Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 2. Обзор литературы
2.1. Общая характеристика фенотипа трансформированных клеток 7
2.2. Аденовирусный онкоген Е1А: структура и клеточные функции 14
2.2.1. Мишени белка El А - регуляторы клеточного цикла 18
2.2.2. Е1А в регуляции транскрипции на уровне модуляции активности хроматина 21
2.2.3. Транскрипционный фактор API как мишень онкобелка Е1А 22
2.2.4. Цитоплазматические мишени El А 24
2.2.5. Е1А как «опухолевый супрессор» 26
2.2.6. Индукция апоптоза белком Е1А: секвестрирование р53 27
2.3. Клеточные функции белка Е1В-19кДа 29
2.4. Функции белка Ras в проведении сигнала и трансформации клеток...32
2.5. Регуляция клеточного цикла 36
2.5.1. Комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами как ключевые регуляторы прохождения клетки по циклу 38
2.5.2. Белки семейства ретинобластомы - негативные регуляторы перехода G1/S 50
2.6. Транскрипционный фактор API 54
2.6.1. Структура и регуляция активности cJun 55
2.6.2. cJun в пролиферации 58
2.6.3. cJun в трансформации и опухолевой прогрессии клеток 59
2.6.4. cJun как регулятор апоптоза 60
2.7. Стресс киназы семейства JNK 62
2.7.1. Регуляция активности киназ JNK 63
2.7.2. JNK как регулятор транскрипционного фактора API 66
2.7.3. Роль JNK в пролиферации и опухолевой прогрессии. 67
2.8. Малые ГТФазы семейства Rho 68
2.8.1. Роль Rho ГТФаз в реорганизации цитоскелета и трансформации клеток 71
2.8.2. Роль белков Rho в регуляции транскрипции генов и пролиферации 73
ГЛАВА 3. Материал и методы
3.1. Клеточные линии и их культивирование, получение стабильных трансформантов, временные трансфекции 74
3.2. Анализ клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии.. 75
3.3. Конструирование плазмид 75
3.4. Иммуноблотинг и иммунопреципитация 76
3.5. Анализ киназной активности in vitro 77
3.6. Метаболическое мечение 77
3.7. Оценка люциферазной активности для тестирования активации JNK/cJun пути 78
3.8. Оценка роста клеток в полужидком агаре 79
3.9. Оценка апоптотической гибели клеток методом фрагментации ДНК..79
3.10. Кривая роста 80
3.11. Ядерно-цитоплазматическое фракционирование клеток 80
3.12. Оценка активности малой ГТФазы Cdc42 81
ГЛАВА 4. Результаты
4.1. Влияние онкобелка Е1А на активность JNK/cJun пути 81
4.1.1. Описание эстрадиол-индуцибельных ДНК-конструкций, кодирующих онкобелок El А 82
4.1.2. Е1А временно активирует киназу JNK 84
4.1.3. Е1А активирует транскрипционный фактор cJun за счет активации киназы JNK 86
4.1.4. Е1А активирует киназу JNK в цитоплазме 88
4.1.5. Активация JNK/cJun пути онкобелком Е1А опосредована активацией Cdc42->MEKK1->MKK4,7 сигнального каскада 92
4.1.6. Анализ функционирования JNK/cJun пути у El А- экспрессирующих трансформантов 95
4.2. Исследование способности Е1А-экспрессирующих трансформантов регулировать прохождение по клеточному циклу 101
4.2.1. Характеристика Е1 А-экспрессирующих трансформантов 101
4.2.2. Анализ содержания циклинов и киназ Gl-фазы и формирование их комплексов после облучения 109
4.2.3. Анализ функционирования ингибитора p21/Wafl у Е1А-экспрессирующих трансформантов после облучения 112
4.2.4. Анализ активности циклин-зависимых киназ после облучения 116
4.2.5. Роль фосфорилирования в регуляции функционирования циклин-зависимых киназ у Е1 А-трансформантов 118
4.2.6. Состояние фосфорилирования белков семейства pRb у El А- трансформантов 122
ГЛВАВА 5. Обсуждение результатов 125
Заключение 152
Выводы 154
Список работ, опубликованных по теме диссертации 155
Список цитированной литературы 157
- Комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами как ключевые регуляторы прохождения клетки по циклу
