Введение к работе
Актуальность темы, Б ответ на гипертермию и некоторые другие формы Физиологического стресса, в клетках начинает транскрибироваться определенный набор іемов. кодирующих так называемые "белки теплового шока" CDTUP. Функции этих белков до конца еще не изучены, однако показано, что они участвует б процессах ренатурации и/или солюбмлизации денатурированных белков CLinaqiust. 1966; Віспг. .і Pel ham. 1937.), защищая теп самым клетку от неблагоприятных последствий сті-есса CJakobsen & Pelham. 1983).
Возможность индукции транскг-инции генов БТШ у зукаг-иот
определяется наличием специфически:-: последовательностей ЛНК
HSE Cheat-shock elements) в пропоторной области генов ns[>
Cheat-shock protein). HSE представляет собой инвертирован
ные повторы длиной 5 пар оснований nGAfln и найдены как у
низших CS\ cerevisiAC~> так и у высших СP;'oscptiila~> зукаї-иот
СВіепг .Я Pelham. 1982; Amin et al. . 1988). НЕЕ служат специ
фическими сайтами связывания для ядерного белка H3F
Cheat-shock transcriptional factor) с нолєкулярннм весом
120-140 кДа CSorger X Pelham, 1987). который б сбою очєрєдь.
взаимодействуя с транскрипционным аппаратом, меняет уровень
транскрипции генов hsp.
На сегодняшний день, гены H3F выделены из S. cerevjviae CSorger & Pelham. 1988), К. lactis CJakobsen -Я Pelham. 1991), ProsophiiA i'CIos et al. , 1990). человека С P.at-inclran et al. . 1991), мыши CSarge et al. . 1991), томатов fScharf et al., 1990). У дрожжей HSF представлен одной копией гена на геном, тогда как у человека, мышей и растений томата существует несколько копий С Lis & U'u, 1993). Этот Факт может обуславливать наблюдаемые функциональные различия между молекулами HSF из разных организмов. Несмотря на высокую степень гетерогенности на аминокислотном уровне. найдено несколько функциональных доменов: ДНК-связмвающий домен, тримє-ризационный и активирующие, котрые отличаются высокой консервативностью аминокислотного состава и позволяют отнести HSF к классу белков-активаторов транскрипции. HSF синтезируется в клетке постоянно, так как показано, что индукция транскрипции генов hsp не блокируется ингибиторами белкового синтеза CSimarino 5 Ш, 1987), но специфически активируется лишь в результате определенных форм стресса. Более того, известно, что существуют как минимум два механизма регуляции активности H3F. У позвоночных и дрозофиллы молекулы HSF б нормальных условиях существуют б виде мономеров не способных связываться с ДНК. однако под воздействием тепло-
вого стресса они образуют тримеры. связываются с ДНК и активируют транскрипцию генов hsp (Kingston et al.. 1987: Sorger et al.. 1987). У дрожжей. напротив. HSF постоянно существует в виде тримера, связанного с ДНК. но приобретает способность существенно активировать транскрипцию лишь в момент теплового шока, претерпевая, по-видимому, некие конфор-мационные изменения CJakobsen S Pelham. 1988). В связи с этим, особый интерес представляет собой исследование структурной организации белковой молекулы HSF дрожжей и выяснение роли отдельных ее элементов в процессе регуляции активации транскрипции.
Цели и задачи исследования. Целью предлагаемой работы являлось изучение различных структурных элементов молекулы HSF и выяснение их роли в процессах активации и инактивации транскрипции генов hsp. В соответствии с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Создать серию делеций генов HSF из дрожжей А'. lactis и S. cerei'lslae. кодирующих С-кониевые фрагменты белковой молекулы HSF. с последующим определением их способности активировать транскрипцию с тестерной плазмиды. несущей ген в-галактозидазы. для того, чтобы локализовать месторасположение непосредственно С-концевого транскрипционного активатора в молекуле HSF.
2. Исследовать интрамолекулярные взаимодействия между
отдельными доменами HSF с помощью ди-гибридного метода
CFields. 1988) и их роль в регуляции активности HSF.
3. Изучить влияние Фосфорилирования на изменение конфор-
мации молекулы HSF. а также Физиологическую роль этого про
цесса в момент перехода HSF в активное состояние путем ана
лиза различных мутантов методом гель-ретардации и измере
ния их транскрипционной активности.
Научная новизна и научно-практическая ценность работы. Работа содержит новые данные, касающиеся структурных особенностей транскрипционного активатора белковой природы HSF и механизма его регуляции в процессе теплового шока.
Впервые нами было точно определено расположение аминокислотной последовательностей в белках HSF К. lactis (K1HSF) и S. cerevlslae CScHSF). обладающих высоким гз/?іг-активирую-щии потенциалом (способность к активации транскрипции даже в контексте чужеродного ДНК-связываюшего домена).
Тримеризационный домен HSF состоит из двух пространственных спиральных структур. носящих название лейциновые затворы ( leucine zippers). Причеп лейциновый зат-
вор А (расположен ближе к N-концу) необходим для олигомери-зации. в то время как более дистально расположенный затвор В паскирует оба (слабый N-концевой и потный располагающийся в С-хонце молекулы) транскрипционных активатора, которыми обладает HSF.
Показано, что существует два типа активности HSF (идуци-бельный и конститутивный), которые определяются взаимодействием между разными функциональными доменами молекулы HSF: состояние N-концевого активатора определяет индуцибельную активацию транскрипции при кратковременной тепловом шоке. конститутивная же осуществляется за счет С-концевого активатора и необходима для выживания при длительном тепловом стрессе.
Выяснена роль ФосФорилирования цепи аминокислотных остатков серина. 'прилегающих к СЕ2 (conservative element), который располагается между С- и N-кониами. Мошлое ФосФорили-рование. сопутствующее активации HSF, давало основания предполагать, что ФосФорилирование может инициировать активацию HSF. либо поддерживать его в активном состоянии (Sorger. 1991). Нам же удалось впервые показать. что фосфорилирова-ние. напротив, связано с инактивацией молекулы HSF. возггох-но. за счет привлечения шаперонных hsp. которые, как показано, участвуют в негативной регуляции активности HSF (Mosser et al. , 1993).
Полученные данные углубляют наше понимание механизмов регуляции активации HSF и позволяют предложить модель функционирования HSF при тепловом шоке.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме "Organization and Regulation of Genes" (Aarhus. Дания. 1992). на семинарах в Институте цитологии РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи
Объем работы. Диссертация изложена на По стр. машино-печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащих 22,^ названий. Работа иллюстрирована 3 рисунками и J таблицами.
