Свободные и мембраносвязанный мультферментные комплексы цикла Кальвина и регуляция их ферментативных активностей Бабаджанова Малика Пулатовна

Содержание к диссертации

Введение

1. Современные представления о надмолекулярной организации ферментов 22

1.1 Уровни структурной организации ферментов 22

1.2 Функциональные последствия объединения ферментов в надмолекулярные комплексы 25

1.3 Надмолекулярные комплексы ферментов цикла Кальвина 36

2. Материалы и методы 56

2.1 Объекты исследования 56

2.2 Методы исследования 56

2.2.1 Реактивы 56

2.2.2 Определение количественного содержания белка по методу Лоури 57

2.2.3 . Микроопределение белка с биуретовым реактивом 58

2.2.4 Определение неорганического фосфора 58

2.2.5 Определение активности рибозофосфатизомеразы 59

2.2.6 Определение фосфорибулокиназной активности 60

2.2.7 Определение карбоксилазной активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбокислазы/оксигеназы радиометрическим методом 61

2.2.8 Определение карбоксилазной активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы спектрофотометрическим методом 62

2.2.9 Определение оксигеназной активности рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы 62

2.2.10 Определение активности глицеральдегидфосфатдегидрогеназы 63

2.2.11 Синтез рибулозо-5-фосфата - субстрата фосфорибулокиназной реакции 64

2.2.12 Выделение и очистка свободного мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника 65

2.2.13 Выделение и очистка в денатурирующих условиях свободного мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника 70

2.2.14 Выделение и очистка мембраносвязанного мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника 74

2.2.15 Определение содержания рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы методом ракетного иммунофореза 77

2.2.16 Определение гомогенности ферментных препаратов и их молекулярной массы 77

2.2.17 Фракционирование мембран хлоропластов из листьев картофеля 79

2.2.18 Определение количества рибулозо-1.5-бисфосфаткарбокси-лазы/оксигеназы, ассоциированной с мембранами 81

2.2.19 Количественное определение содержания хлорофилла 81

2.2.20 Определение константы Михаэлиса 82

2.2.21 Определение коэффициента Хилла 82

2.2.22 Статистическая обработка данных

3. Ферментативные активности свободных мультиферментных комплексов цикла кальвина в онтогенезе растений хлопчатника 83

3.1 - Онтогенетические изменения ферментативных активностей свободного мультиферментного комплекса 84

3.2 Онтогенетические изменения ферментативных активностей свободного мультиферментного комплекса, выделенного в денатурирующих условиях 95

4. Мембраносвязанная рибулозо-1,5- яжгфосфаткарбоксилаза/оксигеназа листьев картофеля 108

4.1 Активность мембраносвязанной рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в процессе формирования системы внутренних мембран хлоропластов картофеля 110

4.2 Реконструкция in vitro мембраносвязанной рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы из мембран и свободной формы фермента 111

4.3 Содержание и активность свободной и мембраносвязанной риб; 1,5-бмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы листьев картофеля в связи с продуктивностью 122

5. Мембраносвязанныи мультиферментньш комплекс цикла кальвина из листьев хлопчатника 129

5.1 Определение гомогенности и молекулярной массы одновременно выделенных мультиферментных комплексов -свободного и мембраносвязанного 129

5.2 Сравнительные определения ферментативных активностей свободного и мембраносвязанного мультиферментных комплексов 137

5.3 Кинетическое поведение рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/ оксигеназы в свободном и мембраносвязанном мультиферментных комплексах 142

Заключение 152

• Функциональные последствия объединения ферментов в надмолекулярные комплексы
• Методы исследования
• Онтогенетические изменения ферментативных активностей свободного мультиферментного комплекса, выделенного в денатурирующих условиях
• Сравнительные определения ферментативных активностей свободного и мембраносвязанного мультиферментных комплексов

Введение к работе

Фотосинтез остается одной из приоритетных проблем науки, так как он играет ведущую роль в продукционном процессе растений. При переходе земледелия с экстенсивного типа на интенсивный, требующий глубоких знаний об эндогенных регуляторных системах растений, фундаментальные исследования молекулярных основ фотосинтеза являются важным условием выявления способов управления продукционным процессом (Ничипорович, 1956; 1967; 1982,1988; Насыров, 1975; 1982; 1982а; 1986,1989; Лайск, 1977; Оя, Лайск, 1988; Кээрберг, 1989; Кээрберг, Вийль, 1982; 1988; Мокроносов, 1981;1983;1988; Мокроносов, Гавриленко, 1992; Тарчевский, 1977).

Продуктивность фотосинтеза в очень большой степени определяется скоростью и особенностями ферментативных реакций темновой фиксации углекислоты. Для выявления механизмов регуляции скорости фотосинтетического метаболизма углерода необходимо глубокое изучение структурных и функциональных особенностей ферментов цикла Кальвина.

Активность рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы

(РБФКО, НФ 4.1.1.39) - ключевого фермента цикла Кальвина, считается
одним из важнейших ведущих механизмов, регулирующим интенсивность
фотосинтеза. Данное положение обосновано обширным

экспериментальным материалом. Между интенсивностью фотосинтеза и активностью РБФКО для листьев, находящихся на разных стадиях онтогенеза, в разных естественных и экспериментальных условиях, установлена положительная корреляция (Smillie,1962; Bjorkman, 1966; Андреева, Авдеева, 1970; Бабаджанова и др., 1971; 1971а; 19716; Бабаджанова, 1972; 1974; 1977; 1980; 1981; 1986; Бабаджанова, Доман, Русинова, 1978; Бабаджанова, Хасанов, 1980; Бабаджанова, Бакаева, Гиясов, 1985; Алиев и др., 1980; 1982; Мокроносов, 1981; Фархади и др., 1983; 1985; Фархади, 1987). Обнаружена также корреляция между активностью рибулозобмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в расчете на единицу площади листа и урожайностью (Peet et al., Murthy, Singh, 1979; Бабаджанова, Гиясов, 1984; Руке, 1985; Leach, 1985; Baer, Granni R., Schrader, 1985; Besford et al., 1985).

Однако, в настоящее время представление о существовании в клетке отдельных независимых ферментов сменяется осознанием надмолекулярной ферментной организации. В живой клетке каждый фермент есть часть мультиферментной системы, ответственной за

функционирование какого-либо метаболического пути, который в свою очередь входит в состав еще более крупных систем. Ассоциация ферментов одного или разных метаболических путей в различные формы надмолекулярной организации - мультиферментные ассоциаты, комплексы, конъюгаты, ансамбли адсорбционные и интегральные - дает им многие структурные и функциональные преимущества. Свободные формы ферментов и различные формы их надмолекулярной организации находятся в динамическом равновесии друг с другом, причем их соотношение зависит от вида организма, типа клетки и ее функционального состояния (Srere, 1985; 1987; 1990; Фридрих, 1986; Курганов, 1984; 1986; 1986а; 1992; Курганов и др., 1986; Любарев, Курганов, 1987; Margues et al., 1987; Капрельянц, 1988; Курганов, Любарев, 1989; 1991; Каган, 1989; Ермаков, 1993).

В клетках бактерий и животных надмолекулярная организация ферментов биосинтеза клеточных полимеров - нуклеиновых кислот, белка, гликогена - и ферментов метаболических путей деградации, таких, как гликолиз, цикл трикарбоновых кислот, окисление жирных кислот и др., исследуется в течение уже более 30 лет (Atkinson, 1970; Stadtman, 1970; Ginsburg, Stadtman, 1970; Reed, Cox, 1970: Calvo, Fink, 1971; Welch, 1977; Srere, 1987), и расшифровано кристаллическое строение двух

надмолекулярных белковых комплексов: триптофансинтазы (Hyde et al.,. 1988) и рибофлавинсинтазы (Ladenstein et al., 1988).

Предположения о способности ключевого фермента цикла Кальвина рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы образовывать комплекс с ферментами, поставляющими ему субстрат - рибозофосфатизомеразой (РФИ, НФ 5.3.1.6) и фосфорибулокиназой (ФРК, НФ 2.7.1.19), высказывались разными исследователями, начиная с 1961 года (Peterskofsky, Racker, 1961; Mendiola, Akazawa, 1964; Каримова (Бабаджанова) и др., 1967; McElroy et al., 1968; Rutner, 1970; Романова, 1973 и др.).

В пользу этого предположения свидетельствовали, например, такие
экспериментальные факты, установленные еще в 70-80-е годы
Бабаджановой и др., (Каримова и др., 1967; Бабаджанова и др., 1971; 1986),
как сопутствие рибозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы на
протяжении всех процедур очистки рибулозо-1,5-

бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы и способность препаратов РБФКО высокой степени очистки фиксировать углекислоту в присутствии рибозо-5-фосфата и АТФ.

Систематические глубокие исследования молекулярно-кинетических свойств рибозофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы и рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы из листьев арабидопсиса и

хлопчатника позволили Бабаджановой М.А. с сотрудниками установить кинетическую комплементарность этих ферментов и координированную регуляцию активности одними и теми же эффекторами, что указывало на объединение их в функциональный кластер (Бабаджанова, 1981; 1981а; 1990; 1990а; Бабаджанова и др., 1985; Бабаджанова, Бакаева, Бабаджанова, 1988; Бабаджанова, Бакаева, Алиев, 1989; 1990). Объединение этих ферментов в структурно-функциональный кластер было доказано выделением из листьев арабидопсиса и хлопчатника мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД, у которого были определены рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и рибулозобмсфос-фаткарбоксилазная активности (Бабаджанова, 1990а; Бабаджанова, Насыров, 1992).

Затем из листьев хлопчатника, гороха, пшеницы были выделены мультиферментные комплексы цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс: 180, 240, 400, 480 и 520 кД (Бакаева и др., 1993; 1993а; 19936; 1994; Бакаева, Лебедева, 1993; Мирзорахимов и др., 1994).

Полученные результаты давали основание считать, что мультиферментные комплексы цикла Кальвина существуют в различных формах - стабильных и динамических. Результаты кинетических исследований каждой ферментативной активности этих комплексов, свидетельствовали о проявлении диссоциативного механизма регуляции

активности последовательно действующих ферментов —

рибозофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы и рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Бакаева и др., 1994; Бабаджанова и др., 1996; Бабаджанова, 1996).

Из листьев классических энзимологических объектов шпината и гороха были также выделены мультиферментные комплексы цикла Кальвина с различным числом ферментов - от двух до восьми (Sainis, Harris, 1986; Sainis et al., 1989; Gontero et al., 1988; Persson and Johansson, 1989; Anderson etal, 1995).

Sainis, Harris (1986) из листьев гороха был выделен трехферментный комплекс с молекулярной массой 800-850 кД, состоявший из рибозофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы и рибулозобисфосфаткарбок-силазы/оксигеназы, а из листьев шпината — двухферментный комплекс, компонентами которого были ФРК и РБФКО (Sainis, Marriam, Harris, 1989).

Gontero et al. (1988) из листьев шпината был выделен функциональный комплекс с молекулярной массой 520-536 кД, состоявший из пяти ферментов - рибозофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы, рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, фосфоглицераткиназы (ФГК-аза, НФ 2.7.2.3) и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД, НФ 1.2.1.13).

Persson and Johansson (1989) из хлоропластов шпината выделили ассоциат шести ферментов цикла Кальвина - РБФКО, ФГК-азы,

триозофосфатизомеразы (НФ 5.3.1.1), ГАФД, альдолазы (4.1.2.13) и фруктозобмсфосфатазы (НФ 3.1.3.11).

