Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1. Современное состояние и перспективы в области изучения гормонов растений 10
1.2. Открытие мембранного рецептора цитокинина-сенсорной гистндиновой киназы 12
1.3. Внутриклеточные рецепторы цитокинина 14
1.4. Гены первичного ответа на цитокинин и регуляция их экспрессии 15
1.5. Хлоропласты и цитокинины 17
1.6. Культуры меристемы - основа «безвирусного» семеноводства картофеля 19
1.7. Взаимосвязь Сахаров и гормонов 21
1.8. Гормональный контроль формирования трансляционной системы растений 25
1.9. Роль малых молекул РНК в регуляции физиолого-биохимических процессов растений 29
Глава 2. Экспериментальная часть.
Материалы и методы 33
Глава 3. Результаты исследований 39
3.1. Содержание фотосинтетических пигментов у генотипов картофеля при культивировании в условиях vitro 39
3.2. Инициация и рост клубней регенерантов картофеля in vitro 57
3.3. Синтез белков растений-регенерантов картофеля в процессе роста растений и инициации столоно-клубнеобразования in vitro 71
3.4. Действие гормонов на трансляционную активность полирибосом и поли (А) последовательностей мРНК у регенераитов картофеля in vitro 76
Глава 4. Действие водного стресса на содержание полирибосом растений-регенерантов картофеля 84
Заключение * 89
Выводы 101
Литература 104
Приложение 121
- Открытие мембранного рецептора цитокинина-сенсорной гистндиновой киназы
- Гормональный контроль формирования трансляционной системы растений
- Содержание фотосинтетических пигментов у генотипов картофеля при культивировании в условиях vitro
- Синтез белков растений-регенерантов картофеля в процессе роста растений и инициации столоно-клубнеобразования in vitro
Введение к работе
Актуальность работы. Достижения в области изучения генов, ответственных за определенные этапы развития растений их ответные реакции на стрессовые воздействия и генома растений в целом идут по нарастающей.
Познание молекулярно-физиологических механизмов адаптации растений в связи с изменениями условий внешней среды и их способности адекватно реагировать на эти изменения связано с пониманием точной и оперативной экспрессии генов. В ответ на действие экстремального фактора происходят адаптационные перестройки в растении с изменением интенсивности синтеза белков и их качественного состава (Thomashov, 1998; Плотников, 1992; Кулаева, Кузнецов, 2003).
При этом количественное изменение мРНК в клетке напрямую зависит от частоты транскрипции генов и от их процессинга в цитоплазме (Плотников, 1992; Johnson et al., 1998; Gutierrez et al., 1999).
Период полужизни индивидуальных мРНК в клетках растений в зависимости от процесса полиаделинирования может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, поскольку нуклеотидная группа КЭП на 5'-конце и поли (А)-последовательности на З'-конце защищают мРНК (эукариотических клеток) от деградации эндонуклеазами. Наличие поли (А)-последовательностей и их количество также является элементом вторичной структуры и внутренней стабильности мРНК (Ryazanov et al., 1991; Толкачеваи др., 1996).
Известно, что неспецифическое увеличение трансляционной активности полисом под воздействием обезвоживания связано с увеличением доли тяжелых полисом (Ryazanov et al., 1991). Вместе с тем обнаружено, что увеличение трансляционной активности полисом в условиях холода и обезвоживания коррелирует с усилением экспрессии гена субъединицы а-фактора элонгации трансляции (Толкачева и др., 1996).
В других работах показано, что стабильность мРНК значительно меняется под влиянием света и засухи у проростков пшеницы (Плотников и др., 2000).
Таким образом, можно предположить, что модуляция стабильности мРНК, в стрессовых условиях является одним из главных факторов системы адаптации растений. Состояние мРНК и трансляционная активность разных классов полирибосом могут в определенной степени влиять на реализацию потенциала продуктивности растений.
В связи с этим мы провели работу по изучению влияния гормонов и углеводов на трансляционную активность полирибосом и поли (А)-последовательностей мРНК регенерантов картофеля в связи с их продуктивностью в системе in vitro.
