Введение к работе
актуальность проблемы. После длительной дискуссии в литературе о функционировании системы цАМФ в растениях (Amrhein, 1974; Коро-ієб, Выскребенцева, 1978) были получены новые данные о компоненте этой системы (Franko, 1983; Newton, Brown, 1986; Яворская, .990; Каримова, 1994), подтверждающие наличие ее активности в >астениях. Одним из ключевых звеньев цАМФ-мессенджерной системы [вляются цАМФ-зависимые протеинкиназы. Существуют единичные ра-юты по определению их активности в растениях (Kato et al., .983; Newton, Brown, 1987; Каримова и др., 1991). В то же время і литературе есть ряд работ, где авторы не могли* обнаружить jAN№-зависимую протеинкиназную активность в растениях (Carraty >t al., 1984; Reddy et al., 1987); были и случаи, когда зкзоген-[ый цАМФ подавлял протеинкиназную активность" (Kato et al., 1983; larkwell et al., 1983; Романко и др., 1991). Определению \ММ>-зависимой протеинкиназной активности в грубых экстрактах іастений могут мешать АТФазы, протеазы, другие протеинкиназы ;СогЫп, 1983) и в особенности фосфопротеикфосфатазы (ФПФ) -юрменты, катализирующие процесс дефосфорилирования белков, ко-юрый идет одновременно с процессом фосфорилирования. Высокую активность ФПФ в растениях и регуляцию их активности специфически ингибиторами продемонстрировали в своих работах Mackintosh 1990), Kauss et al., (1991), Cohen et al., (1992), Каримова .1994) и другие исследователи.
Регуляция фосфорилирования белков растений цАК№-зависимыми [ротеинкиназами и роль протеинфосфатаз при этом является в нас-оящее время актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы Сыло изу-:ение цАМФ-зависимой протеинкиназной активности и роли ферментов ;ефосфорилирования - фосфопротеинфосфатаз в регуляции уровня юсфорилированности белков в клетках высиих .растений.
В задачи исследования входило:
выявить цАМФ-зависимую протеинкиназную активность в экс-рактах из растений с помощью их высокоспецифичного белкового нгибитора и влияние на нее условий проведения опытов;
выявить роль фосфопротеинфосфатаз в регуляции уровня фосфо-илированности белков растений, в том числе цАМ""*-зависимого;
Научная новизна работы. С помощью высокоспецифичного белково-
- 4 -го ингибитора цАКй>-зависимых протеинкиназ ("Алга", С.-Петербург и "Sigma" USA) впервые показано, что цАМФ-зависимые протеинкина-зы могут быть активированы в разной степени уже в процессе приготовления гомогената и выделения белков, что может быть одной из причин трудностей в определении активности ферментов в тканях растений. Впервые в тканях растений выявлено влияние детергентов (додецилсульфата натрия и тритона Х-100) на цАМФ-зависимую протеинкиназную активность.
Показано, что ингибиторы фосфатаз в разной степени увеличивали содержание фосфорилированяых белков растений в зависимости от вида ингибитора. Впервые показано изменение спектра фосфорилиро-ванных белков при действии ингибитора фосфатаз вольфрамата в высокой концентрации: увеличение фосфорилированности большого числа полипептидов, в том числе гиперфосфорилирование отдельных по-лилептидов, и одновременное изменение степени их цАМФ- и Са2+-зависимого фосфорилирования. Специфический ингибитор тиро-зинпротеинфосфатаз, ванадат натрия (ЮмМ), вызывал усиление степени фосфорилированности белков, фосфорилируемых Са2+-зависимым способом.
Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание физиолого-биохимических механизмов, лежащих в основе регуляции клеточной активности растений. Выявленная роль ингибиторов фосфатаз: вольфрамата, молибдата и ванадата натрия, активируемого ими фосфорилирования белков и связанное с ним изменение степени цАМФ- и Са2+-зависимого фосфорилирования объясняет механизм высокой токсичности этих солей - антропогенных стрессоров и является базой для создания более эффективных биотехнологических приемов Еыращивания растений.