Anderson et al., (1995) получен многокомпонентный комплекс, превращавший рибозо-5-фосфат во фруктозо-6-фосфат. Комплекс состоял из восьми ферментов цикла Кальвина: РФИ, ФРК, РБФКО, ФГК-азы, альдолазы (НФ 4.1.2.13), фруктозобмсфосфатазы (НФ 3.1.3.11), ГАФД и триозофосфатизомеразы (НФ 5.3.1.1).

До настоящего времени связь мультиферментных комплексов с тилакоидными мембранами показана только для хлоропластов шпината (Suss, Arcona, Manteufell, Adler, 1993) и фотосинтезирующей бактерии Chlamydomonas reinhardtii (Suss, Prokhorenko, Adler, 1995).

Но не проводилось комплексных исследований структурных и функциональных особенностей различных форм мультиферментных комплексов цикла Кальвина - свободных и мембраносвязанных, одновременно выделенных из одного и того же объекта.

Наличие в хлоропласте рибулозобмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в двух состояниях - свободном и связанном с мембранами, доказано многочисленными экспериментальными исследованиями (Howell, Mondrianakis, 1967; Raghavendra, Carillo, Vallejos, 1981; McNeil, Walker, 1981; Алиев, Васильева, Насыров, 1982; 1984; Mori, Tetzuko, Akazawa, 1984; Фархади, 1987; Adler, Arkona et al., 1993; Чугунова и др., 1993; Suss,

Prokhorenko, Adler, 1995). Однако оставалось невыясненным, когда происходит связывание свободной формы рибулозобисфосфаткарбоксила-зы/оксигеназы с мембранами - на ранних стадиях онтогенетического развития хлоропластов или же после завершения формирования его мембранной системы и какова функциональная роль связывания фермента с мембранами. Не было исследовано, как меняются в онтогенезе растений ферментативные активности различающихся по молекулярной массе мультиферментных комплексов цикла Кальвина и коррелируют ли они с онтогенетическими изменениями интенсивности фотосинтеза. Сравнительные исследования содержания и активности различных форм мультиферментных комплексов могут выявить механизмы регуляции активности ферментной системы цикла Кальвина и их физиологическую роль в фотосинтетическом метаболизме углерода.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось выделение свободных и мембраносвязанного мультиферментных комплексов цикла Кальвина из хлоропластов высших растений и изучение механизмов регуляции их ферментативных активностей.

Предполагалось исследовать в онтогенезе растений ферментативные активности различных мультиферментных комплексов цикла Кальвина, изучить активности мембраносвязанной рибулозобисфосфаткарбоксила-зы/оксигеназы в процессе формирования мембранной системы

хлоропластов, и в связи с различной продуктивностью растений. Разработать метод одновременного выделения из одной навески листьев свободного и мембраносвязанного мультиферментных комплексов, исследовать их структурно-функциональные особенности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

выделить различные формы свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев хлопчатника в онтогенезе растений;

определить у выделенных комплексов величины молекулярных масс и ферментативных активностей;

изучить активность мембраносвязанной РБФКО в процессе формирования системы внутренних мембран хлоропластов картофеля;

реконструировать in vitro мембраносвязанную РБФКО из мембран и свободной формы фермента;

изучить содержание и активность свободной и мембраносвязанной форм рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у различающихся по продуктивности линий картофеля;

разработать метод одновременного выделения свободного и мембраносвязанного мультиферментных комплексов цикла Кальвина из одной навески листьев хлопчатника;

определить величины молекулярных масс и ферментативных активностей выделенных мультиферментных комплексов;

исследовать кинетическое поведение рибулозобмсфосфаткарбоксила-зы/оксигеназы, встроенной в свободный и мембраносвязанный мультиферментные комплексы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые установлена зависимость от фазы развития растений величин ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов с молекулярными массами 520 и 240 кД. Онтогенетические изменения величин ферментативных активностей мультиферментных комплексов соответствовали изменениям интенсивности фотосинтеза на различных фазах развития растений хлопчатника. Полученные результаты свидетельствуют о том, что необходимое в фазах формирования репродуктивных органов увеличение интенсивности фотосинтеза обеспечивается возрастанием функциональной активности различных мультиферментных комплексов. Следовательно, функциональная активность мультиферментных комплексов является одним из ведущих факторов онтогенетического контроля фотосинтеза и эпигенеза.

Впервые осуществлена реконструкция in vitro мембраносвязанной РБФКО из первичных мембран и свободной формы фермента и доказано, что связывание свободной растворимой РБФКО происходит на ранних стадиях онтогенетического развития хлоропластов, а не после завершения формирования его мембранной системы. При этом обнаружено, что увеличение количества мембраносвязанной РБФКО в системе in vitro приводит к возрастанию карбоксилазной и ослаблению оксигеназной активности системы. Следовательно, связывание рибулозобмсфосфат-карбоксилазы/оксигеназы с мембранами является одним из важных механизмов усиления карбоксилазной функции фермента. Полученные данные являются доказательством мембранной регуляции обеих функций фермента и ее важной роли при различных физиологических состояниях растений.

Обнаружено, что высокопродуктивные линии картофеля превосходят низкопродуктивные по содержанию мембраносвязанной РБФКО, величинам удельной и общей карбоксилазной активности как свободной, так и мембраносвязанной форм фермента. Совокупность полученных результатов доказывает важную роль мембраносвязанной РБФКО в регуляции соотношения процессов фотосинтеза и фотодыхания, и, следовательно, в повышении продуктивности растений.

Разработан метод одновременного выделения из одной навески листьев различных форм мультиферментных комплексов цикла Кальвина — свободного и мембраносвязанного. Из листьев хлопчатника свободный мультиферментный комплекс имел молекулярную массу 520 кД, а мембраносвязанныи - 640 кД.

Впервые проведены сравнительные исследования величин
ферментативных активностей свободного и мембраносвязанного
мультиферментных комплексов: рибозофосфатизомеразной,

фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбоксилазной..

Мембраносвязанныи комплекс превосходил свободный по величинам молекулярной массы и всех ферментативных активностей, что может свидетельствовать и о различиях в составе комплексов, и о проявлении мембранного уровня регуляции функциональной активности мультиферментного комплекса как единого целого.

Результаты сравнительного исследования кинетических параметров рибулозобисфосфаткарбоксилазной реакции (Vmax, К_м) обоих комплексов свидетельствуют о решающей роли мембран в регуляции функциональной активности мультиферментного комплекса как единого целого.

Таким образом, полученные нами результаты экспериментальных исследований указывают на тесную взаимосвязь и взаимозависимость

ферментных систем ассимиляции углерода с состоянием мембранной системы хлоропласта.

На основании полученных нами новых экспериментальных данных (Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П., 2000; Алиев К.А., Бабаджанова М.А., Бабаджанова М.П., Давлятназарова З.Б., 2001; Бабаджанова МЛ, Бабаджанова М.А., Алиев К.А., 2002) значительно модифицирована предложенная ранее (Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А., Бабаджанова М.П., 1994; Бакаева, 1996) схема иерархии механизмов регуляции активности свободных ферментов цикла Кальвина и различных форм их надмолекулярной организации.

Результаты проведенных нами экспериментальных исследований могут быть использованы при решении ряда теоретических и практических задач физиологии и биохимии продукционного процесса растений, теоретических и прикладных аспектов энзимологии фотосинтеза, для развития теории ферментативного катализа.

Методы, разработанные при выполнении данной работы (выделение

ферментов в различных состояниях, выделение свободных мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, одновременное выделение свободного и мембраносвязанного мультиферментных комплексов и др.), являются принципиально новыми, и их применение может способствовать дальнейшему развитию исследований в области энзимологии фотосинтеза.

Полученные данные могут быть использованы для чтения лекций по общим курсам физиологии растений, биохимии, спецкурсов по фотосинтезу, энзимологии и экологии на биологических факультетах ВУЗов, а разработанные методы - при проведении различных лабораторных практикумов.

Положения, выносимые на защиту:

Образование различных по молекулярной массе и функциональной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина необходимо для тонкой и точной регуляции фотосинтетической ассимиляции углекислоты.

При постоянно изменяющихся условиях внешней и внутренней среды с помощью мультиферментных комплексов реализуются регуляторные механизмы более высоких уровней - механизмы слежения, которые осуществляются с большими скоростями, чем регуляторные механизмы поддержания гомеостаза, свойственные свободным формам ферментов. К числу важнейших механизмов слежения относятся диссоциативная и мембранная регуляция.

- И механизмы гомеостаза, и механизмы слежения находятся под
контролем генетической программы развития, в соответствии с которой
происходят онтогенетические изменения интенсивности фотосинтеза,
обеспечивающие ассимилятами эпигенетические процессы.

Г Л А В A 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НАДМОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ.

І.І.Уровни структурной организации ферментов.

Ферменты являются глобулярными белками. Как глобулярные белки ферменты бывают двух типов: мономерные и олигомерные.

Мономерные ферменты построены из одной полипептидной цепи, образующей одну глобулу. К таким простейшим ферментам относятся лизоцим, трипсин, рибонуклеаза. Иногда одна глобула может быть собрана из нескольких полипептидных цепей. Примером такого случая служит химотрипсин. Он синтезируется в виде одноцепочного химотрипсиногена, который после нескольких протеолитических расщеплений превращается в а-химотрипсин. В итоге молекула о> химотрипсина содержит три различных полипептида, собранных в одну глобулу (Фёршт, 1980; Ленинджер, 1985; Фридрих, 1986).

У мономерных ферментов выделяют следующие уровни структурной организации:

первичная структура - это последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи. В последовательности аминокислот содержится информация, определяющая конформацию белковой молекулы.

вторичная структура - это та или иная упорядоченная укладка полипептидной цепи, например, ос-спираль, (3- складчатая структура и J3-изгиб.

третичная структура - это общая трехмерная конформация полипептидной цепи, обусловленная последовательностью аминокислот в ней.

Большинство ферментов являются олигомерными.

Олигомерные ферменты построены из двух или более полипептидных цепей, каждая из которых уложена в отдельную глобулу, получившую название субъединицы.. Если фермент состоит из одинаковых идентичных субъединиц, то их называют протомерами.

Если фермент состоит из неодинаковых субъединиц, то они выполняют различные функции. Один тип субъединиц участвует в катализе, а другой тип выполняет, например, регуляторные функции.

Сложные ферменты - это ферменты, состоящие из неодинаковых субъединиц, осуществляющих различные функции.

К ферментам, состоящим из идентичных субъединиц или протомеров, относятся такие фотосинтетические ферменты, как рибозофосфатизомераза (Иванищев, Насыров, 1981; Бакаева, Бабаджанова, 1986; 1988; Бабаджанова, Бакаева, 1987) и фосфорибулокиназа (Wara-Aswapati et al., 1980; Raffer-Turner, 1984; Хасанов, 1985; Krieger, Miziorko, 1986; Бакаева, 1991).

К сложным ферментам относится ключевой фермент темновой фазы фотосинтеза рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилаза/оксигеназа. У высших растений фермент, как правило, состоит из 8 каталитических (L) и 8 регуляторных субъединиц (S) (Sugiyama et al., 1967, 1971; Rutner, Lane, 1967; Kawashima, 1969; Thompson, 1969; Эдварде, Уокер, 1986; Романова, 1991).

Олигомерные ферменты обладают четвертичной структурой.

Четвертичная структура — это способ ассоциации и расположения субъединиц, внутри олигомера ( Виноградова, 1978; Страйер, 1984) Ленинджер, 1985; Албертс Брей, Льюис, Рэфф, Роберте, Уотсон, 1986; Кретович, 1986).

Олигомеры с четным числом субъединиц распространены шире, чем с нечетным, хотя последние также встречаются (Фридрих, 1986).

При образовании четвертичной структуры повышается устойчивость ферментов к различным воздействиям, таким как, нагревание, денатурирующие агенты и протеолитические ферменты (Фридрих, 1986).