Для сельскохозяйственных культур эти вопросы практически не изучены. Для этой цели растение картофеля in vitro является уникальным объектом, особенно в молекулярной биологии и биотехнологических исследованиях.
Имеются данные о взаимозависимости уровней регуляции клубнеобразования от гормональной и углеводной системы в культивируемой среде (Vreugdenhil, Helder 1992; Simkol994; Xin-Xu et al., 1998). Эти данные не всегда можно интерпретировать однозначно. Наиболее детально изучена роль гиббереллинов на рост столонов и ингабирующий процесс инициации клубней (Xin-Xu et al., 1998; Чайлахян, 1984; Ewing, 1995). Имеются противоречивые данные в изучении конкретной роли ауксинов и цитокининов в процессе клубнеобразования in vitro. Например, цитокинины инициировали рост клубней в изолированных столонах (Palmer, Smith, 1970). Вместе с тем, использование 6-БАП (6-бензиламинопурин) не повлияло на образование клубней (Xin-Xu et al., 1998). Добавление ИУКа у одних исследователей вызывало рост клубней (Me Grady et al., 1986), а у других оказывало ингабирующий эффект (Xin-Xu et al., 1998). Таким образом, имеющиеся данные о роли ауксинов и цитокининов в процессах инициации и роста клубней у изолированных систем растений картофеля не поддаются однозначной интерпретации, что и послужило задачей настоящей работы.
В процессе инициации и роста клубней картофеля, по всей вероятности происходит поэтапная экспрессия генов, котоые регулируются углеводами и гормонами, по всей вероятности, ведущую роль играет поэтапная экспрессия генов, которые регулируются гормонами (Алиев, 1998).
В последнее время особое влияние исследователей обращено на принципы регуляции продукционного процесса и защитные реакции растений картофеля при стрессовых воздействиях, особенно фитопатогенов и водного дефицита, физиолого-биохимические основы которых далеко не полностью изучены. Одним из подходов является получение мутаций у растений картофеля путем воздействия различными стрессовыми факторами на клеточном уровне, тем или иным образом затрагивающего защитные механизмы - например, к болезням (Delaney, 1997), высоким температурам (Давлятназарова и др., 2003). Другим подходом является получение трансгенных растений, проявляющих повышенную устойчивость к фитопатогенам (Somssich, Hahlbrock, 1998), вирусам (Keen, 1992; Захарьев и др., 1989), гормонам (Аксенова и др., 1999), осмоустойчивость (Kavi Kishor etal., 1995) и т.д.
Контроль за активностью гена может осуществляться на различных уровнях: транскрипции, трансляции, процессинга, транспорта, деградации мРНК и белка. Исследование регуляции генов затруднено несовершенными методиками количественного и качественного анализа функции генов и, самое главное, отсутствием модельных систем растений. С этой точки зрения пробирочные регенеранты картофеля являются удобной модельной системой, позволяющей исследовать роль фитогормонов в регуляции роста и развития, определять устойчивость к стрессовым воздействиям и открывают возможность изучения их функциональной роли на уровне молекулярно-физиологических процессов, в клетках растений.
В литературе имеются противоречивые сведения, свидетельствующие об участии фитогормонов в развитиии стрессового ответа (Salah,Tardieu, 1996; Maleck, Lawton, 1998; Kudoyarova et al., 1998), однако ничего не известно о механизме этого процесса. Один из подходов, с помощью которого можно изучать роль фитогормонов в процессах роста, развития и стрессового ответа, является использование устойчивых к стрессовым факторам генотипов растений с измененой экспрессией гиперчувствительных генов к высокой температуре (Авганова и др., 2006)
В настоящее время еще рано говорить о конкретных механизмах действия гормонов в переключении множественных генов, экспрессия которых регулирует процессы роста, развития и продуктивности растений. Известно, что цитокинины играют нетолько регуляторную роль но и в определенных условиях определяют устойчивость растений и некоторые стрессовые факторы (Thomas et al., 1999). В последних работах, имеются сведения о том, что гормоны в сочетании с углеводами регулируют ход клубнеобразования картофеля in vitro (Аксенов и др., 2000; Назарова и др., 2004), где возможно важную роль в этих процессах играет повседневное экспрессии генов, которая также слабо изучена. Однако конкретные механизмы действия гормонов и углеводов в процессе микроклубнеобразования не достаточно изучено. Не ясно их молекулярная и физиологическая основа. По этой причине познание молекулярно-биологических механизмов взаимодействия гормонов и углеводов в процессе роста, развития и клубнеобразования картофеля и их физиологической основы на удобном объекте как растений-регенерантов, имеют общебиологическое значение и являются актуальной задачей.
Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - изучение влияния фитогормонов и водного стресса на инициацию и рост клубней, синтез белков, формирование полирибосомных комплексов и поли (А)-содержащих РНК в процессе роста и развития регенерантов разных генотипов картофеля in vitro.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи: выявление оптимальных условий микроклубнеобразования растений-регенерантов картофеля in vitro; изучение поли (А)-содержащих РНК при гормональном воздействии на различных стадиях клубнеобразования растений-регенерантов картофеля in vitro; изучение полирибосом регенерантов картофеля in vitro в условиях температурного и водного стресса; определение содержания фотосинтетических пигментов при гормональном воздействии на регенеранты картофеля in vitro; изучение содержания и активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Рубиско) регенерантов картофеля in vitro при температурном и водном стрессе.
Научная новизна. Отчетливо проявились различия в регуляции фазы инициации и фазы роста клубней при использовании ауксинов и цитокининов в культуральных средах выращивания растений картофеля in vitro. Фаза инициации и фаза роста клубней независимо от генотипов картофеля при более высокой концентрации фитогормонов ускоряются при более низком содержании сахарозы в культуральной среде и, наоборот, при низких концентрациях гормонов инициация происходит при более высоком содержании сахарозы в системе in vitro. Регуляция этих процессов связана с активной экспрессией генов и появлением новых белковых компонентов. Влияние фитогормонов на сырую массу клубней (урожай) было эффективным при действии кинетина на рост и НУК на инициацию образования клубней. На начальных этапах инициации столонов доля поли (А)+ последовательностей мРНК выше, чем поли (А)^ мРНК. В период закладки и активного роста клубней наблюдается увеличение доли поли (А)++ мРНК. Количество поли (А)+ содержащих мРНК в эти периоды клубнеобразования не изменяется. Следовательно, на разных этапах формирования клубней проявляется активность разных по набору групп генов. В период инициации столонов и закладки клубней активную роль играют группы генов с короткими поли (А)+ последовательностями мРНК, В фазе интенсивного роста участвуют другие гены- с большим набором поли (А)"*"1" последовательностей мРНК.
Практическая значимость работы. Содержание полирибосомных комплексов можно использовать как тест на действие дефицита воды на экспрессию генома и, возможно, стрессов вообше. При получении микроклубней in vitro большое значение имеет соотношение фитогормонов и сахарозы. Разработана биотехнология получения микроклубней картофеля больших размеров с использованием пробирок больших размеров.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены/ представлены на следующих конференциях и симпозиумах:
Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений, Душанбе 2004;
International symposium Transgenic plants and biosafety, Moscov, 2004;
Республиканский симпозиум «Экономика и наука Горно-Бадахшанской автономной области: прошлое, настоящее, будущее», Хорог, 2005;
Научно-практическое совещание «Использование оздоровленного материала в семеноводстве картофеля», Муминабад, 2005;
Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, -Россия 2005г;
International Congress BioVision Alexandria, 2006.
Структура и объем работы: Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (3 главы), выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 129 стр., содержит 24 рисунка, 9 таблиц. Количество цитированных источников 137.
Публикации. По материалам диссертаций опубликовано 10 работ.
Открытие мембранного рецептора цитокинина-сенсорной гистндиновой киназы
Мембранный рецептор цитокинина также был открыт независимо в двух лабораториях в Японии в 2001г. Он принадлежит к классу биокомпонентных регуляторных систем бактерий ( Stock et ah, 2000). Он участвует в явлениях хемотаксиса, осморегуляции, фоточувствительности и патогенезе и состоит из двух белков: трансмембранного сенсорного белка, содержащего на цитоплазматическом С-конце гистидиновую протеинкиназу, которая вызывает фосфорилирование консервативного гистидина в ответ на внешний сигнал, и второй цитоплазматический белок -регулятор ответа, который содержит консервативный остаток аспарагиновои кислоты, на который передается фосфатная группа с гистидина сенсорной молекулы.