- Роль Rho ГТФаз в реорганизации цитоскелета и трансформации клеток
- Описание эстрадиол-индуцибельных ДНК-конструкций, кодирующих онкобелок El А
- Анализ функционирования JNK/cJun пути у El А- экспрессирующих трансформантов
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы
Одним из основных направлений современной клеточной биологии является изучение молекулярных механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую. Значительный прогресс в исследовании молекулярных механизмов канцерогенеза связан с открытием группы генов, которые были названы протоонкогенами. В нормальных клетках они участвуют в регуляции клеточной пролиферации на всех уровнях передачи митогенных сигналов: от рецепторов и промежуточных белков сигнальных каскадов (ras, c-src) до ядерных транскрипционных факторов (с-тус, c-jun, c-fos). Другим достижением клеточной биологии стало открытие так называемых опухолевых супрессоров (р53, семейство pRb) -клеточных генов, инактивация которых резко увеличивает вероятность развития новообразований в связи с нарушением строгого контроля целостности генома. Большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров являются компонентами сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, целостность генома и дифференцировку. Превращение нормальных клеток в опухолевые является многоэтапным процессом, связанным с совместной активацией протоонкогенов и инактивацией опухолевых супрессоров, приводящих к приобретению клетками признаков неопластической трансформации: автономной пролиферации, отсутствия контактного ингибирования пролиферации и независимости роста клеток от субстрата, генетической нестабильности (Hanahan and Weinberg, 2000).
В случае вирус-индуцированной трансформации было показано, что продукты ранних генов ДНК-содержащих вирусов, в частности гена Е1А аденовирусов, взаимодействуют и изменяют активность многочисленных клеточных белков. Основными мишенями Е1А являются негативные регуляторы клеточного цикла, транскрипционные факторы и белки модуляторы активности хроматина, большинство из которых либо опухолевые супрессоры, либо протоонкогены. Е1А взаимодействует с опухолевыми супрессорами - белками семейства ретинобластомы (pRb), ингибиторами циклиновых киназ p21/Wafl и p27/Kip, инактивация которых достаточна для перехода клеток из фазы G1 в S. Е1А может напрямую влиять на транскрипционную программу клетки, изменяя cJun-зависимую транскрипцию генов. Известно, что транскрипционный фактор cJun необходим для пролиферации клеток, поэтому влияние Е1А на cJun может быть важным этапом Е1А-индуцированной трансформации. Менее изученным способом влияния Е1А на экспрессию генов является изменение активности хроматина за счет взаимодействия с белками рЗОО/СВР, PCAF и CtBP, модулирующими ацетилирование гистонов (Frisch and Mymryk, 2002). Белок El А имеет преимущественно ядерную локализацию и, соответственно, ядерные мишени. Однако ряд данных свидетельствует о наличии мишеней Е1А среди цитоплазматических белков, таких как RACK1, Ran и регуляторные субъединицы 26S протеасомы, что говорит в пользу возможного влияния Е1А на сигнальные компоненты клетки. Е1А является хорошо изученным и часто используемым онкогеном в работах по выяснению механизмов трансформации клеток. В итоге многочисленных исследований были картированы сайты взаимодействия онкобелка Е1А с клеточными белками-регуляторами пролиферации, а с помощью генетических подходов были выявлены районы, ответственные за иммортализацию и трансформацию клеток грызунов. Поиск мишеней онкобелка Е1А может служить перспективным направлением для выявления новых клеточных мишеней - потенциальных кандидатов на роль онкогенов или опухолевых супрессоров.