Посредством изменений четвертичной структуры регулируется активность ферментов, т.е. от взаимодействия субъединиц внутри олигомера зависит каталитическая активность. Регуляция ферментативной активности осуществляется также посредством ассоциации - диссоциации олигомера (Диксон, Уэбб, 1966; Курганов, 1978).

Надмолекулярная организация ферментов

Основной тенденцией развития современной энзимологии является переход от исследования изолированных ферментов к изучению их надмолекулярной организации и способов функционирования в клетке (Фридрих, 1986). К настоящему времени получено большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что в клетке ферменты функционируют в следующих основных формах:

Свободные ферменты

Формы надмолекулярной Нестабильные ассоциаты

организации ферментов 4<Т

Мультиферментные комплексы

Метаболоны Эти формы ферментов находятся в динамическом равновесии друг с другом, причем их соотношение зависит от вида организма, типа клетки и её функционального состояния (Srere, 1985; Фридрих, 1986; Курганов,

1986; 1986а; Курганов и др. 1986; Любарев, Курганов, 1987; Капрельянц. 1988; Курганов, Любарев, 1989; Каган, 1989; Ермаков, 1993).

Нестабильные ассоциаты - это временные комплексы из небольших групп ферментов, образующиеся в некоторых условиях для ускорения той или иной последовательности реакций или защиты функциональной системы от неблагоприятных воздействий.

Мультиферментные комплексы - это, как правило, мобильные комплексы ферментов, катализирующих последовательные реакции одной метаболической цепи.

Метаболоны — это мультиферментные комплексы, включающие ферменты общего метаболического пути, адсорбированные на субклеточных структурах или встроенные в них (Srere, 1985).

Фиксация мультиферментного комплекса на специфических якорных площадках клеточных структур означает его превращение в метаболой (Курганов, Любарев, 1989,1991)

Схематическое изображение уровней структурной организации ферментов приведено на рис. 1.1.

1.2. Функциональные последствия объединения ферментов в мультиферментные комплексы

Эффект сближения

При объединении ферментов в комплекс их активные центры окажутся в непосредственной близости. Сближенность активных центров открывает образуемому первым ферментом продукту легкий доступ ко второму ферменту и т.д.

В некоторых мультиферментных комплексах соединение, перемещающееся от одного фермента к другому, ковалентно связано с

Рис. 1.1. Уровни структурной организации ферментов. Каждый контур соответствует глобулярной единице, состоящей обычно не более, чем из одной полипептидной цепи. С и R обозначают соответственно каталитическую и регуляторную субъединицы. Еь Ег, и Ез - ферменты, катализирующие три последовательные стадии какого-либо метаболического пути. В мультиферментном конъюгате показано, что Еь Ег и Е₃ находятся в пределах одной полипептидной цепи (Фридрих, 1986)

самим комплексом. Для ковалентно связанных интермедиатов эффективность переноса их с одного фермента на другой достигает 100%, т.е. потери в таких мультиферментных комплексах отсутствуют.

В других мультиферментных комплексах метаболиты являются диффундирующими. Переходы от одного фермента к другому осуществляются в три стадии:

1. освобождение из активного центра фермента А;

2. точное попадание каждого продукта предшествующего фермента (А) к последующему ферменту (Б) и т.д.;

3) взаимодействие с активным центром фермента В.

Для того, чтобы интермедиат не покидал комплекс, а с высокой вероятностью связывался со следующим ферментом в цепи реакций, активные центры ферментов расположены определенным образом по отношению друг к другу. Таким способом достигается компартментация метаболита, часто называемая «эффектом направленного переноса» (Фридрих, 1986).

Защита метаболита и (или) клетки

Компартментация предохраняет метаболит от вредного воздействия ферментов и сокращает время его перехода от одного активного центра к другому, уменьшает вероятность его распада (например, в результате гидролиза), осуществляет минимизацию энергетических расходов. С другой стороны, некоторые метаболиты, например, альдегиды, токсичны для клетки, поэтому важно отделить их от других компонентов клетки.

Уменьшение времени перехода

Время перехода — это время переноса метаболита от одного активного центра к другому. При образовании мультиферментных комплексов активные центры ферментов оказываются сближенными, что приводит к значительному уменьшению времени перехода метаболитов, способствует их направленному переносу. При этом отпадает необходимость в полном уравновешивании продукта предыдущей реакции (субстрата последующей) с окружающей средой. В результате прямой передачи (туннелирования) продукта одной реакции на фермент, катализирующий следующую реакцию, снижается потребность в насыщающем количестве субстрата и ускоряется сам процесс переноса.

Сокращение времени превращения метаболитов увеличивает общую скорость метаболического процесса (Keleti, Ovadi, Batice, 1989).

Активация физиологических и подавление нежелательных реакций

При объединении ферментов в комплекс области, формирующие поверхности контактов этих ферментов, неизбежно меняются. При помощи таких контактов молекулы ферментов могут различным образом влиять друг на друга. Поскольку активные центры ферментов должны располагаться относительно друг друга исключительно точно, даже незначительные изменения структуры при взаимном приспособлении контактирующих поверхностей могут заметно отражаться на эффективности катализа. Взаимодействия между ферментами вызывают изменения их кинетических параметров - Vmax, Кщ. Это означает, что хотя каталитическая активность каждого фермента в отдельности может быть

небольшой, при образовании комплекса ферментов она увеличивается благодаря повышению Vmax, и (или) снижению К_т.

Таким образом, взаимодействия между ферментами приводят к «облегченному» катализу в результате изменения кинетического поведения взаимодействующих ферментов.

Многие ферменты способны катализировать кроме физиологических и другие побочные реакции. Поскольку агрегация ферментов активирует нормальный метаболизм, то тем самым предотвращаются нежелательные реакции из-за отсутствия соответствующих субстратов (Фридрих, 1986; Курганов, 1986; 1992; Ермаков, 1993).

Координированные регуляторыые эффекты

Координированная регуляция мультиферментных комплексов означает, что одна молекула эффектора влияет на несколько ферментов, изменяя их кинетические параметры - V_max, K_m. На рис. 1.2. показано действие эффектора на двухферментный комплекс.

Координированная регуляция может затрагивать и процессы, не относящиеся прямо к активности ферментов, а связанные с регуляцией их уровня, т.е. с кругооборотом ферментов. Например, для конъюгата агот, катализирующего последовательные реакции метаболического пути биосинтеза ароматических аминокислот у микроорганизмов и высших растений, было показано, что первый субстрат придает конъюгату повышенную устойчивость к протеолизу (Vitto, Gaertner, 1978). Очевидно, что в присутствии первого субстрата распад любого из ферментов в данной последовательности реакций приведет к нежелательным последствиям. Контроль деградации ферментов - это сложный процесс, происходящий в любой клетке. Кругооборот белков дает возможность перераспределять

Эффектор

_*7

^{р -*с}

_?

_Щ-1

Рис. 1.2. Координированные конформационные изменения, вызванные в двухферментном кластере эффектором, действующим на единственный аллостерический центр в первом ферменте (ei) (Фридрих, 1986)

строительный материал (в данном случае аминокислоты) в соответствии с нуждами клетки (Фридрих, 1986).

Роль мультиферментных комплексов в интеграции клеточного метаболизма

Регуляторные механизмы живой клетки можно разделить на две группы (Конев, 1979, Розен, 1969): регуляторные механизмы, направленные на поддержание концентраций ключевых метаболитов на постоянном уровне (механизмы поддержания клеточного гомеостаза), и регуляторные механизмы, воспроизводящие изменение некоторой величины, определяемой внешними условиями (механизмы слежения).

Без механизмов поддержания гомеостаза невозможно само существование клетки как единой, организованной системы.

Механизмы слежения занимают более высокое положение на иерархической лестнице уровней контроля клеточного метаболизма по сравнению с механизмами регуляции гомеостаза.

Поддержание концентраций ключевых метаболитов на постоянном уровне (поддержание клеточного гомеостаза) осуществляется с помощью изостерических и аллостерических механизмов регуляции.

Сборка в комплекс ферментов, участвующих в общем метаболическом пути, обеспечивает возможность реализации иерархически более высокого регуляторного механизма, осуществляющего контроль функционирования метаболической системы как целого. Этот механизм контроля реализуется с участием вторых посредников, т.е. является механизмом слежения, переключающим функционирование метаболической системы в новый режим в соответствии с сигналами, поступающими от более высоких уровней контроля метаболизма или из внешней среды.

Механизм контроля функционирования мультиферментного комплекса как целого осуществляется с более высокой скоростью в сравнении с механизмами гомеостаза.

Мультиферментные комплексы находятся в равновесии со свободными ферментами. Это обстоятельство определяет возможность эффективного осуществления в клетке и механизмов гомеостаза, и механизмов слежения. Эти механизмы тесно связаны между собой. С одной стороны, клеточные метаболиты оказывают влияние на полноту формирования мультиферментного комплекса (Курганов, Сугробова, Вильман, 1986) и, следовательно, на саму возможность реализации механизма контроля более высокого уровня (контроль функционирования метаболической системы как целого). С другой стороны, свободные ферменты также являются объектами регулирующего воздействия со стороны вторых посредников, например, гормонов (Курганов, 1986).

В клетке присутствуют сотни метаболитов, ограниченность гидратирующеи емкости водного содержимого клетки препятствует возможности достижения рабочих концентраций по всем метаболическим интермедиатам. Поэтому для клетки эволюционно выгодным было образование мультиферментных ансамблей, обеспечивающих "каналирование" интермедиатов без выхода их за пределы микрокомпартмента ансамбля. Превращения интермедиатов происходят на конвейере активных центров без выхода интермедиатов в объем, что исключает их нежелательное вовлечение в другие метаболические пути (Welch, 1977; Курганов, Любарев, 1989; Easterby, 1989; Srere, 1990; Ovadi, 1991; Курганов, 1991; Ushiroyama et al., 1992; Mendes et al., 1992).

Микрокомпарментализация является характерной особенностью мультиферментных комплексов, объединяющих ферменты, которые катализируют последовательные стадии метаболического пути.

Фиксация мультиферментного комплекса на специфических якорных площадках клеточных структур означает его превращение в метаболой.

Метаболой

Для метаболона выделяют два уровня контроля его функционирования (Курганов, 1986).

Грубая регуляция (по типу включение-выключение) осуществляется химическими сигналами, воздействующими на "якорный" белок подложки. Роль этих сигналов выполняют вторые посредники (например, гормоны).

Тонкая настройка — осуществляется путем взаимодействия метаболитов-регуляторов с центрами, расположенными на поверхности метаболона.

Различие между этими типами регуляции состоит также в том, что мощность химических сигналов меняется в клетке в достаточно широких пределах, в то время как концентрации ключевых метаболитов-регуляторов (например, кофакторов ферментативных реакций) поддерживаются на постоянном уровне (по крайней мере, на протяжении относительно небольших интервалов времени).

Общий контроль функционирования метаболона по типу включения-выключения представляется следующим образом. Существует состояние метаболона, в котором расположение ферментов и конформации молекул ферментов таковы, что вход в микрокомпартмент закрыт и, следовательно, комплекс каталитически неактивен. Воздействие второго посредника на центр управления комплекса ("якорный белок") вызывает такие изменения конформации молекул ферментов и относительного расположения ферментов в комплексе, которые ведут к снятию стерических препятствий для входа субстратов в микрокомпартмент метаболона и для дальнейшей химической трансформации их в микрокомпартменте..

Механизм функционирования метаболона как единой системы относится к механизмам регуляции типа слежения.

С помощью вторых посредников осуществляется включение-выключение блоков метаболизма - метаболонов. Этот механизм регуляции занимает иерархически более высокое положение, чем механизмы регуляции, реализующиеся для индивидуальных ферментов (изостерический и алллостерический механизмы регуляции).