Большим событием в изучении регуляторных систем растений явилось открытие того, что рецептор этилена также относится к биокомпонентной регуляторной системе с гибридным типом гистидиновой протеинкиназы, объединяющей в себе сенсор и регулятор ответа (Bleecker et aL, 2000). Как упоминалось выше, были открыты у растений A.thaliana рецепторы цитокинина, организованные по принципу биокомпонентной регуляторной системы. Inoue с соавторами (Inoue et al., 2001) получили мутант ere 1-1 Arabidopsis с ослабленным ответом на цитокинин. Авторы получили 2 клона CRE-la и CRE-lb первый кодирует полипептид из 1057 аминокислотных остатков, второй ген кодирует полипептид, содержащий на N-конце молекулы на 23 аминокислоты больше. Судя по нуклеотидной последовательности кДНК, кодируемый ею рецептор цитокинина CRE-Іна N-конце содержит трансмембранные участки, указывающие на локализацию белка на плазмолеме. Эти участки ограничивают с двух сторон внеклеточный домен, который участвует в связывании экзогенного цитокинина. Это событие должно привести к активации гистидинкиназы, локализованной на С-конце рецептора его трансмиттерным цитоплазматическим доменом. В результате должен фосфорилироваться консервативный гистидиновый остаток (His 459) трансмиттерного домена с последующей передачей фосфатной группировки на консервативный остаток аспаригиновой кислоты в воспринимающем домене той части рецептора, котороя является регулятором ответа.
Способность CRE-1 действительно участвовать в запуске фосфатного каскада была доказана в опытах с мутантом дрожжей slnlA, у которого был повреждён ген SLN 1- осмосенсорной гистидиновой киназы. Повреждение SLN 1- у мутанта приводит к гибели клеток в отсуствии галактозы. Трансфотмация slnlA мутанта генома предпологаемого рецептора цитокинина CRE-1 не устраняла летальность мутанта в отсуствии цитокинина, но если в среду добавляли цитокинин, мутант преобретал способность к нормальному росту на безгалактозной среде.
Следовательно, цитокинин активировал в клетке гистидиновую проитеинкиназу CRE-1, которая заменяла повреждённую сенсорную киназу SLN 1, и это приводило к передаче фосфатной группы по цепи сигнала, вызывая процессы, необходимые для выживания клеток в отсуствии галактозы в клетке.
В Японии С. Ueguchi и др., (Ueguchi et al., 2001.) выделили из А. thaliana 3 гена сенсорных гистидиновых киназ: АНК2, АНКЗ, АНК4. В этой лаборатории было доказано, что сенсорная гистидиновая киназа A. thaliana АНК4 способна осуществлять цитокинин-зависимую передачу фосфатной группировки по цепи фосфатного сигнала в трансформированных геномом АНК4 клетках Е соІІ (Suzuku, 2001). Таким образом, мембранный рецептор CRE-1/AHK4 способен встраиваться в регуляторные цепи в клетках дрожжей и бактерий и выполнять цитокинин-зависимую передачу сигнальной фосфатной группировки (Inoue et al.. 2001; Ueguchi et al., 2001; Suzuku etal., 2001).
Партнёры CRE-1/AHK4 в растительных клетках, на которые передается сигнал с рецепторной молекулы, пока не известны. В A. thaliana обнаружено 5 генов, кодирующих фосфотрансмиттеры АНР1-АНР5 (Tmamura et al., 1999). АНР1 и AHP2 имеют цитоплазматическую локализацию, но цитокинин вызывает их перемещение в ядро (Hwang, 2001) следовательно, они участвуют в передаче цитокининового сигнала в клетках.
Цитокинины поступают не только извне, но и присутствуют внутри растительных клеток. Есть данные о содержании цитокининов в цитоплазме и ядрах (но не в вакуолях) в развивающихся соматических эмбриоидах Dactylis glomerata L. (Ivanova et al., 1994) и в терминальных почках томатов (Sossountzov, 1998).
