных контактах (DeMali, 2004). В хвостовом домене винкулина находятся сайты связывания с отрицательно заряженными фосфолипидами, актином и паксилином, а головной домен взаимодействует с талином и а-актинином. Также как и в случае эзрина, головной и хвостовой домены винкулина способны взаимодействовать между собой и скрывать сайты связывания. Это внутримолекулярное взаимодействием может быть нарушено при взаимодействии с PIPs, которое приводит к активации лиганд-связывающих сайтов.
Кристаллическая структура молекулы винкулина с разрешением в 3.1 А была получена в работе (Bakolitsa et al., 2004). Молекула этого белка имеет форму пучка спиралей с общим размером 100 100 50 AD Хвостовой домен этой молекулы имеет длину 60 A О диаметр 20-30 А Пи состоит из пяти амфифильных спиралей, соединенных короткими петлями, что располагает гидрофобные участки внутри пучка спиралей. С-концевой домен заканчивается гидрофобной "шпилькой" (остатки 1062-1066) (Bakolitsa et al,. 1999). На основании полученной структуры и результатов сайт-специфического мутагенеза винкулина был предложен многоступенчатый механизм взаимодействия винкулина с липидным бислоем, в котором задействованы два положительно заряженных участка (Н2 и НЗ домены) и вышеупомянутая гидрофобная шпилька (Johnson et al., 1998). После электростатического взаимодействия винкулина с отрицательно заряженным фосфатидилсерином, шпилька встраивается в бислой и приводит к разворачиванию пучка спиралей и ассоциации спиралей Н2 и НЗ с бислоем. Предполагается, что в случае винкулина фосфатидилсерин играет роль белок-связывающего липида, a PIPs -активирующих липидов. Активация винкулина происходит при его пространственной солокализации с липидами и другими связывающими белками. Взаимодействие интактного винкулина с PIPs разъединяет N- и С-домены, что позволяет этому белку взаимодействовать с актиновыми филаментами и осуществлять их связывание с мембраной клетки.
Талин играет важную роль в активации трансмембранного белка интегрина (Cram and Schwarzbauer, 2004). Считается, что талин разъединяет а- и /?-субъединицы интегрина и таким образом активирует рецепторы адгезии в молекуле интегрина. In vitro показано, что в присутствии Р1-4,5-Р2 талин подвергается конформационным изменениям, которые усиливают его взаимодействие с интегрином (Martel et al., 2001). Стержневидный "хвост" талина (массой 190 кДа) взаимодействует с винкулином и F-актином (Lee et al., 2004). Глобулярная "голова" молекулы талина массой 47 кДа обладает некоторой гомологичностью с FERM-доменом семейства ERM и содержит сайты связывания с PIPs, киназой фокальной адгезии, интегрином и изоформой I фосфатидилинозитол-4-Р-5-киназы у (PIPKIy). Показано, что амфифильная область молекулы талина (остатки 385-406) встраивается в липидный бислой и образует а-спираль в мембране, схожую по структуре с таковой в хвосте винкулина (Seelig et al., 2000). Так же как в случае эзрина и винкулина, PIPs активируют молекулу талина. Взаимодействие талина с мембраной является весьма сложным многостадийным процессом, точная схема которого не выяснена до конца. Тем не менее, на основании имеющихся экспериментальных данных были предложены следующие основные стадии: 1) образование комплекса талина и PIPKIy; 2) фосфорилирование PIPKIy и активация киназы фокальной адгезии, что приводит к увеличению синтеза Р1-4,5-Р2; 3) распад комплекса талин- PIPKIy, активация талина за счет Р1-4,5-Р2 и взаимодействие талина с интегрином, приводящее к образованию стабильного комплекса талина-интегрином; 4) взаимодействие талина с актиновым филаментом.