На рис. 1.3. представлена структурная организация микрокомпартмента метаболона, на рис. 1.4. - организации каналов (Курганов, Любарев, 1989).

На рис. 1.3. показано, что микрокомпартмент метаболона состоит из отдельных отсеков, соединенных относительно узкими каналами. В каналах оказываются сближенными активные центры ферментов или активные и аллостерические центры ферментов (рис.1.4.). Транспорт интермедиата из одного отсека в другой сопровождается химической трансформацией интермедиата. Аллостерические центры ферментов, расположенные в канале, также могут участвовать в транспорте интермедиатов, связывая соответствующий интермедиат (S2 на рис. 1.4. б).

Таким образом, аллостерические центры, расположенные в микрокомпартменте, наряду с функцией эффекторных регуляторных центров могут выполнять транспортные функции.

Когда один из ферментов, образующих канал, катализирует необратимую стадию метаболического пути, канал будет выполнять роль химического клапана, пропускающего интермедиаты только в одном направлении. Тем самым будет обеспечиваться векторный характер работы метаболона (Курганов, Любарев, 1989; 1991).

ЪЫ

_/I

""Ml

Рис. 1.3. Структурная организация микрокомпартмента метаболона: А, Б, В - отсеки микрокомпартмента; а, б, в, г - каналы, Si - метаболит, поступающий в микрокомпартмент; S_n+i - конечный продукт метаболического пути (Курганов, Любарев, 1989)

Рис. 1.4. Организация каналов: 1- активный центр, 2 - аллостерический центр (Курганов, Любарев, 1989)

1.3 Надмолекулярные комплексы ферментов цикла Кальвина

Живые организмы обладают только одним первичным механизмом карбоксилирования. Первичным в том смысле, что он порождает все остальное. Это путь биосинтеза органических соединений из углекислоты и воды. Он был расшифрован в пятидесятых годах группой ученых во главе с Кальвиным и Бенсоном из университета Беркли, штат Калифорния, США. Важность этих исследований была отмечена присуждением Кальвину Нобелевской премии. Полную последовательность изученных реакций называют циклом Кальвина или циклом Бенсона-Кальвина (чтобы отдать долг вкладу в работу Бенсона), или восстановительным пентозофосфатным циклом.

Главный механизм карбоксилирования при фотосинтезе обязан отвечать следующим четырем требованиям:

1. Должен обеспечивать регенерацию акцептора СО2;

2. Должен функционировать автокаталитически в качестве производительной реакции, в ходе которой субстрата образуется больше, чем используется;

3. Равновесие реакции карбоксилирования должно быть энергетически очень выгодным, чтобы компенсировать низкую концентрацию СОг в окружающей среде;

4. Катализирующая реакцию карбоксилаза должна обладать высоким сродством к СОг, чтобы её функционирование при низкой концентрации СОг было эффективным.

Всем этим четырем требованиям удовлетворяет восстановительный пентозофосфатный цикл (Эдварде, Уокер, 1986).

Ферменты цикла Кальвина и катализируемые ими реакции

1. Рибулозо -1,5 -бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа.

СН₂ОРО(ОН)₂

С0₂ + С=0

н-с-он

I н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂

Рибулозо-1,5-бисфосфат

СН₂ОРО(ОН)₂

-+ 0= С-ОН +

СН₂ОРО(ОН)₂

НОО- С-ОН +Н₂0

I с=о

I н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂ Промежуточный продукт 2-фосфогликолат

НО - СО

Н-С-ОН

СН₂ОРО(ОН)₂

3-ФГК

КФ 4.1.1.39

Молекулярная масса 120-550 кД

В условиях in vivo карбоксилазная активность фермента в 3-5 раз выше оксигеназной.

2. Фосфоглицераткиназа.

Молекулярная масса 47-50 кД

3. Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (НАДФ*) (фосфорилирующая)

Молекулярная масса 74-1500 кД

4. Триозофосфатизомераза

Н-С=0

Н-С-ОН

СН₂ОРО(ОН)₂ 3-ФГА

КФ 5.3.1.1. Молекулярная масса 53 кД

ОН Н-С-Н

с=о

I СН₂ОРО(ОН)₂

Дигидроксиацетонфосфат ДГАФ

5. Фруктозобмсфосфатальдолаза

Н-С=0

I Н-С-ОН

СН₂ОРО(ОН)₂

Н-С-Н

I + с=о

СН₂ОРО(ОН)₂

СН₂ОРО(ОН)₂

С=0

НО - С-Н

I Н-С-ОН

Н-С-ОН

СН₂ОРО(ОН)₂

3-ФГА

ДГАФ

Фруктозо-1,6-бисфосфат (ФБФ)

КФ 4.1.2.13.

Молекулярная масса 150 кД

6. Фруктозобмсфосфатаза (ФБР-аза)

СН₂ОРО(ОН)₂

с=о

но-с-н

н-с-он

+ Н₂0->

н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂ ФБФ

СН₂ОН

I ,

с=о

но-с-н

Н-С-ОН + НОРО(ОН)₂

Н-С-ОН

СН₂ОРО(ОН)₂ Фруктозо-6-фосфат (Ф-6-Ф)

КФ 3.1.3.11

Молекулярная масса 160 кД

Молекулярная масса 140 кД

_госЛЖ^скл_*

КФ 4.1.2.13

Молекулярная масса 150 кД

9. Седогептулозобисфосфатаза (СБФ-аза)

СН₂ОНОРО(ОН)₂ СН₂ОН

І І

с=о с=о

но-с-н

н-с-он

н-с-он

н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂

+ Н₂0->

НО-С-Н

І Н-С-ОН

н-с-он

н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂

Седогешулозо-7-Ф (С-7-Ф)

НОРО(ОН)₂

КФ 3.1.3.37

Молекулярная масса 50 кД

+ о=с-н

н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂

СН₂ОРО(ОН)₂
Сед-7-Ф 3-ФГА

10. Транскетолаза

СН₂ОН

но-с-н

н-с-он

н-с-он

н-с-он

0=С-Н

I Н-С-ОН

I +

Н-С-ОН

н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂

Рибозо-5-Ф Р5Ф

СН₂ОН

с=о

но-с-н

н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂

Ксилулозо-5-Ф Кс5Ф

КФ 2.2.1.1.

Молекулярная масса 140 кД

11. Рибозофосфатизомераза

КФ 5.3.1.6.

Молекулярная масса 52-60 кД

12. Рибулозофосфатэпимераза

13. Фосфорибулокиназа

ОН Н-С-Н

с=о

+ АТФ

-»

н-с-он

н-с-он

СН₂ОРО(ОН)₂ Ру5Ф

КФ 2.7.1.19

Молекулярная масса 50-680 кД

СН₂ОНОРО(ОН)₂

с=о

Н-С-ОН+ АДФ

I Н-С-ОН

СН₂ОРО(ОН)₂

Рибулозо-1,5-бисФ РБФ

Таким образом, 13 последовательных реакций цикла Кальвина катализируются 11 ферментами, из которых только два являются характеристическими, уникальными ферментами восстановительного пентофосфатного цикла-рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилаза/оксигеназа и фосфорибулокиназа.

Предположения о способности ключевого фермента цикла Кальвина рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилазы-оксигеназы образовывать комплекс с ферментами, поставляющими ему субстрат - рибозофосфатизомеразой и фосфорибулокиназой, высказывались разными исследователями, начиная с 1961 года (Peterkofsky, Racker, 1961; Mendiola, Akazawa,1964; McElroy et al., 1968, Ruther, 1970; Романова, 1973 и др.).

В пользу этого предположения приводились различные доводы, такие,
например, как высокая концентрация рибулозо-1,5-

бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в хлоропласте, что облегчает белок-белковые взаимодействия ферментов; сопутствие рибозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы на протяжении всех процедур очистки РБФКО, хотя при выделении РБФКО происходит многократное разбавление, которое должно было бы способствовать ослаблению взаимодействия этих трех ферментов и полному отделению их друг от друга; способность препаратов РБФКО даже высокой степени очистки фиксировать углекислоту в присутствии рибозо-5-фосфата и АТФ.

Ответ на вопрос, способны ли ключевые ферменты фотосинтеза образовывать мультиферментный комплекс, имеет принципиальное значение, так как механизмы регуляции активности ферментов в свободном состоянии и ферментов в мультиферментном комплексе различаются.

Однако только в последнее десятилетие в различных лабораториях были выделены и изучены свойства ассоциатов этих трех ферментов, а затем и комплексов других ферментов цикла Кальвина с различным числом составляющих их компонентов.

Sainis, Harris (1986) из листьев гороха был выделен трехферментный комплекс с молекулярной массой 800-850 кД, состоявший из РФИ, ФРК и РБФКО, а из листьев шпината двухферментный комплекс, компонентами которого были ФРК и РБФКО (Sainis, Merriam, Harris, 1989). Этими авторами были проведены кинетические исследования зависимости карбоксилазной активности мультиферментных комплексов при использовании различных субстратов - рибозо-5-фосфата, рибулозо-5-фосфата и рибулозо-1,5-бисфосфата. Было установлено, что карбоксилазная активность комплексов при использовании рибулозо-1,5-бмсфосфата быстро снижалась со временем и через 20-25 минут составляла 10-12% своей первоначальной активности. При использовании же рибозо-5-фосфата и рибулозо-5-фосфата карбоксилазная активность комплексов через 20-25 минут составляла 60-75% своей первоначальной активности,

Gontero et al. (1988) из листьев шпината был выделен функциональный пятиферментный комплекс ферментов цикла Кальвина -РФИ, ФРК, РБФКО, ФГК-киназы и ГАФД.

Исследователи считают, что функционирование комплекса заключается в образовании глицеральдегида-3-фосфата из рибозо-5-фосфата с «туннельным» переносом промежуточных соединений внутри ассоциата без выхода метаболитов за пределы реакционных центров ферментов.

Молекулярная масса этого мультиферментного комплекса составляла
520 кД или 536 кД в зависимости от метода определения: гель-
хроматографии через Sephacryl S-300, аналитического
ультрацентрифугирования или пластинчатого гель-электрофореза.
Величина молекулярной массы комплекса оказалась меньше суммы
молекулярных масс составляющих, комплекс ферментов - 904 кД. Такое

большое расхождение в величинах молекулярных масс дало авторам основание предположить, что четвертичные структуры ферментов внутри комплекса отличаются от тех, которые они имеют, когда выделены в свободном состоянии.

Комбинированное использование иммунохимических и денситометрических методов при исследовании числа и стехиометрии полипептидных цепей ферментов, входящих в состав комплекса, позволило доказать правильность данного предположения (Rault, Guidicu-Orticoni, Goutero, Ricard, 1993)

В свободном состоянии РФИ является димером с молекулярной массой 52-60 кД состоящей из двух идентичных субъединиц, имеющих молекулярную массу 26-30 кД (Anderson et al., 1968, Ruther, 1970; Kawashima, 1976 a, b; Иванищев, Насыров, 1984, Иванищев, 1982; Иванищев, Ахмедов, 1984; Бакаева, Бабаджанова, 1986; Бабаджанова, Бакаева, 1987; Leegood, 1990).