Известно, что введение гена Е1А в первичные клетки грызунов одновременно со стимуляцией пролиферации запускает программу апоптоза, и с низкой частотой Е1А иммортализует клетки грызунов. Поэтому для изучения первичного действия онкогена Е1А на клетку используют систему с его временной или индуцибельной экспрессией.
Другим перспективным подходом является получение трансформированных клеточных линий, в которых одновременно с геном Е1А экспрессируется второй «цитоплазматическии» онкоген с антиапоптотическими свойствами: такими онкогенами могут быть аденовирусный ген Е1В-19кДа или онкогенный cHa-Ras. Белки Е1В-19кДа и cHa-Ras существенно отличаются по действию на цитоплазматические сигнальные каскады, поэтому они могут модифицировать способность Е1А нарушать строгий контроль за регуляцией клеточного цикла и, соответственно, определять проявление признаков трансформированного фенотипа. В связи с этим изучение регуляции клеточного цикла в стабильных трансформантах Е1А+Е1В-19кДа и ElA+cHa-Ras является информативным подходом для выяснения механизмов трансформации клеток аденовирусным онкогеном El А.
1.2. Цель и задачи исследования
Целью работы являлось изучение первичного действия онкогена Е1А на клетки грызунов и его роль в регуляции клеточного цикла при трансформации клеток онкогеном Е1А в комплементации с геном Е1В-19кДа или cHa-Ras.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить механизм активации транскрипционного фактора cJun онкобелкомЕІА.
2. Изучить функционирование JNK/cJun пути в трансформантах, полученных из эмбриональных фибробластов крысы путем стабильной интеграции онкогена Е1А в комплементации с геном Е1В-19кДа или cHa-Ras. 3. Оценить различия в регуляции клеточного цикла у стабильных трансформантов, полученных переносом онкогенов Е1А+Е1В-19кДа и ElA+cHa-Ras.
4. Исследовать участие онкобелка Е1А в инактивации опухолевых супрессоров pRb и p21/Wafl и нарушении работы контрольных точек клеточного цикла у трансформантов Е1А+Е1В-19кДа и ElA+cHa-Ras после повреждения ДНК облучением.
Комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами как ключевые регуляторы прохождения клетки по циклу
Вероятность возникновения в одной клетке нескольких генетических изменений, приводящих одновременно к появлению всех признаков опухолевого фенотипа, очень низка. Однако частота генетических изменений резко повышается при нарушении работы систем, поддерживающих целостность генома. Поэтому мутации, ведущие к генетической нестабильности, также являются неотъемлемым этапом опухолевой прогрессии. Генетическая нестабильность опухолевых клеток базируется на уменьшении точности воспроизведения генетического материала, нарушении механизмов репарации ДНК и изменении регуляции клеточного цикла в поврежденных клетках. Это делает популяции опухолевых клеток высоко изменчивыми, создает основу для постоянного возникновения и отбора все более злокачественных вариантов. Главный хранитель целостности генома клеток является опухолевый супрессор р53, который в ответ на повреждение ДНК вызывает блок клеточного цикла с целью репарации ДНК или апоптоз в случае нерепарабельных повреждений. Функционирование р53-пути часто нарушается в клетках за счет мутаций гена р53, что повышает их генетическую нестабильность и дает возможность появлению новых мутаций. т.е. формировать новые кровеносные и лимфатические сосуды из эндотелиальных клеток существующих окружающих сосудов. В отличие от предыдущих описанных признаков, которые тестируются на культурах клеток, этот и последующие признаки присущи уже опухолевым клеткам, которые проявляют их в организме. Данный признак является необходимым условием для дальнейшего роста опухолевого узелка в организме до размеров большой опухоли. Т.е. проникновение в окружающие здоровые такни и последующее формирование вторичных очагов опухолевого роста - необходимые стадии прогрессии опухоли в организме.