Из цитозолей и ядер клеток ячменя были выделены белки (67 кД) со свойствами рецепторов цитокинина (Kulaeva et al., 1995), участвующих в комплексе с физиологически-активными цитокининами в регуляции транскрипции в системах iv vitro (Kulaeva et al., 1995; Селиванкина и др., 2001). Высокая специфичность во взаимодействии 67 кД белка с природным цитокинином транс-зеатином была доказана в опытах по его конкуренции с антиидиотипическими антителами - AT в образовании комплекса с иммобилизованным 67 кД белком (Kulaeva et al., 1998).
Удалось доказать, что цитокинин - белковый комплекс активирует фактор элонгации транскрипции как РНК-полимеразой I, так и РНК-полимеразой II в ядрах (Kulaeva et al., 1995; Селиванкина и др., 2001).
Принадлежащий к этому семейству ЦСБ 70 Кд был выделен из этиолированных проростков кукурузы (Бровко и др., 1996). Имел общие иммунодетерминанты с ЦСВ 67 кД и заменял его в активации транскрипции /v vitro. В системе из листьев ячменя (Бровко и др., 1996; Kulaeva et al., 1998) преимущественно лаколизован в меристеме корня (Шепеликовская и др., 2002).
Гормональный контроль формирования трансляционной системы растений
Одним из важнейших показателей белоксинтезирующей активности клетки является содержание и состояние рибосом. Известно, что в хлоропластах рибосомы находятся в двух состояниях: свободном и связанном с мембранами. Увеличение количества мембраносвязанных рибосом совпадает с усилением функциональной активности хлоропластов [Рахмихудоев, 1980]. Имеются многочисленные данные по действию фитогормонов на синтез РНК и белков растений.
Как было сказано выше, по мере развития хлоропластов содержание мембраносвязанных рибосом резко увеличивается, а количество свободных остается практически неизменным, т.е. по мере дифференциации хлоропластных мембран количество связанных с мембранами рибосом существенно возрастает [Рахмихудоев, 1980]. Это увеличение мембраносвязанных рибосом совпадает с усилением синтеза белка в хлоропластах с процессом формирования тилакоидных гран и, следовательно, приводит к увеличению функциональной активности хлоропластов. В работе Рахмихудоева Г. (1980) показано, что кинетин поддерживает более высокий уровень накопления свободных рибосом в ходе развития хлоропластов, чем у контрольных растений. В то же время резко усиливается включение рибосом в состав мембран. Так, в первые часы развития хлоропластов, кинетин оказывает незначительное влияние на связывание рибосом с мембранами, а после 10-часового освещения этот процесс повышается в 3 раза.
Далее мы исследовали действие кинетина на полисомообразование в ходе развития хлоропластов. Полученные результаты указывают на то, что кинетин усиливает включение 3Н-уридина в гетерогенную фракцию градиента концентрации сахарозы. Наблюдается также включение метки в область моносом. Соотношение радиактивности полисом к моносомам при действии кинетина увеличивается в 3-4 раза по сравнению с контрольными растениями [Алиев, Васильева, 1976].
Анализ РНК хлоропластов в градиенте концентрации сахарозы показал увеличение локализации радиоактивности в области мРНК, а также в области рРНК при добавлении кинетина. В присутствии кинетина наблюдается более гетерогенное распределение радиоактивности в зоне мРНК, чем у контрольных. У контрольных растений наблюдалось небольшое включение метки в области рРНК и мРНК хлоропластов [Алиев, Васильева, 1976].
Таким образом, эти данные указывают, что кинетин не только активирует транскрипцию хлоропластных рРНК и мРНК, но и повышает содержание мембраносвязанных рибосом на фоне незначительно изменяющегося количества моносом в хлоропластах. Эти результаты подтверждают точку зрения, согласно которой действие гормона на мембраносвязанном уровне проявляется раньше, чем на уровне трансляции [Рахмихудоев, 1980]. Можно допустить, что действие цитокинина на мембраносвязанные рибосомы играет определенную физиологическую роль в регуляции процессов, приводящих к усилению экспрессии хлоропластных генов и дифференциацию пластид.