Величины молекулярной массы ФРК колеблются в значительных пределах: из листьев шпината - 50 кД (Ruther. 1970; Muller, 1972), или 80 кД (Porter, Milonez, Hartman, 1986), из листьев хлопчатника и бобов 240-250 кД (Бакаева, 1991; Хасанов, Ахмедов, 1983 а), 500 кД - из листьев кукурузы (Ruffer-Turner, Bradbeer, 1984), 680 кД - из листьев фасоли (Wara-Aswapati et al., 1980). Субъединичный состав фермента также колеблется в зависимости от объекта: ФРК из листьев шпината состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой по 45 кД (Krieger, Mizioko, 1986), из листьев хлопчатника и бобов — из четырех субъединиц с молекулярной массой, равной 60 кД (Бакаева, 1991; Хасанов, 1985), из листьев кукурузы и фасоли ФРК также состоит из четырех субъединиц, но величина молекулярной массы оказалась равной 125-170 кД (Ruffer-Turner,

1984; Wara-Aswapati et al., 1980). Субъединицы ФРК из всех изученных объектов обладали активностью. Добавление активирующих веществ (АТФ, дитиотрейтола и др.) приводило к образованию олигомерных форм фермента с большой молекулярной массой. Ассоциативные возможности фермента, вероятно, проявляются в результате конформационных перестроек, являющихся следствием связывания с АТФ, восстановления дисульфидных связей дитиотрейтолом и ослабления гидрофобных взаимодействий под влиянием холата (Wara-Aswapati et al., 1980).

Молекулярная масса РБФКО высших растений, водорослей и цианобактерий колеблется в пределах 500-550 кД. Фермент состоит из субъединиц двух типов - восьми больших (L) с молекулярной массой 50-58 кД и восьми маленьких (S) с молекулярной массой 12-18 кД. Таким образом, четвертичная структура РБФКО "растительного" типа выражается формулой L₈Sg (Sugiyamia et al., 1967; 1971; Rutner, Lane, 1967; Kawashima, 1969; Thompson, 1969; Эдварде, Уокер, 1986; Романова, 1975,1991).

У фототрофной бактерии Photopseudomonas sphaeroides выделены две формы РБФКО: одна форма сходна с ферментом высших растений, другая низкомолекулярна - 360 кД и состоит из шести больших субъединиц (Ьб).

Молекулярная масса РБФКО несерной пурпурной бактерии Rhodospirillum rubrum равна 120 кД и состоит только из двух больших субъединиц (L₂).

Подобные структуры L₂ были найдены и в молекулах L₈S₈ РБФКО шпината и табака (обзор, Романова, 1991).

Фосфоглицераткиназа является мономером с молекулярной массой 47-50 кД (Эдварде, Уокер, 1986; Leegood, 1990).

ГАФД - фермент, молекулярная масса которого колеблется в пределах 74-1500 кД, состоит из различных полипептидных цепей А-типа и

В-типа, простейшая четвертичная структура имеет формулу АгВ₂ (Yonuschot et al., 1970); Pawlitski, Laatzko, 1974; Pupillo, Piccari, 1975; Cerff, 1979).

Выделенный из хлоропластов шпината мультиферментный комплекс цикла Кальвина (Rault et al., 1993) имел молекулярную массу 510-520 кД и состоял из субъединиц следующих ферментов: РФИ - двух (2x30 кД), ФРК - двух (2x40 кД), РБФКО - двух больших (2x54 кД) и четырех малых (4x15 кД), ФГК-киназы - одной (1x50 кД), ГАФД - двух А-типа (2x39 кД) и двух В-типа (2x37 кД).

Таким образом, в выделенном из хлоропластов шпината мультиферментном комплексе структура четырех ферментов РФИ, ФРК, ФГК-киназы и ГАФД такая же. Соотношение же больших и малых субъединиц РБФКО изменилось и стало L2S4.

Persson and Johansson (1989) исследовали белок-белковые взаимодействия ферментов цикла Кальвина в двухфазной системе, состоящей из декстрана, полиэтиленгликоля и воды (фосфатный буфер). Сравнив коэффициенты распределения для активностей шести ферментов цикла Кальвина в составе грубого экстракта из хлоропластов шпината и для препаратов индивидуальных ферментов, авторы сделали вывод об образовании ассоциата ферментами: РБФК/О, ФГК-киназой, триозофосфатизомеразой, ГАФД, альдолазой и фруктозобисфосфатазой. Ассоциат содержал около 58% общего белка хлоропластов и, по-видимому, включал более сложный набор белков.

Из листьев хлопчатника и арабидопсиса был выделен
мультиферментный комплекс цикла Кальвина с молекулярной массой
520±20 кД (Бабаджанова, Насыров, 1992). У комплексов были определены
рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и

рибулобисфосфаткарбоксилазная активности. Полученные комплексы обладали свойствами, характерными для мультиферментных комплексов: кинетической комплементарностью ферментов, координированной регуляцией активности ферментов одними и теми же эффекторами, стабильностью в течение всех использованных процедур выделения и очистки.

Затем из листьев хлопчатника были выделены мультиферментные
комплексы с различными величинами молекулярных масс - 240, 400, 480 и
520 кД. (Бакаева и др.. 1994; Babadznanova, 1998; Бабаджанова и др., 1999;
1999 а; 2000). У мультиферментных комплексов с молекулярной массой 400
и 480 кД были определены три ферментативные активности —
рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и

рибулозобмсфосфаткарбоксилазная., У мультиферментного комплекса с
молекулярной массой 520 кД были определены также
фосфоглицераткиназная и глицеральдегидфосфатдегидрогеназная

активности. Кинетические исследования каждой ферментативной активности, проявляемой этими мультиферментными комплексами, выявили характерные для мультиферментных комплексов функциональные свойства - направленный перенос метаболитов, «облегченный» катализ и координированные регуляторные эффекты.

Gontero et al., (1993) было проведено сравнительное исследование кинетического поведения РБФКО и ФРК в зависимости от того, находились ли ферменты в свободном состоянии или были встроены в мультиферментный комплекс.

Величина К_т РБФКО в комплексе для рибулозо-1,5-бмсфосфата была в два раза ниже в сравнении с величиной К_т фермента в свободном состоянии. Величина же V_max карбоксилазной реакции РБФКО в комплексе

в пять раз превосходила Vmax фермента в свободном состоянии. Таким образом, отношения V_max/K_m в десять раз было выше для комплекса, чем для свободного фермента. Эти результаты показали, что в отсутствие активазы РБФКО проявляет намного более высокую карбоксилазную активность когда включена в комплекс.

Фосфорибулокиназа, второй уникальный фермент цикла Кальвина, активируется светом через тиоредоксиновую систему (Porter et al., 1988; Wolosiuk, Buchanan, 1978). Gontero et al. (1993) было установлено, что восстановленный тиоредоксин имеет большее сродство к ФРК, встроенной в комплекс, чем к свободному ферменту. При определенных концентрациях тиоредоксина (около 8 микромоль) временная константа активационного барьера была в 12 раз быстрее с комплексом, чем со свободной ФРК. Временная константа около 0,35 мин"¹ достаточно совместима с индукционным временем цикла Кальвина при переходе темнота-свет.

Исследованиями ряда авторов (Ricard, Giudici-Orticoni, Gontero, 1994; Gontero, Giudici-Orticoni, Ricaord, 1994; Lebreton, Gontero, Avilan, Ricard, 1997; 1977a; Avilan, Gontero, Lebreton, Ricard, 1997; Lebreton, Gontero, 1999) установлено, что кинетическое поведение РБФКО и ФРК, встроенных в комплекс, изменяется в результате гетерологических взаимодействий и последовательного переноса информации и энергии между ферментами внутри комплекса.

Показано, что фосфорибулокиназа в окисленной форме инактивируется, но становится активной при ассоциировании с ГАФД (Lebreton, Gontero, Avilan, Ricard, 1997, 1997a). В результате ассоциации ФРК с ГАФД значительно уменьшается - на 10 кДж/моль, высота энергетического барьера фосфорибулокиназной реакции. При диссоциации комплекса ФРК становится даже более активной, чем когда она была

ассоциирована с ГАФД. Это означает, что ГАФД оказывает оставляющее след действие на ФРК.

Диссоциация ФРК из комплекса, также усиливает её приспособляемость (Lareton, Gontero, 1999). Отпечаток (след) от ГАФД и большая приспособляемость приводят к каталитическому постоянству диссоциированной ФРК, которое в 10 раз выше, чем у фермента в комплексе., Отпечаток (след) является результатом, конформационных изменений, генерированных белок-белковыми взаимодействиями.

С помощью мутантной ФРК, выделенной из 12-2В мутанта Chlamidomanas reinhardtii, установлено, что Арг-64 играет главную роль в ассоциации ФРК и ГАФД, а также в переносе информации между этими двумя ферментами (Avilan, Gontero, Lebreton, Ricard, 1997 а). Кроме того, Арг-64 необходим для проявления каталитической активности.

Эти результаты согласуются с полученными ранее данными (Бакаева, 1996) о том, что в состав активного центра ФРК листьев хлопчатника входят три ионизирующиеся группы: две аминогруппы и одна сульфгидрильная группа.

Одна из аминогрупп может, по-видимому, вполне принадлежать аргинину.

В обзоре А.К.Романовой (1997) подробно описаны реконструированные комплексы следующих ферментов цикла Кальвина: РФИ и ФРК, ГАФД и альдолазы, альдолазы и триозофосфатизомеразы. Создание реконструированных комплексов является одним из важных информативных подходов, позволяющих прослеживать изменения кинетических и молекулярных свойств ферментов в результате их взаимодействия.

Все приведенные выше работы посвящены обнаружению или изучению свойств свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина.

Связь мультиферментных суперкомплексов с тилакоидными мембранами показана с помощью метода иммуноэлектронной микроскопии только для хлоропластов шпината (Suss, Arcona, Manteuffel, Adler, 1993) и фотосинтезирующей бактерии Chlamydomonas reinhardltii (Suss, Prokhorenko, Adler, 1995).

Выделенный из хлоропластов шпината мембраносвязанный мультиферментный комплекс имел молекулярную массу 900 кД и состоял из ферментов: РФИ, ФРК, РБФКО, ГАФД, седогептулозо-1,7-бмсфосфатазы и ферредоксин - НАД^редуктазы (КФ 1.18 1.1.). Предполагается, что такой суперкомплекс может обеспечивать прямой доступ СОг-ассимилирующих аппаратов к требующимся кофакторам (НАДН, АТФ) и может помочь предотвратить вмешательство других метаболических путей.

Методами электронной микроскопии криофиксированного материала в сочетании с иммунохимическим методом и использованием коллоидного золота в качестве метки (Adler, Arcona, Manteuffel, 1993; Suss, Prokhorenko, Adler, 1995) было показано, что к тилакоидным и мембранам переноида Chlamydomonas reinhardtii ориентированы РФИ, ФРК, РБФКО, активаза РБФКО, ГАФД, фруктозо-1,6-бмсфосфат-альдолаза, седогептулозо-1,7-бисфосфатаза, нитрит-редуктаза, АТФ-синтаза и ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктаза.

1.4. Резюме

Обобщая обзор литературы можно сделать следующее заключение: в настоящее время представление о существовании в клетке отдельных

независимых ферментов сменяется осознанием надмолекулярной ферментной организации.

Ассоциация ферментов в различные формы надмолекулярной организации - мультиферментные ассоциаты, комплексы, конъюгаты, ансамбли адсорбционные и интегральные - дает им многие структурные и функциональные преимущества.

Физиологическая роль пространственной близости ферментов разнообразна. Близость активных центров может способствовать взаимодействию ковалентно связанного интермедиата с каждым активным центром, где осуществляется его химическое превращение. Диффундирующий интермедиат может передаваться из одного активного центра в другой путем направленного переноса. При этом уменьшается разбавление интермедиата в среде и предотвращается его преобразование под действием других ферментов. Кроме того, если метаболит высокореакционоспособен и, следовательно, токсичен, клетке обеспечивается защита от него.

Направленный перенос метаболитов обусловливает более быстрый ответ метаболических процессов на изменения в концентрации субстрата или эффектора, так как благодаря ему уменьшается предстационарный период. Он способствует также увеличению общей скорости реакции за счет уменьшения времени перехода.

Результатом объединения ферментов в комплексы может быть активирование физиологически важных и подавление нежелательных ферментативных реакций.