Полученные результаты можно использовать в учебном процессе при чтении лекций.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 3-м съезде ВОФР (С.-Петербург, 1993); 11-м съезде Украинского общества физиологов растений (Киев, 1993); 9-м конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Чехия, Брно, 1994); научных конференциях КНЦ РАН (Казань, 1993-1995), XI конференции физиологов растений Югославии (Нови Сад, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ и подана в печать 1.
- 5 -Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на /( страницах машинописного текста, содержит -ЗФрисунков, /О таблиц. Слисок использованной литературы состоит из-і^У наименований, из них /<Яна иностранном языке.
Основные исследования выполнены на корнях зеленых растений и этиолированных проростках гороха Pisum sativum L. 2-12 дневного возраста, выращенных в лабораторных условиях на 1/4 среды Хот-ланда-Арнона под люминостатом (или в темноте).
Гомогенизацию проводили при 4С в среде, состоящей из 50 мМ трис-буфера (рН 7,5); 1 мМ дитиотреитола (ДТТ); 1 мм фенилметил-сульфонилфторида (PMSF); 250 мМ сахарозы; 0,1 мМ теофилина; ЮмМ ЭДТА; 3% поливинилпирролидона (ПВП) и ингибиторов фосфатаз (где указано;. Гомогенат центрифугировали 3 минуты при 20000 g. Анализу подвергали супернатант и осадок, гомогенизированный в 500 мкл среды гомогенизации.
Грубую фракцию ядер получали по методу Дроевского и др. (1986) из корней 19-дневных зеленых растений гороха, выращенных под люминостатом (освещенность 10 кЛюкс) при 25 С.
Протеинкиназная активность определялась по методу Kikkawa et al. (1983) с модификациями (Каримова и др., 1991) во фракциях гомогената. Реакционная среда объемом 100 мкл содержала: 50 мМ PiPES-буфер рН 6,5; 5 MM MgCl2; 1 мМ ДТТ; 0,5 мМ АТФ; [Г-згР]-АТФ (500-800 тыс.имп-мин-1); 15-30 мкг белка; ЮмкМ цАМФ и различные ингибиторы фосфатаз (где указано). Радиоактивность просчитывали в толуольном сцинцилляторе (ЖС-1) на "Дельта-300 (США). Удельную активность фермента выражали е пмоль 32Р/мг белка в минуту. Проводился контроль на неспецифическое связывание 32Р на фильтрах. Содержание белка определяли по Лоури в осадках ТХУ. Параллельно пробы использовались для электрофореза белков по Laemmll (1970) в полиакриламидном геле с 0,1%-ным додецил-сульфатом натрия (SDS) с линейным градиентом 6-16% акриламида. Электрофореграммы фиксировали 50% этанолом и окрашивали 0,1% раствором Кумасси R-250. Радиоавтографию получали при экспозиции геля 14 дней при -20С. Электрофореграммы и радиоэвтограммы сканировали на денситометра LKS 2202 ("LKB" Швеция) и ИФО-450 (Казань ) -
Фосформлирование белков in vivo проводилось за 2 часа инкубации на слабом рассеянном свету отделенных от корней стеблей с листьями или целых проростков в растворах с Э2Р-ортофосфорной кислоты, цАМФ и АБК. Затем готовился гомогенат, учитывалось поглощение 32Рн проростками и фосфоридирование белков.
Опыты проводились в 3 биологических повторностях от 2 до С раз. В таблицах и рисунках приведены средние арифметические значения и средние квадратичные ошибки. Обсуждаются различия медду вариантами, достоверные при Ро. оі-
В работе использовали [г-32Р]-АТФ ( удельная активность 100С Кюри'ммоль-1) ПО "Изотоп"' (Ташкент); 32Р-ортофосфорную кислоту (удельная активность 5000 Кюри*ммоль"1) ПО "Изотоп"; MgCls "ВДН", PIPES, ДТТ, ЭГТА, цАМФ, SDS, акрилачид и бисакриламид, Кумасси-(?-250, PMSF фирмы "Serva"; белковый ингибитор цАМФ- зависимых протеинкиназ (БИ) фирм "Sigma" (USA) и "Алга" (С.-Петербург), тритон Х-100 "Ferak"; соли вольфрамата, молибдата, вака-дата отечественные хч.
