Введение к работе
Актуальность проблемы.
Стремительный прогресс в изучении молекулярных механизмов канцеро-1 енеза в последние десятилетия связан с открытием большой группы генов, которые были объединены под общим названием протоонкогенов. Бьио показано, что в нормальных клетках они участвуют в регуляции клеточной пролиферации на всех уровнях передачи митогегшых сигналов: от рецепторов и сигнальных белков внутриклеточных сигнальных каскадов (протеинкиназы sre, raf, mos, erb-B) до ядерных транскрипционных факторов (rel, fos, jun). Мутации в нротонкогенах превращают их в онкогены, что, как правило, нарушает строгую регуляцию передачи митогагаьгх сигналов. Именно это свойство лежит в основе автономной пролиферации опухолевых клеток.
Открытие метода переноса генов в клетки эукариот позволило получить ряд новых данных о молекулярных механизмах канцерогенеза и идентифицировать клеточные мишени, поражение которых необходимо для трансформации клеток. В частности было показано, что введение ядерного онкогена Е1А аденовируса 5 типа нарушает строгий контроль за прохождением клеток по циклу путем инактивации продуктов генов опухолевых супрессоров (Weinberg, 1991) и изменения активности ряда транскрипционных факторов (АР-1, ATF-2), регулирующих продвижение клетки по клеточному циклу (Hagmeyer, 1993). Для полной клеточной трансформации необходимо введение комплементирующего онкогена, например Ras (Ruley, 1983). Один из наиболее часто мутирующих в человеческих опухолях генов - протоонкоген cHa-ras активирует МАР-киназные каскады, имитируя действие ростовьк факторов (Campbell, 1998). Единичные аминокислотные замены в 12, 13 и 61 положениях приводят к появлению постоянно активированных онкогенных форм Ras белков. Экспрессия такой формы Ras ведет к конститутивной активации митогенных каскадов независимо от экзогенных ростовых факторов, что, по-видимому, лежит в основе неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Конечной целью сигнальных путей являются транскрипционные факторы, участвующие в регуляции клеточной пролиферации, например, с-Jun, Elk-1, р53, ATF-2 и др. (Garrington and Johnson, 1999).
Недавно появились данные, демонстрирующие участие протоонкогенов семейства Rel, кодирующих транскрипционный фактор NF-кВ, в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза, а также их роль в неопластической трансформации клеток in vitro и in vivo (Sonenshein, 1997; Gilmore et al, 1996).
Например, транслокация и амплификация генов, кодирующих Rel/NF-кВ и их ингибиторов, наблюдается в 20-25% случаев лимфоидных опухолей человека. Также было показано, что активация NF-kB является необходимым условием клеточной трансформации мышиных эмбриональных фибробластов NIH3T3 онкогеном сНа-Ras (Baltimore, 1997). В связи с этим, детальное исследование закономерностей регуляции транскрипционных факторов семейства Rel в нормальных и трансформированных клетках представляется весьма актуальным для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе клеточной трансформации и ivi-ііцсрогенеза.
Цели и задачи исследования.
Основной целью данной работы было исследование регуляции активности транскрипционных факторов семейства Rel/NF-кВ в эмбриональных фибробластах крысы (REF), трансформированных парой комплементирующих онкогенов F.lA+cHa-ras.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ ДНК-связывающей и транс-активирующей
активности NF-kB, а также состава комплексов NF-kB и их внутриклеточной
локализации в нормальных фибробластах и трансформантах.
2. Исследовать различные уровни регуляции активности NF-KJB/Rel в
трансформантах El A+cHa-ras.
3. Исследовать изменения активности основных сигнальных путей, вовлеченных в
регуляцию NF-kB, происходящих при трансформации нормальных фибробластов
онкогенами ElA+cHa-ras.
Научная новизна полученных результатов.
Работа содержит ряд новых данных о регуляции активности транскрипционного комплекса NF-kB в клетках REF, трансформированнных парой комплементирующих онкогенов ElA+cHa-ras. Впервые показано, что трансформация нарушает негативную авторегуляцию NF-kB, что приводит к конститутивно-высокой ДНК-связывающей активности NF-kB и его постоянной --ері'ой локализации. Несмотря на это, ростовые факторы сыворотки способны
з регулировать транс-активирующий потенциал p65/NF-KB. Впервые проведен сравнительный анализ активности основных МЛР-киназных путей в нормальных и трансформированных онокогенами ElA+cHa-ras фибробластах. Базальный уровень активности МАР-киназных каскадов, тестируемый по трансактивации факторов Elk-1 и Jim, значительно выше в трансформантах ElA+cHa-ras даже в условиях сывороточного голодания.
Теоретическое и практическое значение работы.
Получены новые данные о регуляции активности и внутриклеточной локализации транскрипционного фактора NF-KB/Rel при трансформации клеток RBF, которые углубляют представления о молекулярных механизмах процесса превращения нормальных клеток в опухолевые.
Новые экспериментальные данные, полученные в работе, могут быть основой для дальнейших экспериментов по выяснению причинно-следственных отношений между поведением основных МАР-киназных путей, регуляцией активности NF-кВ и процессом трансформации клетки.
Материалы работы могут быть использованы в курсе лекций по клеточной биологии и канцерогенезу в высших учебных заведениях с биологической и медицинской специализацией.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 4 работы. Материалы диссертации были представлены на IV Международной конференции "Life and Death of the Cell" (1996, Эдинбург), на Всероссийской Конференции "Биология клетки в культуре" (1999, Сглшт-Пстербург), а также на научных семинарах Отдела клеточных культур и лаборатории Молекулярных основ дифференцировки клеток Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации.