В кластерах ферментов может осуществляться координированная регуляция — активация и ингибирование за счет конформационных

изменений, вызванных лигандом одного фермента и переданных с помощью различных контактов на другой фермент.

Разная по своей сложности структурная организация ферментов в соответствии с большим разнообразием мембран и других структурных элементов в клетке обуславливает компартментацию метаболитов.

Хотя надмолекулярная организация ферментов бактерий и животных клеток исследуется в течение уже более 30 лет, выделение и изучение мультиферментных комплексов ферментов цикла Кальвина началось только в последнее десятилетие.

Из листьев классических этимологических объектов шпината и гороха были выделены мультиферментные комплексы с различными величинами молекулярных масс. Величины молекулярных масс, различались для мультиферментных комплексов даже из одного и того же объекта.

Для пятиферментного комплекса цикла Кальвина, выделенного из хлоропластов шпината установлено, что в комплексе изменилась четвертичная структура только одного фермента - РБФКО.

Было проведено сравнительное исследование кинетического поведения РБФКО и ФРК в зависимости от того, находились ли ферменты в свободном состоянии или были встроены мультиферментный комплекс.

Из хлоропластов шпината был выделен мембраносвязанный мультиферментный комплекс, включавший пять ферментов цикла Кальвина и ферредоксин НАД^-редуктазу.

Однако до настоящего времени не проведены сравнительные исследования механизмов регуляции активности ферментов цикла Кальвина, встроенных в различные мультиферментные комплексы.

Остается невыясненным, когда происходит связывание свободной формы РБФКО с мембранами — на ранних стадиях онтогенетического развития хлоропластов или же после завершения формирования его мембранной системы, и какова функциональная роль связывания фермента с мембранами.

Одновременно из хлоропластов одного и того же объекта не выделялись свободные и мембраносвязанные мультиферментные комплексы цикла Кальвина.

На основании вышеизложенного необходимо было решить следующие задачи:

провести комплексное исследование функциональных свойств мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс;

выявить механизмы взаимодействия трех последовательно действующих в цикле Кальвина ферментов - РФИ, ФРК и РБФКО, встроенных в различные мультиферментные комплексы;

выявить функциональную роль связывания РБФКО с мембранами;

из одного объекта выделить одновременно свободный и мембраносвязанный мультиферментные комплексы и сравнить величины их ферментативных активностей.

Решение этих задач позволит выявить механизмы регуляции активности ферментов цикла Кальвина, встроенных в мультиферментные комплексы, и выяснить функциональную роль образования различных мультиферментных комплексов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Функциональные последствия объединения ферментов в надмолекулярные комплексы

При объединении ферментов в комплекс их активные центры окажутся в непосредственной близости. Сближенность активных центров открывает образуемому первым ферментом продукту легкий доступ ко второму ферменту и т.д. В некоторых мультиферментных комплексах соединение, перемещающееся от одного фермента к другому, ковалентно связано с самим комплексом. Для ковалентно связанных интермедиатов эффективность переноса их с одного фермента на другой достигает 100%, т.е. потери в таких мультиферментных комплексах отсутствуют. В других мультиферментных комплексах метаболиты являются диффундирующими. Переходы от одного фермента к другому осуществляются в три стадии: 1) освобождение из активного центра фермента А; 2) точное попадание каждого продукта предшествующего фермента (А) к последующему ферменту (Б) и т.д.; 3) взаимодействие с активным центром фермента В. Для того, чтобы интермедиат не покидал комплекс, а с высокой вероятностью связывался со следующим ферментом в цепи реакций, активные центры ферментов расположены определенным образом по отношению друг к другу. Таким способом достигается компартментация метаболита, часто называемая «эффектом направленного переноса» (Фридрих, 1986). Защита метаболита и (или) клетки Компартментация предохраняет метаболит от вредного воздействия ферментов и сокращает время его перехода от одного активного центра к другому, уменьшает вероятность его распада (например, в результате гидролиза), осуществляет минимизацию энергетических расходов. С другой стороны, некоторые метаболиты, например, альдегиды, токсичны для клетки, поэтому важно отделить их от других компонентов клетки. Уменьшение времени перехода Время перехода — это время переноса метаболита от одного активного центра к другому. При образовании мультиферментных комплексов активные центры ферментов оказываются сближенными, что приводит к значительному уменьшению времени перехода метаболитов, способствует их направленному переносу.

При этом отпадает необходимость в полном уравновешивании продукта предыдущей реакции (субстрата последующей) с окружающей средой. В результате прямой передачи (туннелирования) продукта одной реакции на фермент, катализирующий следующую реакцию, снижается потребность в насыщающем количестве субстрата и ускоряется сам процесс переноса. Сокращение времени превращения метаболитов увеличивает общую скорость метаболического процесса (Keleti, Ovadi, Batice, 1989). Активация физиологических и подавление нежелательных реакций При объединении ферментов в комплекс области, формирующие поверхности контактов этих ферментов, неизбежно меняются. При помощи таких контактов молекулы ферментов могут различным образом влиять друг на друга. Поскольку активные центры ферментов должны располагаться относительно друг друга исключительно точно, даже незначительные изменения структуры при взаимном приспособлении контактирующих поверхностей могут заметно отражаться на эффективности катализа. Взаимодействия между ферментами вызывают изменения их кинетических параметров - Vmax, Кщ. Это означает, что хотя каталитическая активность каждого фермента в отдельности может быть небольшой, при образовании комплекса ферментов она увеличивается благодаря повышению Vmax, и (или) снижению Кт. Таким образом, взаимодействия между ферментами приводят к «облегченному» катализу в результате изменения кинетического поведения взаимодействующих ферментов. Многие ферменты способны катализировать кроме физиологических и другие побочные реакции. Поскольку агрегация ферментов активирует нормальный метаболизм, то тем самым предотвращаются нежелательные реакции из-за отсутствия соответствующих субстратов (Фридрих, 1986; Курганов, 1986; 1992; Ермаков, 1993). Координированные регуляторыые эффекты Координированная регуляция мультиферментных комплексов означает, что одна молекула эффектора влияет на несколько ферментов, изменяя их кинетические параметры - Vmax, Km. На рис. 1.2. показано действие эффектора на двухферментный комплекс. Координированная регуляция может затрагивать и процессы, не относящиеся прямо к активности ферментов, а связанные с регуляцией их уровня, т.е. с кругооборотом ферментов. Например, для конъюгата агот, катализирующего последовательные реакции метаболического пути биосинтеза ароматических аминокислот у микроорганизмов и высших растений, было показано, что первый субстрат придает конъюгату повышенную устойчивость к протеолизу (Vitto, Gaertner, 1978). Очевидно, что в присутствии первого субстрата распад любого из ферментов в данной последовательности реакций приведет к нежелательным последствиям. Контроль деградации ферментов - это сложный процесс, происходящий в любой клетке. Кругооборот белков дает возможность перераспределять строительный материал (в данном случае аминокислоты) в соответствии с нуждами клетки (Фридрих, 1986). Роль мультиферментных комплексов в интеграции клеточного метаболизма Регуляторные механизмы живой клетки можно разделить на две группы (Конев, 1979, Розен, 1969): регуляторные механизмы, направленные на поддержание концентраций ключевых метаболитов на постоянном уровне (механизмы поддержания клеточного гомеостаза), и регуляторные механизмы, воспроизводящие изменение некоторой величины, определяемой внешними условиями (механизмы слежения). Без механизмов поддержания гомеостаза невозможно само существование клетки как единой, организованной системы. Механизмы слежения занимают более высокое положение на иерархической лестнице уровней контроля клеточного метаболизма по сравнению с механизмами регуляции гомеостаза. Поддержание концентраций ключевых метаболитов на постоянном уровне (поддержание клеточного гомеостаза) осуществляется с помощью изостерических и аллостерических механизмов регуляции. Сборка в комплекс ферментов, участвующих в общем метаболическом пути, обеспечивает возможность реализации иерархически более высокого регуляторного механизма, осуществляющего контроль функционирования метаболической системы как целого. Этот механизм контроля реализуется с участием вторых посредников, т.е. является механизмом слежения, переключающим функционирование метаболической системы в новый режим в соответствии с сигналами, поступающими от более высоких уровней контроля метаболизма или из внешней среды.

Механизм контроля функционирования мультиферментного комплекса как целого осуществляется с более высокой скоростью в сравнении с механизмами гомеостаза. Мультиферментные комплексы находятся в равновесии со свободными ферментами. Это обстоятельство определяет возможность эффективного осуществления в клетке и механизмов гомеостаза, и механизмов слежения. Эти механизмы тесно связаны между собой. С одной стороны, клеточные метаболиты оказывают влияние на полноту формирования мультиферментного комплекса (Курганов, Сугробова, Вильман, 1986) и, следовательно, на саму возможность реализации механизма контроля более высокого уровня (контроль функционирования метаболической системы как целого). С другой стороны, свободные ферменты также являются объектами регулирующего воздействия со стороны вторых посредников, например, гормонов (Курганов, 1986). В клетке присутствуют сотни метаболитов, ограниченность гидратирующеи емкости водного содержимого клетки препятствует возможности достижения рабочих концентраций по всем метаболическим интермедиатам. Поэтому для клетки эволюционно выгодным было образование мультиферментных ансамблей, обеспечивающих "каналирование" интермедиатов без выхода их за пределы микрокомпартмента ансамбля. Превращения интермедиатов происходят на конвейере активных центров без выхода интермедиатов в объем, что исключает их нежелательное вовлечение в другие метаболические пути (Welch, 1977; Курганов, Любарев, 1989; Easterby, 1989; Srere, 1990; Ovadi, 1991; Курганов, 1991; Ushiroyama et al., 1992; Mendes et al., 1992). Микрокомпарментализация является характерной особенностью мультиферментных комплексов, объединяющих ферменты, которые катализируют последовательные стадии метаболического пути. Фиксация мультиферментного комплекса на специфических якорных площадках клеточных структур означает его превращение в метаболой. Метаболой Для метаболона выделяют два уровня контроля его функционирования (Курганов, 1986).

Методы исследования

Для работы использовали реактивы фирмы Reanal (Венгрия): рибозо- 5-фосфат, трис (гидроксиметиламинометан основание), L-цистеин, ДЭАЭ- целлюлоза, акриламид, Ы,1Ч-метиленбмсакриламид, глицин, тетраметилендиамид, аммоний надсернокислый, бромфеноловый синий, амидочерный. Для гель-фильтрации и гель-хроматографии использовали сефадексы марок G-25, G-50, G-150, G-200, фирмы Pharmacia (Швеция), парахлормеркурибензоат использовали фирмы Chemapol (Чехословакия), пиридоксаль-5-фосфат (Швейцария), голубой декстран 2x10 фирмы Serva (ФРГ). Отечественные реактивы такие, например, как сульфат аммония, дигидрофосфат калия, молибдат аммония использовались марок х.ч., реактивы других марок перекристаллизовывались: сульфат натрия, хлорид магния, хлорид натрия, хлорид калия и бикарбонат натрия. Капроновый порошок получали по методике, описанной М.К.Гильмановым и др. (1981). Р-5-Ф-бариевую соль переводили в натриевую по методике, приведенной в работе А.КРомановой (1980). Рибулозо-5-фосфат синтезировали в лаборатории по методике Н.Г.Русиновой (1978). Сефадексы приготовляли соответственно рекомендациям, описанным в практическом руководстве по энзимологии Г.А.Кочетова (1980). ДЭАЭ-целлюлозу для ионообменной хроматографии готовили по методу, приведенному в книге В.Ф.Гавриленко и др. (1975). 2.2.2. Определение количественного содержания белка по методу Лоури и др. Метод Лоури и др. (Lowry et ah, 1951) основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Высокая чувствительность метода дает возможность определять 10-100 мкг белка в пробе. На развитие окраски влияет большое количество веществ. Поэтому для устранения их влияния при построении калибровочного графика использовался растворитель для стандартного раствора белка, содержащий компоненты анализируемых проб. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-26 или Ultrospec II (LKB, Швеция). В экстрактах определение количества белка проводилось с предварительным осаждением белков трихлоруксусной кислотой (ТХУ), с последующим растворением в щелочных растворах или очистка белковых растворов от низкомолекулярных компонентов гель фильтрацией на сефадексе G-25. Количественное содержание белка в очищенных ферментных препаратах определяли без предварительного осаждения ТХУ (Кочетов, 1980) Гель-хроматография и ионообменная хроматография (ИОХ) проводились на основе определения белка спектроскопическим методом при 280 нм на приборе марки ISCO-UA-5 (США). 2.2.3.