Проблема изучения механизмов опухолевой трансформации клеток связана с поиском информативных модельных систем, использование которых позволило бы выяснить общие принципы и молекулярные основы неопластической трансформации. Удачным подходом является перенос уже охарактеризованных онкогенов в клетки с последующим анализом функциональных изменений на молекулярном и морфологическом уровне. Перспективной моделью для изучения молекулярных механизмов канцерогенеза являются эмбриональные клетки грызунов, которые приобретают способность к неограниченному размножению in vitro (или иммортализуются) введением одного онкогена и морфологически трансформируются введением пары комплементирующих онкогенов (Ruley, 1983). Известно, что для полной трансформации первичных клеток грызунов необходима комплементация онкогенов «ядерного» типа, продукты которых локализуются в ядре (с-тус, c-jun, c-fos, EJA, SV40-LT, Е7) и как правило являются транскрипционными факторами или в случае вирусных онкогенов действуют на уровне модуляции транскрипции генов, и «цитоплазматического» (c-ras, c-src, и вирусные Е1В, SV40-ST, Еб), с локализацией онкопродуктов в цитоплазме, которые действуют на уровне изменения верхних компонентов цепи передачи сигнала в клетке или в случае вирусных онкобелков - взаимодействуют с опухолевым супрессором р53, подавляя апоптоз. Для клеток человека процесс трансформации, как недавно было показано, требует введения третьего гена - гена теломеразы, что позволяет получать трансформанты с высокой частотой и стабильностью (Yang et al., 1999).
К числу иммортализующих генов относятся ранние районы ДНК-содержащих вирусов SV40, Polyoma, Papillomaviruses, Adenoviruses, которые кодируют онкобелки, стимулирующие клеточную пролиферацию. Эволюционно механизм трансформации клеток вирусами связан с необходимостью производить максимально большое количество вирусных потомков, что достигается путем стимуляции репликации ДНК и соответственно пролиферации вирус-инфицированных клеток. Стоит отметить, что иммортализующие гены ДНК-содержащих вирусов (SV40, Е1А, Е7) обладают консервативным сходством структуры, что проявляется в общих механизмах их действия на пролиферацию клеток. Использование таких генов при введении в первичные клетки грызунов представляется удобным способом для поиска белков-мишеней и соответственно механизмов, участвующих в трансформации клеток. В нашей работе мы использовали аденовирусный ген Е1А, подробная характеристика которому будет дана в следующей главе. 2.2. Аденовирусный онкоген Е1А: структура и клеточные функции.
Аденовирусы широко распространены среди людей и животных, являясь возбудителями респираторных, кишечных и глазных заболеваний. Поэтому громкой сенсацией стало открытие, сделанное Трентиным, Ябе и Тейлором (Trentin, 1962), об онкогенности некоторых аденовирусов человека (тип 12), которые вызывали опухоли при введении новорожденным хомячкам. Однако впоследствии было обнаружено, что высоко-онкогенные аденовирусы (тип 12), к которым не относится используемый в нашей работе аденовирус 5-го типа, способны индуцировать опухоли только у грызунов, но не у приматов и человека. Причина такой селективности аденовирусов до сих пор не ясна. Исследования трансформирующего действия аденовирусов привело к открытию экспрессирующегося с вирусного генома онкобелка Е1А, который стал неким молекулярным «зондом» для выяснения многих фундаментальных аспектов регуляции экспрессии генов, контроля за клеточным циклом и индукции апоптоза и как следствие трансформации клеток.
Аденовирусный геном содержит 4 типа районов, объединенные в группы по принципу времени экспрессии и функциям (Endter and Dobner, 2003) (рис. 1). В группу ранних генов входят гены Е1А и Е1В раннего района Е1, которые должны экспрессироваться в первую очередь после проникновения вируса в клетку, причем сначала экспрессируется ген Е1А (ген немедленной экспрессии), стимулируя репликативную программу инфицированной клетки, необходимую для транскрипции остальных аденовирусных генов, включая Е1В.