Белок аннексии способен взаимодействовать с F-актином и таким образом действовать как линкерный белок, связывающий актин с мембраной, Для аннексинов также характерным является кальций-зависимое связывание с отрицательно заряженными фосфолипидами. Аннексии 2 локализуется на ранних эндосомах и фагосомах, участвует в эндосомальном транспорте и модуляции функционирования липидных рафтов (Babiychuk and Draeger, 2000; Gerke and Moss, 2002). Для данного белка показано селективное связывание с Р1-4,5-Р2 по сравнению с Р1-3,4,5-Рз и Р1-3,4-Р2. Это связывание может происходить в отсутствие ионов кальция, но в их присутствии скорость процесса существенно возрастает. Перераспределение аннексина на мембране при ее динамических перестройках в присутствии ионов кальция и PIPs способно влиять на распределение F-актина на поверхности клеточной MeM6paHbi(Rescher et al., 2004). Суммируя представленные данные, следует сказать, что PIPs играют ключевую роль в активации белков цитоскелета, которая позволяет этим белкам взаимодействовать с мембранными липидами и выполнять функцию промежуточного звена в связывании актиновых филаментов с клеточной мембраной.
Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий в "эффекте актина"
Сорбция актина может быть результатом электростатических и (или) гидрофобных взаимодействий между белком и мембраной, т.е. взаимодействий между заряженными группами сорбирующихся молекул и "головами" липидов и/или гидрофобными группами молекул белка и жирнокислотной областью мембраны (St-Onge and Gicquaud, 1990; Bouchard et al., 1998). Рост проводимости СМЕ-модифицированной мембраны при wpawc-добавке актина к незаряженной (ФХ) или заряженной (ФС/ФЭ) мембране, омываемой 1 М NaCl (см. рис. 15 В), говорит об участии гидрофобных белок-липидных взаимодействий в "эффекте актина", поскольку в этих системах электростатические взаимодействия существенно снижены. Однако такие эксперименты не позволяют уяснить роль электростатических взаимодействий в "эффекте актина" в заряженных мембранах при низкой ионной силе омывающего раствора. Применение синтетических полимеров, моделирующих различные участки молекулы актина, позволяет изучить взаимодействия, лежащие в основе наблюдаемого "эффекта актина". Для этого использовали поликатион полилизин (ПЛ), полианион полиглутаминовую кислоту (ПГ) и амфифильные заряженные соединения: полианион Кенига (ПК) и поликатион, сополимер лизина и триптофана (ПЛТ).
Введение поликатиона ПЛ, в раствор, окружающий отрицательно заряженные (ФС/ФЭ) мембраны, должно приводить к нейтрализации заряда мембраны за счет электростатического притяжения между ПЛ и ФС. Известно, что переход от отрицательно заряженных к незаряженным мембранам сопровождается уменьшением каналоформерной активности СМЕ (Гурьнев и др., 2002b, 2003). Ответственным за этот эффект, видимо, является /Я/7Ш/ОМ0Н0СЛ0Й мембраны, поскольку экранирование его заряда высокой концентрацией NaCl (1 М) вызывает уменьшение числа СМЕ-каналов, в то время как экранирование заряда z/ис-монослоя не сказывается на каналоформерной активности токсина (Schagina et al., 2003). Аналогичный эффект наблюдается и при введении ПЛ: транс-добавка приводит к значительному уменьшению трансмембранного тока (рис. 17), а z/ис-добавка ПЛ не изменяет проводимость СМЕ-модифицированной мембраны. Относительно ПГ известно, что этот полимер не взаимодействует с отрицательно заряженными и незаряженными мембранами (Chang and Chan, 1974). Действительно, введение полианиона ПГ с цис- или транс-столоны ФС/ФЭ-мембраны (0.1 М NaCl) не вызывало изменения каналоформерной активности СМЕ. Влияние амфифильных полиионов (ПЛТ и полианиона Кенига), содержащих в своем составе гидрофобные группы, на проводимость СМЕ-модифицированных ФС/ФЭ-мембран (0.1 М NaCl) оказалось качественно совпадающим с "эффектом актина" (рис. 18): увеличение трансмембранного тока при транс-добавке ПЛТ или ПК и отсутствие влияния этих полимеров при z/ис-добавке (Гурьнев и др., 2003, Бессонов и др., 2006). Поскольку ПЛ и ПГ не вызывают увеличения проводимости модифицированных СМЕ мембран, наблюдаемый "эффект актина" при транс-добавке ПЛТ или ПК, скорее всего, относится к наличию в составе этих полимеров гидрофобных групп, которые могут участвовать в сорбции амфифильных полимеров на мембране и приводить к изменению активности СМЕ.