Микроопределение белка с биуретовым реактивом Метод основан на образовании окрашенных продуктов при добавлении к раствору белка щелочного раствора меди (биуретовая реакция). Развитие окраски обусловлено наличием в белке пептидных связей. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка., Биуретов реактив для микроопределения получил название реактива Бенедикта. Определение количественного содержания белка с реактивом Бенедикта проводили по методике, описанной Кочетовым (1980). Измерения велись на спектрофотометре ULTROSPECII (LKB, Швеция). 2.2.4. Определение неорганического фосфора Определение неорганического фосфора проводилось по методу Фиске-Суббароу (Лоури-Лопас) в модификации Скулачева (Кочетов, 1980). Неорганический фосфор, содержащийся в пробах, быстро реагирует в кислой среде с молибденовой кислотой, в результате чего получается фосфорно-молибденовая кислота, которая, восстанавливаясь, образует продукт реакции синего цвета. Восстановителями могут быть эйконоген (о 1,2,4-аминонафтолсульфоновая кислота) или аскорбиновая кислота (модификация Скулачева). Интенсивность синего окрашивания пропорциональна количеству неорганического фосфора, присутствующего в растворе и которая может быть определена на фотоэлектрокалориметре или спектрофотометре при длине волны 750 нм. Для построения калибровочного графика в стандартном растворе КН2РО4 определяют различные количества неорганического фосфора, которые берутся в пределах чувствительности данного метода. 2.2.5. Определение активности рибозофосфатизомеразы Для определения активности ферментов очень важно иметь методы, которые были бы недлительны, легко воспроизводимы с использованием доступных реактивов. Нами были налажены методы определения активности следующих ферментов цикла Кальвина: рибозофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы, рибулозобмсфосфаткар-боксилазы, а также глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и фруктозобмсфосфатазы. Определение активности рибозофосфатизомеразы проводилось с учетом специфики объекта по модифицированному методу Аксельрода и Янг (Axelrod, Jang, 1954). В зависимости от цели опыта реакционная смесь содержала 0,02 М трис-НС1 буфер, рН 7,6, 0,1-20 мкг белка и 0,5-20 мкмоль Р5Ф. Реакцию изомеризации проводили при температуре + 30С в течение 1 минуты. Определение продукта реакции кетосахара Ру5Ф проводили карбазольным методом по реакции Дише (Dische, Borenfreund, 1951), приливая к образовавшемуся продукту 3 мл 70% (по объему) серной кислоты, 0,1 мл 1,5% раствора цистеин- НС1 и 0,1 мл 0,12: спиртового раствора карбазола (Романова, 1980). При температуре +50С и при продолжительности реакции 30 минут развивалась максимальная окраска, согласно работе Лима и Кохен (Lim. Cohen, 1956). После остывания растворов, проводили измерения экстинции на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при 540 нм или спектрофотометре ULTROCPEC II. Расчеты велись по калибровочной кривой, построенной по Ру5Ф, синтезированному нами по методике Н.Г.Русиновой (1978). Рибозофосфатизомеразную активность выражали в мкмоль Ру5Ф в минуту в расчете на 1 мг белка. Определение проводилось по методу Гурвица и др. (Hurwitz et al., 1956), с незначительной модификацией. Фермент в количестве 0,1-50 мкг инкубировался в среде с 0,025 М трис- НС1 буфером, рН 8,0, 0,03 М АТФ, 0,004 М MgCl2 и 0,001 М глютатионом или ДТТ при 37С в течение 3 минут. После этого в ферментную смесь добавлялся второй субстрат -Ру5Ф (0,1-20 мкмоль). Продолжительность реакции - 1 минута, после чего реакцию останавливали добавлением равного по объему количества 6% ТХУ. Реакционную смесь нейтрализовали бикарбонатом натрия.

Для определения щелочегидролизуемого фосфора отбирали по 0,2 мл и проводили гидролиз в течение 20 минут с 0.2 мл 2 N NaOH. Смесь нейтрализовали добавлением 1,2 мл 2 N НС1, затем добавляли по 0,7 мл воды (бидистиллят), 0,4 мл 2,5% молибдата аммония и 0,1 мл 1% аскорбиновой кислоты. Для развития окраски пробы выдерживали 5 минут при температуре 37С, затем охлаждали при комнатной температуре в течение 10 минут. Измерения проводили на фотоэлектрокалориметре КФК- 2 или спектрофотометре ULTROCPEC II при длине волны 750 нм. Контролем служила реакционная смесь, но без фермента. Пересчет количества щелочегидролизуемого фосфора вели по калибровочной кривой, построенной по дигидрофосфату калия. Фосфорибулокиназную активность выражали в мкмоль РБФ в минуту (Е) в расчете на 1 мг белка. Для изучения последовательного катализа Р5Ф - Ру5Ф + АТФ -» РБФ -активность ФРК определяли, используя в качестве субстрата Р5Ф. 2.2.7. Определение карбоксилазной активности рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы радиометрическим методом. Определение карбоксилазной активности проводили при 30С (Романова, 1980) с незначительной модификацией с учетом специфики объекта. Для этого использовали NaH14C03, который растворяли в 0,05 М трис-НС1, рН 8,3. Состав стандартной ферментативной смеси в мкмолях на 1 мл: MgCl2-10, ДТТ -10, NaH14C03 - 50, РБФ - 0,5-25, ферментный препарат - 0,01-0,1 мг. Для создания активирующих условий ферментный препарат предварительно инкубировали с 10 мкмоль немеченной углекислоты в течение 10 минут при температуре 40С. Реакцию начинали добавлением второго субстрата рибулозо-1,5-бмсфосфата. Продолжительность реакции — 2 минуты.

Онтогенетические изменения ферментативных активностей свободного мультиферментного комплекса, выделенного в денатурирующих условиях

Мультиферментный комплекс цикла Кальвина был выделен в денатурирующих условиях по методу, приведенному на рис.2.2 из 15-25-ти дневных листьев хлопчатника в фазе развития растений 6-8 настоящих листьев, бутонизации и цветения. На рис.3.5. представлен ход элюции выделенных из листьев хлопчатника в фазе развития растений 6-8 настоящих листьев белков, обработанных ацетоном, при гель-хроматографии на колонке с SEPHADEX G-150. Белки вершины пика, т.е. фракций 7-12, объединяли и подвергали дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. На рис.3.6. приведена элюция собранного после гель-хроматографии белка линейным градиентом концентрации КС1 от 0 до 200 мМ при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Белок элюировался одним пиком. Фракция 14 был взята для определения молекулярной массы белка методом диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле и различных ферментативных активностей. На рис.3.7. видно, что белок проявился в виде одной полосы, то есть полученный препарат являлся электрофоретически гомогенным. По калибровочному графику, приведенному на рис.3.8, была определена молекулярная масса ферментного препарата. Молекулярная масса мультиферментного комплекса, выделенного в денатурирующих условиях, оказалась равной 240±10 кД. У этого мультиферментного комплекса были определены следующие активности: рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и рибулозобисфосфаткарбоксилазная. Рибозофосфатизомеразная активность мультиферментного комплекса оказалась равной 2794 мкмоль рибулозо-5-фосфата/мин на 1 мг белка. Фосфорибулокиназную активность мультиферментного комплекса с молекулярной массой 240 кД определяли дважды: используя специфический субстрат - рибулозо-5-фосфат и в присутствии в качестве субстрата рибозо-5-фосфата. Фосфорибулокиназная активность комплекса в присутствии рибулозо-5-фосфата составила 3156 мкмоль рибулозо-1,5-бмсфосфата/мин на 1 мг белка. При использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата активность оказалась равной 3497 мкмоль рибулозо-1,5-бисфосфата/мин на 1 мг белка, т.е. на 13 % выше.

Карбоксилазная активность мультиферментного комплекса при использовании рибулозо-1,5-бисфосфата была равна 0,94 мкмоль СС /мин на 1 мг белка. В присутствии в качестве субстрата рибозо-5-фосфата мультиферментный комплекс проявил карбоксилазную активность, равную 1.1 мкмоль СОг/мин на мг белка, т.е. на 17% выше. В табл.3.4 сведены полученные данные о проявлении различных ферментативных активностей мультиферментным комплексом с молекулярной массой 240 кД, выделенным из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе развития растений 6-8 настоящих листьев. Из представленных в табл.3.5 данных видно, что величина рибозофосфатизомеразной активности мультиферментного комплекса составила 2982 мкмоль рибулозо-5-фосфата/мин на 1 мг белка, т.е. почти не изменилась в сравнении с активностью комплекса, выделенного в фазе развития растений 6-8 настоящих листьев. Величины фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбок-силазной активностей мультиферментного комплекса значительно выше при использовании рибозо-5-фосфата, а не в присутствии своих специфических субстратов - рибулозо-5-фосфата и рибулозо-1,5-бисфосфата. Фосфорибулокиназная активность мультиферментного комплекса в присутствии рибулозо-5-фосфата составила 3387 мкмоль рибулозо-1,5-бмсфосфата/мин на 1 мг белка. При использовании же в качестве субстрата рибозо-5-фосфата фосфорибулокиназная активность была равна 3794 мкмоль рибулозо-1,5-бмсфосфата/мин на 1 мг белка, т.е. на 12% выше. Карбоксилазная активность мультиферментного комплекса при использовании рибулозо-1,5-бисфосфата была равна 0.97 мкмоль ССУмин на 1 мг белка. В присутствии же в качестве субстрата рибозо-5-фосфата мультиферментный комплекс проявил карбоксилазную активность, равную 1.44 мкмоль СОг/мин на 1 мг белка, т.е. на 48% выше. В сравнении с фазой 6-8 настоящих листьев в фазе бутонизации при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата значительно возросла рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность мультиферментного комплекса - на 31%. В присутствии же собственного специфического субстрата рибулозо-1,5-бисфосфата величина карбоксилазной активности мультиферментного комплекса не изменилась. В табл.3.6 представлены результаты определения ферментативных активностей мультиферментного комплекса с молекулярной массой 240 кД, выделенного из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе цветения растений. Из приведенных в табл.3.6 данных видно, что рибозофосфатизомеразная активность мультиферментного комплекса составила 3208 мкмоль рибулозо-5-фосфата/мин на 1 мг белка.. Величины фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активностей мультиферментного комплекса значительно выше в присутствии рибозо-5-фосфата, а не при использовании собственных специфических субстратов — рибулозо-5-фосфата и рибулозо-1,5-бмсфосфата. Фосфорибулокиназная активность мультиферментного комплекса при использовании собственного специфического субстрата - рибулозо-5-фосфата, составила 3534 мкмоль рибулозо-1,5-бмсфосфата/мин на 1 мг белка. В присутствии же в качестве субстрата рибозо-5-фосфата фосфорибулокиназная активность была равна 3876 мкмоль рибулозо-1,5-бисфосфата/мин на 1 мг белка, т.е. на 10% выше. Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность мультиферментного комплекса в присутствии рибулозо-1,5-бмсфосфата была равна 1.25 мкмоль СОг/мин на 1 мг белка. При использовании же в качестве субстрата рибозо-5-фосфата мультиферментный комплекс проявил рибулозобисфосфат-карбоксилазную активность, равную 1.83 мкмоль СОг/мин на 1 мг белка, т.е. на 46% выше. В сравнении с фазой бутонизации в фазе цветения величины рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активностей мультиферментного комплекса были несколько выше. Рибулозобисфосфаткарбоксилазная же активность мультиферментного комплекса значительно возросла независимо от использованного субстрата на 27-29%. Следовательно, величины всех ферментативных активностей мультиферментного комплекса с молекулярной массой 240 кД имели наибольшие значения в фазах формирования репродуктивных органов. Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата возрастала на 31-27%. 3.3. Резюме При использовании и комбинировании различных способов выделения и очистки белков нами получены свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина с молекулярной массой 520±20 кД и 240±10 кД. При диск-электрофорезе в полиакриламидном геле оба комплекса вели себя как гомогенные молекулярные структуры.