Роль Rho ГТФаз в реорганизации цитоскелета и трансформации клеток
Описание эстрадиол-индуцибельных ДНК-конструкций, кодирующих онкобелок El А
До настоящего времени данные о мишенях онкобелка Е1А свидетельствовали, что подавляющее большинство из них - ядерные белки. Анализ последовательности Е1А выявил на его С-конце классический сигнал ядерной локализации 239_Lys-Arg-Pro-Arg-Pro_243, причем было показано, что интактность Lys239/Arg243 необходима для полноценной локализации Е1А в ядре (Douglas and Quinlan, 1996). Однако в то же время обнаружено, что около 10-20% пула белков Е1А все-таки локализуется в цитоплазме. Показано также, что цитоплазматический Е1А преимущественно ацетилирован по лизину 239, что, вероятно, препятствует его ассоциации с импортином а и эффективному транспорту в ядро (Madison et al., 2002). Является ли ацетилирование Е1А необходимым условием его функционального удержания в цитоплазме или же наоборот неким сигналом к протеасомной деградации (Turnell et al., 2000) пока неясно. Но, тем не менее, были обнаружены функциональные мишени Е1А в цитоплазме. Одной из таких мишеней являются регуляторные субъединицы 19S протеасомы S2, S4 и S8, с которыми Е1А взаимодействует своим N-концевым участком (1-26 а.к.) как в ядре, так и в цитоплазме клеток (Turnell et al., 2000), что вызывает нарушение протеасомной деградации белков, в частности р53.
Другой мишенью онкобелка Е1А является белок RACK1, изначально описанный как рецептор для активированной протеин-киназы С (РКС), а затем охарактеризованный как адапторный белок, участвующий в "сборке" сигнальных комплексов, в состав которых входит в частности киназа cSrc, Р-субъединица интегринов, белки спектрин и динамин. Показано, что киназа cSrc, находясь в комплексе с белком RACK1, неактивна, и, предположительно, взаимодействие Е1А с белком RACK1 в перинуклеарном пространстве клеток отвлекает его из комплекса с cSrc, и как следствие активирует киназу cSrc и снимает RACK1 -индуцированный блок клеточного цикла (Chang et al., 1998; Severino et al., 2004). В экспериментах in vitro было показано, что за взаимодействие с RACK1 отвечает также N-концевой участок Е1А белка (2-36 а.к.). Таким образом, влияние Е1А на активность cSrc является одним из первых свидетельств цитоплазматических функций белка Е1А.
Другой мишенью Е1А, ассоциация с которой также может происходить в цитоплазме клетки, является малая ГТФаза Ran, регулирующая ядерно-цитоплазматический транспорт. Показано, что Е1А взаимодействует с Ran также через N-конец (1-36 а.к.). Взаимодействие Е1А с Ran ингибирует ее переход из GDP в GTP-связанное состояние, и как показано, следствием такого взаимодействия является амплификация центросом (De Luca et al., 2003). Подобная ассоциация с Ran выявлена также для других онкобелков ДНК-содержащих вирусов: Е7 и SV40 LT, поэтому этот аспект действия Е1А белка может быть общим способом, каким образом вирусные онкогены могут вызывать повышение генетической нестабильности при трансформации клеток.
Таким образом показано, что Е1А может функционировать как в ядре, так и в цитоплазме клетки, однако со всеми вышеперечисленными белками-мишенями Е1А взаимодействие выявляется либо в обоих компартментах клетки (ядро и цитоплазма), как это было показано для субъединиц протеасом, либо на границе цитоплазма/ядро (для RACK1, Ran). Никаких конкретных мишеней из сигнальных каскадов пока не выявлено, существуют только данные о непрямом влиянии Е1А на цитоплазматические киназы. Например, при экспрессии Е1А описаны активация киназы р38 и ингибирование киназы Akt (Liao and Hung, 2003), хотя другие работы свидетельствуют об обратном эффекте (Viniegra et al., 2002). Оба исследования связывают такой эффект Е1А на сигнальные каскады с повышением чувствительности к апоптозу при экспрессии Е1А. Таким образом, существуют предпосылки влияния Е1А на пути передачи сигнала в клетке, свидетельствуя о плейотропном механизме действии Е1А на клеточные процессы.