Дополнительным подтверждением этого предположения является рост проводимости мембран при транс-добавке ПЛТ или ПК к ФС/ФЭ-мембранам, омываемым 1 М или 4М NaCl (рН 6), т.е. в условиях существенного экранирования зарядов мембраны и полимеров (рис. 19). Далее в параграфе 3.3. мы также покажем возможность сорбции на отрицательно заряженной мембране амфифилыюго полианиона ПК. Поскольку, как и в случае актина, введение ПК и ПЛТ в отсутствие СМЕ не вызывало изменения проводимости БЛМ, то влияние транс-добавки этих полимеров можно связать с увеличением числа функционирующих СМЕ-каналов. В параграфе 3.3 приведены доказательства отсутствия иных, кроме СМЕ-каналов, путей транспорта ионов через мембраны при введении указанных полимеров в околомембранные растворы, хотя при этом и происходят некоторые изменения проводимости одиночных каналов.
Как и в случае актина, при введении СМЕ после завершения сорбции ПЛТ или ПК на транс-монослое, достижение плато происходит за время, равное таковому в отсутствие полимеров (рис. 20). В этих условиях величина константы скорости закрывания канала р также не изменялась (р = 0.27±0.03 мин 1) (вставка к рис. 20), что является подтверждением роста числа функционирующих СМЕ-каналов при транс-добавке ПЛТ или ПК за счет увеличения эффективной концентрации предшественника, Npr (Бессонов и др., 2006).
Таким образом, результаты исследования транс-добавок ПЛ, ПГ, ПЛТ и ПК показывают, что "эффект актина" наблюдается только в случае ПЛТ и ПК, т.е. полимеров, имеющих в своем составе гидрофобные группы. Это позволяет считать, что сорбция актина и рост числа СМЕ-каналов связаны с наличием гидрофобных участков в молекуле актина и, как следствие, с гидрофобными белок-липидными взаимодействиями. В то же время, исследование эффекта транс-добавки других белков цитоскелета, х-актинина и винкулина, для которых предполагается взаимодействие с мембраной in vivo и in vitro через гидрофобные белок-липидные взаимодействия, не выявило увеличения каналоформерной активности СМЕ (Niggli et al., 1986; Han et al., 1997; Goldmann et al., 1999).
Кооперативная адсорбция на БЛМ соединений, увеличивающих каналоформерную активность СМЕ
Более того, уменьшения асимметрии кривых (и одновременного увеличения проводимости канала) можно достичь за счет снижения отрицательного поверхностного заряда только т/?дяс-монослоя мембраны, не меняя заряд ее z/иостороны, т. к. возникновение барьера Wmax(V=0) обязано, в основном, увеличению энергии проникающих анионов в канале за счет их кулоновских взаимодействий с одноименно заряженными липидными молекулами, расположенными, в основном, в транс-устье канала. Нейтрализация отрицательного заряда транс-иоиослоя ФС/ФЭ-мембран в результате введения ПЛ или ПЛТ увеличивает проводимость каналов по сравнению с таковой в их отсутствие (рис. 22, кривые 4, 5 и 1). В качестве примера на вставке к рис. 22 приведены записи флуктуации токов, протекающих через одиночные каналы, при V = 100 мВ для модифицированных СМЕ ФС/ФЭ-мембран в отсутствие (А) и в присутствии ПЛ с транс-стороны мембраны (Б). Меньшее в случае ПЛТ по сравнению с ПЛ изменение G, вероятно, обусловлено более низкой плотностью зарядов на молекуле ПЛТ, поскольку концентрации ПЛ и ПЛТ в экспериментах не отличались (1 мкг/мл). Уменьшение отрицательного заряда z/ис-монослоя не должно оказывать существенного влияния на проводимость канала, так как энергия анионов на г/иостороне канала определяется, главным образом, положительно заряженными молекулами каналоформера, следствием чего является наличие достаточно глубокого минимума на кривых 1, 2, 3 рис. 21. Это и наблюдается в экспериментах, результаты которых представлены на рис. 22 для ФС/ФЭ-мембран в отсутствие полиионов и при нейтрализации заряда их z/wc-монослоя ПЛ и ПЛТ (кривые 1 и 3).