У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520±20 кД, выделенного в фазе 6-8 настоящих листьев, определены пять ферментативных активностей: рибозофосфатизомеразная, фосфо-рибулокиназная, рибулозобисфосфаткарбоксилазная, фосфоглицерат-киназная и глицеральдегидфосфатдегидрогеназная. Таким образом, в фазах 6-8 настоящих листьев, бутонизации и цветения проведены сравнительные исследования рибозофосфатизоме-разной, фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активностей мультиферментных комплексов с молекулярными массами 520 и 240 кД. В сравнении с фазой 6-8 настоящих листьев величина рибозо-фосфатизомеразной активности мультиферментных комплексов незначительно возрастала в фазах бутонизации и цветения. Независимо от фазы развития растений величины фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активностей обоих мультиферментных комплексов, определенные при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата были значительно выше величин активностей, полученных при использовании собственных специфических субстратов этих ферментов — рибулозо-5-фосфата и рибулозо-1,5-бмсфосфата. Следовательно, использование мультиферментными комплексами рибозо-5-фосфата - субстрата первой реакции метаболической цепи является более эффективным. РФИ ФРК рибозо-5-фосфат - рибулозо-5-фосфат — рибулозо-1,5-бисфосфат РБФКО - (2)3-фосфоглицериновая кислота, со 2 Протекание промежуточных реакций при добавлении собственных специфических субстратов с меньшей скоростью в сравнении со скоростью суммарной реакции в присутствии первого субстрата данной метаболической цепи свидетельствует о наличии «облегченного» катализа -функционального свойства, характерного для мультиферментных комплексов. Мультиферментные комплексы имели между собой небольшие различия по величинам рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активностей.

Сравнительные определения ферментативных активностей свободного и мембраносвязанного мультиферментных комплексов

Результаты определения различных ферментативных активностей свободного и мембраносвязанного комплекса ферментов цикла Кальвина при использовании в качестве субстрата реакций рибозо-5-фосфата приведены в табл.5.1. Rault et al. (1993), исследовали число и стехиометрию полипептидных цепей этого свободного мультиферментного. комплекса, используя иммунохимические и денситометрические методы. Ими было установлено, что мультиферментный комплекс состоял из субъединиц следующих ферментов: РФИ-двух (2x30 кД), ФРК-двух (2x40 кД), РБФК/О-двух больших (2x54 кд) и четырех малых (4x15 ісД), фосфоглицераткиназы-одной (1x50 кД), ГАФД-двух А типа (2x39 кД) и двух Б-типа (2x37 кД). Для трех выделенных в свободном состоянии ферментов РФИ, ФРК и ГАФД стехиометрия полипептидных цепей всегда была 1:1, т.е. РФИ и ФРК являлись димерами, состоящими из двух идентичных субъединиц, а ГАФД состояла из двух типов полипептидных цепей, названных А и В, и её четвертичная структура - А2В2 (Rault et al; 1993). РБФКО высших растений в свободном состоянии имеет молекулярную массу 520-550 кД и соотношение больших (L) и малых (S) субъединиц LgSg (Романова, 1975, 1980, 1985, 1991). Следовательно, число и стехиометрия полипептидных цепей РФИ, ФРК, ГАФД в свободном состоянии и в мультиферментном комплексе остались одинаковыми, а у РБФКО в комплексе соотношение больших и малых субъединиц изменилось и стало L2S4. В таком случае мультиферментный комплекс должен содержать два активных центра для рибулозо-1,5-бисфосфата. Исследованиями кинетики ингибирования скорости реакции при использовании конкурентных ингибиторов субстрата установлено, что мультиферментный комплекс содержит два активных центра для связывания рибулозо-1,5-бмсфосфата (Rault et al. 1993). Из приведенных в табл.5.1. результатов видно, что для мембраносвязанного комплекса ферментов цикла Кальвина характерны более высокие величины ферментативных активностей в сравнении со свободным мультиферментным комплексом. Эти различия особенно четко выражены при проявлении мультиферментными комплексами рибулозобнсфосфаткарбоксилазной активности. По величине рибулозобг/сфосфаткарбоксилазной активности мембраносвязанный мультиферментный комплекс превосходил свободный на 52% или в 1.52 раза.

Поскольку рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность определялась спектрофотометрически по скорости окисления НАД Н при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата, а не рибулозо-1,5- бисфосфата, то проявление активности комплексами свидетельствует о протекании следующих пяти реакций: +АТФ рибозо-5-фосфат— рибулозо-5-фосфат рибулозо-1,5-бисфосфат 1 2 +NaHC03 +(2)АТФ (2)3-фосфоглицериновая кислота (2)1,3-фосфоглице- 3 4 НАДН риновая кислота (2)3-фосфоглицериновый альдегид + 5 + 2HA,Zr + + H3P04 Следовательно, выделенные нами ферментные препараты представляют собой мультиферментные комплексы пяти ферментов цикла Кальвина: 1 - рибозофосфатизомеразы, 2 - фосфорибулокиназы, 3 -рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, 4 - фосфоглицератки-назы и 5 - глицеральдегидфосфатдегидрогеназы. Активность других ферментов цикла Кальвина у данных комплексов нами не определялась. Поэтому нельзя утверждать, что компонентами выделенных мультиферментных комплексов являлись только пять перечисленных выше ферментов. Различия в величинах молекулярных масс свободного и мембраносвязанного мультиферментного комплекса дают основание предполагать, что комплексы не идентичны по составляющим их компонентам. Одной из причин неидентичности состава компонентов мультиферментных комплексов могло быть применение при выделении свободного комплекса сульфата аммония, что, возможно, привело к диссоциации компонента или компонентов, чувствительных к высокой ионной силе. Зависимость молекулярной массы выделяемых мультиферментных комплексов от ионной силы хорошо показана в работе (Suss, Arcona, Manteuffel, Adler, 1993). Ими были выделены комплексы различных ферментов цикла Кальвина с молекулярными массами от 1000 кД до 200 кД и меньше при концентрациях КС1 от 150 до 480 мМ. Другой причиной, по-видимому, могло быть выделение из тилакоидных мембран хлоропластов мультиферментного комплекса, в состав которого входят белок или белки, связывающие комплекс с мембраной, или другие последовательно ассоциированные с мембраной ферменты цикла Кальвина, „ или фермент ферредоксин-НАДФ+-редуктаза, как обнаружено в работе (Suss et all., 1993). Этими авторами показано, что ферредоксин-НАДФ+-редуктаза - конечный, терминальный фермент электронного транспорта является истинным компонентом выделенного ими мембраносвязанного мультиферментного комплекса и его функция заключается в обеспечении НАДФН для восстановления СОг. Анализ литературы показывает, что количество ферментов, входящих в состав мультиферментных комплексов может в значительной мере зависеть от объекта, от методов, использованных для выделения и очистки комплексов, а также от различной устойчивости комплексов у разных объектов. Поэтому, вероятно, из хлоропластов разных объектов получены мембраносвязанные мультиферментные комплексы с различными величинами мол.масс: из шпината - 900 ± 50 кД (Suss et al., 1993), а из хлопчатника - 640 ± 25 кД.

Таким образом, из разных объектов, несмотря на методические различия, выделены аналогичные комплексы. Это свидетельствует о том, что образование подобных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений является закономерностью. Чтобы выяснить, различаются ли по стабильности полученные мультиферментные комплексы после хранения в течение 7 суток при температуре +4С, нами была определена их карбоксилазная активность радиометрическим методом по включению NaH14CC 3 в кислотоустойчивые продукты реакции. В качестве субстратов реакции использовались рибулозо-1,5-бисфосфат и рибозо-5-фосфат. Приведенные в табл. 5.2 данные показывают, что через 7 суток оба мультиферментных комплекса сохранили карбоксилазную активность, но ее величины были в 2-2.5 раза ниже, чем непосредственно после очистки. Следует отметить, что величины карбоксилазной активности обоих мультиферментных комплексов были выше при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата, а не рибулозо-1,5-бмсфосфата. Различия между комплексами в величинах карбоксилазной активности сохранились. Карбоксилазная активность мембраносвязанного комплекса в сравнении с свободным была выше на 30-50%. Полученные результаты давали основание полагать, что после встраивания свободного мультиферментного комплекса в мембрану изменились функциональные свойства РБФКО. Для проверки данного предположения необходимо было провести сравнительные исследования кинетического поведения РБФКО, встроенной в свободный и мембраносвязанный мультиферментные комплексы. 5.3. Кинетическое поведение рибулозо-1,5-#«сфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, встроенной в свободный и мембраносвязанный мультиферментные комплексы Результаты изучения влияния различных концентраций рибозо-5- фосфата на рибулозобисфосфаткарбоксилазную активность мультиферментных комплексов представлены - на рис.5.7 свободного, на рис.5.8 - мембраносвязанного. На рис.5.7 и 5.8 видно, что форма кривых насыщения активных центров субстратом не соответствует равнобочной гиперболе и уже при концентрации субстрата 0.3 мМ кривые имеют резкий выход на плато. При этой оптимальной концентрации субстрата величина удельной активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы мембраносвязанного мультиферментного комплекса была выше на 73% или в 1,73 раза. Для выявления причины столь значительного возрастания активности рибулозо-1,5-бмсфосфаткарбоксилазы/оксигеназы мембраносвязанного мультиферментного комплекса в сравнении со свободным комплексом

Похожие диссертации на Свободные и мембраносвязанный мультферментные комплексы цикла Кальвина и регуляция их ферментативных активностей

Формирование мультиферментных комплексов цикла кальвина и регуляция их ферментативной активности в листьях хлопчатникаЭсаналиева Шахноза Акрамовна

Регуляция активности глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы при усвоении связанного и симбиотически фиксированного азота у люпина белогоДавыдова Марина Александровна

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ И ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ УСВОЕНИИ АЗОТА ПРОРОСТКАМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙБаскакова, Софья Юрьевна

Регуляция активности апопластных пероксидаз в колеоптилях кукурузыСуслов Дмитрий Владимирович

Роль липоксигеназы в определении качества пшеницы и физиолого-генетические аспекты регуляции ее активностиПермякова Марина Диомидовна

Метаболитная и экспрессионная регуляция аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активности в растениях с разным типом метаболизмаНикитина Марина Викторовна

Некоторые аспекты регуляции цАМФ-зависимой протеинкиназной активности у растенийЗакирова, Лилия Азатовна

Исследование клеточной регуляции влияния митохондрий на фотохимическую активность хлоропластовКарсонова, Наталия Александровна

Мембранный потенциал, электрогенная активность протонного насоса и калиевые каналы плазмалеммы в регуляции синтеза полисахаридов клеточной стенкиИльина Татьяна Михайловна

Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие растенийЮшкова, Елена Ильинична