Аденовирусный ген Е1А принято классифицировать как онкоген, поскольку он иммортализует первичные клетки грызунов и трансформирует их в кооперации со вторым онкогеном Е1В или Ras. Однако парадоксальным оказалось, что Е1А ревертирует трансформированный фенотип опухолевых клеток человека и подавляет рост опухолевых клеточных линий (Frisch, 1991). На этом основании для гена Е1А было предложено использовать термин «опухолевый супрессор» или «анти-онкоген». Первые свидетельства анти-онкогенных свойств Е1А связаны с его способностью репрессировать транскрипцию генов, экспрессия которых необходима для развития опухолей. Показано, что Е1А репрессирует ген HER2/c-erB2/c-neu и соответственно подавляет опухолеродный потенциал /7Е&2-оверэкспрессирующих опухолей (Yu et al., 1991), а также репрессирует транскрипцию стромиелизина и коллагеназы IV (Offringa et al., 1988; 1990), что может подавлять миграционный свойства опухолевых клеток. Другим аргументом в пользу анти-онкогенных свойств Е1А является индукция апоптоза в случае его высокой экспрессии в различных опухолевых клеточных линиях, включая даже линии с мутированным р53. Как следствие онкоген Е1А пытаются использовать для лечения опухолей шеи и груди (Hung et al., 2000; Frisch and Mymryk, 2002).
Анализ функционирования JNK/cJun пути у El А- экспрессирующих трансформантов
Открытие генов ras, сделанное на ретровирусах с условно онкогенными свойствами (Sherwin et al., 1978), послужило одним из мощных факторов изучения роли сигнальных каскадов в трансформации клеток. Исследования опухолей человека показали, что протоонокген ras относится к числу наиболее часто мутирующих генов в процессе канцерогенеза (Thompson et al., 1998). В свою очередь, одновременно накапливались данные о независимости размножения опухолевых клеток от экзогенных ростовых факторов в клетках, содержащих мутантный белок Ras, что предполагало особую роль Ras в работе сигнальных каскадов. Белки Ras располагаются на внутренней поверхности плазматической мембраны и работают как молекулярные проводники сигналов от тирозин-киназных рецепторов на нижележащие мишени каскада цитоплазматических киназ. Затем сигнал передается в ядро на транскрипционные факторы клетки, регулирующие клеточную пролиферацию, дифференцировку, трансформацию и апоптоз. Биологическая активность белка Ras зависит от типа ассоциированных с ним гуаниновых нуклеотидов: ГДФ или ГТФ, и регулируется двумя типами клеточных белков. Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов GEFs (Guanine nucleotide exchange factors) - способствуют образованию активной ГТФ-связанной формы онкобелка, а белки, активирующие Ras-ГТФазную активность (GAPs), наоборот переводят Ras в неактивную ГДФ-связанную форму (Boguski and McCormick, 1993). Единичные аминокислотные замены в 12, 13 и61 положениях приводят к появлению мутантных форм белков Ras, нечувствительных к действию GAP (Singh et al., 1999) и преобладанию в клетке активных форм белка в виде комплексов Ras-ГТФ. Таким образом, собственно активация Ras при действии митогенного сигнала заключается в его переведении из неактивной Ras-ГДФ в активную Ras-ГТФ форму (Boguski and McCormick, 1993).