Исходя из приведенных на рис. 21 схематических кривых потенциальной энергии проникающих анионов, увеличение отрицательного поверхностного заряда транс-иопоспоя мембраны (увеличение барьера Wmax(V=0)) должно приводить к уменьшению проводимости СМЕ-канала при положительных V, а увеличение отрицательного поверхностного потенциала г/иомонослоя мембраны не должно существенно изменять проводимость канала. Асимметрия G-V кривой в первом случае обязана увеличиваться по сравнению с кривой, наблюдаемой до увеличения заряда транс-мопослоя, в то время как во втором она должна оставаться практически неизменной. Для проверки этих предположений было изучено влияние односторонних добавок ПК к незаряженным мембранам на G-V характеристики СМЕ-каналов. К сожалению, не представилось возможным измерить проводимость одиночных каналов в незаряженных мембранах после введения ПК в wpawc-отделение камеры, поэтому проводили анализ Gy ofGy 0 для макроскопических токов через мембрану. Поскольку общий трансмембранный ток является суммой токов, протекающих через одиночные СМЕ-каналы, и число последних в условиях быстрой смены знака V не изменяется, то абсолютное значение отношения трансмембранных токов при разных полярностях V должно быть равно отношению проводимостей одиночных каналов при этих V. На рис. 23 приведены примеры записи трансмембранных токов при изменении знака V для модифицированных СМЕ незаряженных (ФХ) мембран в присутствии (А) и отсутствие (Б) ПК в растворе, омывающем /я/?ш/с-монослой мембраны. Из рисунка видно, что после переключения полярности с -100 на 100 мВ в ФХ мембранах с отрицательным поверхностным зарядом на транс-монослое (трш/с-заряженные мембраны) значения тока при V 0 по абсолютной величине больше, чем при V 0 (рис. 23 А), т.е. Gy olGy o 1. Для симметричных незаряженных мембран это отношение меньше единицы (рис. 23 Б). Таким образом, можно заключить, что увеличение поверхностного заряда тракс-монослоя ФХ мембран вызывает изменение характеристик СМЕ-индуцированной проводимости мембран. Поэтому на рис. 24 экспериментальные результаты для транс-заряженных ФХ-мембран представлены в виде отношений проводимостей (GVKOIGVX)) мембран при отрицательных и положительных V от абсолютного значения трансмембранного потенциала \V\ (кривая 1), а соответствующие кривые в симметрично заряженных (кривые 2, 3) и незаряженных (кривая 4) мембранах в виде отношения проводимостей одиночных СМЕ-каналов, Gy olGy o. Из кривых, представленных на рис. 24, видно, что для транс-заряженных мембран величина Gy o/Gy o l (кривая 1), как и для для симметрично заряженных ФС-мембран Gy olGv o 1 (кривая 2). В мембранах, содержащих 20 мол % заряженного фосфолипида (ФС), Gv olGv o =1, т.е. G-Vкривые симметричны (кривая 3) (Schagina et al., 2003), а для симметричных незаряженных мембран это отношение меньше единицы (кривая 4). Таким образом, создание отрицательного поверхностного заряда на транс-монослое незаряженной мембраны приводит к изменению асимметрии G-V кривых СМЕ-каналов. Наблюдаемые значения Gy 0/Gy o l для СМЕ-каналов в транс-заряженных (ФХ) и в симметрично заряженных ФС мембранах (рис. 24, кривая 1 и 2) говорят о том, что заряд транс-монослоя определяет асимметрию G-V кривых СМЕ-каналов, как это следует из приведенных выше теоретических соображений. Большие значения отношений Gy olGv o для асимметрично заряженных мембран в сравнении с симметрично заряженными мембранами можно отнести за счет большей плотности поверхностного заряда, создаваемого ПК на незаряженной мембране, по сравнению с плотностью заряда в монослоях мембран из ФС.
Флуктуации одиночных СМЕ-каналов в присутствии ПК со стороны транс-монослоя были зарегистрированы в мембранах, сформированных из смеси липидов (ФС/ФЭ). Влияние ПК на проводимость одиночных СМЕ-каналов в этой системе иллюстрирует рис. 25. Приведенные на этом рисунке результаты показывают, что в ФС/ФЭ-мембранах, в присутствии ПК с транс-стороны проводимость СМЕ-каналов отличается от таковой в отсутствие ПК (кривая 2) и близка к проводимости в мембранах, сформированных только из заряженного липида ФС (кривая 1). Это различие позволяет полагать, что ПК увеличивает отрицательный поверхностный заряд транс-монослоя ФС/ФЭ мембраны, а, следовательно, и величину тах( = 0) (рис. 21), приближая ее к таковой в ФС-мембранах.