Принципиальным моментом в проведении сигнала с поверхности клетки является прямое физическое взаимодействие активированных Ras-продуктов с цитоплазматическими серин-треониновыми киназами Raf, которые в свою очередь активирует киназы МЕК1,2 и те далее фосфорилируют интегральные киназы Erkl,2. Одним из главных следствий активации киназ Erkl,2 в клетке является их транс локация в ядро и фосфорилирование МАР-зависимых транскрипционных факторов (Campbell et al., 1998), к числу которых относятся АР-1 и ETS. Активация этих транскрипционных факторов приводит к экспрессии гена циклима Д и, следовательно, активации комплексов CyclD-Cdk4,6 (Wilkinson and Millar, 2000). Кроме того, показано, что киназы Erkl,2 участвуют в индукции синтеза ингибитора p21/Wafl на ранних стадиях фазы G1, который в этом случае выступает как активатор комплексов CyclD-Cdk4,6, что в конечном итоге позволяет клетке входить в фазу синтеза ДНК (Cheng et al., 1999; Bottazzi et al., 1999). Кроме этого киназы Erkl, 2 участвуют в активации комплексов CyclE-Cdk2 за счет изменения фосфорилирования Cdk2 по Thrl60, непосредственной транслокации ее в ядро, и возможно, за счет индукции деградации ингибитора p27/Kip (Takuwa and Takuwa, 1997; Blanchard et al., 2000; Chiariello et al., 2000). Вместе взятые эти результаты поддерживают точку зрения, что Raf-MEK-Erk-каскад по-видимому, необходим и достаточен для осуществления отдельных функций белка Ras.
Raf-MEK-Erk-каскад является основной ветвью функционирования белка Ras, однако помимо влияния на Erk-киназный каскад, Ras активирует и два других представителя интегральных MAP киназ - стресс киназы JNK и р38. Интегральными киназы Erkl,2, JNK и р38 называются потому, что на них замыкаются все вышележащие цитоплазматические сигналы, идущие от мембранных рецепторов, а они в свою очередь фосфорилируют и активируют многочисленные транскрипционные факторы -cJun, ATF2, Ekll/TCF, MEF2A/C и другие (Shields et al., 2000). Однако активация JNK и p38 опосредуется в основном цепью передачи сигнала, идущую от активации Ras-белком киназы PI3K и далее на малые ГТФазы семейства Rho, а от них уже на вышележащие киназы для JNK и р38. Таким образом, Ras-сигнальный каскад представляет собой разветвленную сеть компонентов, участвующих во всех клеточных процессах: пролиферации, апоптозе, дифференцировке. На рисунке 4 приведена схема путей передачи сигнала от белка Ras до транскрипционных факторов.
Открытие роли белков Ras в передаче сигнала послужило в принципе простым объяснением того, как онкогенная, т.е. постоянно активированная, форма белка Ras делает пролиферацию трансформированных клеток независимой от ростовых факторов. Однако введение в нормальные клетки онкогенной формы Ras приводит к остановке клеточной пролиферации на стадии Gl (Sewing et al., 1997; McMahon and Woods, 2001) и индуцирует явления, напоминающие клеточное старение (Serrano et al., 1997; Zhu et al., 1998; Bringold and Serrano, 2000). Предположительно, такой ответ нормальной клетки на действие онкобелка Ras, также относится к числу защитных механизмов клетки от случайных мутаций в протоонкогенах. Считается, что Ras-индуцированное старение опосредовано параллельной активацией ARF-p53-pRb пути и ингибитора pl6/INK4 (Serrano et al., 1997). Показано также, что ключевую роль в Ras-опосредованном старении играет активация стресс-киназы р38, которая фосфорилирует и активирует как р16, так и р53 (Iwasa et al., 2003). Полная трансформация клеток онкогенной формой Ras, со снятием программы старения, возможна только при его кооперации с иммортализующими онкогенами Е1А, с-тус, Т-антигеном вируса SV40 или же при введении его в ARF-/- или р53-/- клетки (Kohl and Ruley, 1987; Hicks et al., 1991; McMahon and Woods, 2001).