В процессе биогенеза хлоропластов происходит увеличение «объема» трансляционного аппарата, сопровождающееся увеличением количества мембраносвязанных рибосом и уменьшением фракции свободных рибосом.
Кроме того, кинетин усиливает содержание мембраносвязанных рибосом после 5-часового развития хлоропластов, в то же время усиленное включение радиоактивных предшествеников в эти рибосомы начинается только после 10-часового развития органелл. Следовательно, быстрое формирование мембраносвязанных рибосом при наличии кинетина в первые часы развития хлоропластов осуществляется за счет имеющихся в хлоропластах свободных рибосом, вместе с тем, в момент интенсивного гранообразования, поскольку синтез рРНК и мРНК стабилизируется кинетином. В формировании мембраносвязанных рибосом участвуют вновь синтезированная мРНК и рибосомы (Алиев, 1998).
Таким образом, анализ полученных результатов показывает, что кинетин играет регуляторную роль в процессах связывания рибосом с мембранной системой хлоропластов и, следовательно, усиливает активность белоксинтезирующей системы и таким путем может контролироватся уровень экспрессии генома на разных этапах морфогенеза,
Механизм поддержания меристемы и регуляции клеток в меристеме происходит на разных уровнях. Прежде всего, путем поддержания определенного числа инициальных клеток и регуляции активности деления. По некоторым данным, клетки покоящегося центра (ПЦ) регулируют поведение прилегающих к ним активно делящихся клеток, хотя предпологается, что поведение клеток ПЦ зависит от состояния меристемы (Feldman, 1977). Механизм этого до сих пор неясен, но для апикальных меристем стебля четко показано наличие обратной связи между размером и активностью меристемы (их центральной части). Размер ПЦ коррелируется с размерами меристемы и с растениями, на которых проявляется дифференцировка разных тканей. Например, чем больше размеры ПЦ, тем дальше от кончика корня проявляется дифференцировка метаксилемы (Ivanov, 2002). Такой эффект связан с корреляцией между числом клеток в ПЦ и числом клеток, переходящих из него к активным делениям. Вместе с тем предполагается участие неких белков и мини-мРНК, ПЦ в дифференцировке клеток. Разрушение или инактивация клеток ПЦ может нарушить пути транспорта белков, мРНК и др. соединений, влияющих на поведение клеток. В этих процессах также рассматривается участие гормонов (ИУК). Кроме того, клетки ПЦ делятся, и число их может меняться. Возможно, периодически они образуют новые клетки, переходящие к активному делению или, напротив, часть активно делящихся клеток может возвращаться в покоящееся состояние. Направление этого процесса регулируется в зависимости от состояния основной массы клеток меристемы.
Содержание фотосинтетических пигментов у генотипов картофеля при культивировании в условиях vitro
В последнее время внимание многих исследователей обращено на механизмы регуляции клубнеобразования у картофеля в системе in vitro. Имеются данные о зависимости уровня регуляции клубнеобразования от гормональной системы и метаболизма углеводов в культивируемой среде (Vreugdenhil, Helder, 1992; Simko, 1994; Xin-Xu et al, 1998). В регуляции процессов клубнеобразования картофеля, по всей вероятности, ведущую роль играет поэтапная экспрессия генов, которые контролируются гормонами и, возможно, углеводами (Алиев, 1998). Имеющиеся данные не всегда можно интерпретировать однозначно. Кроме того, остается много неясного относительно роли фитогормонов в процессе клубнеобразования. Так, наиболее детально изучена роль гиббереллинов в росте столонов и ингибирующий процесс инициации клубней (Xin-Xu et al, 1998; Чайлахян, 1984; Ewing, 1995). Имеются противоречивые данные о роли ауксинов и цитокининов в процессе клубнеобразования in vitro. Например, цитокинины инициировали рост клубней в изолированных столонах (Palmer, Smith, 1970). Вместе с тем, использование 6-БАП (6-бензиламинопурин) не повлияло на образование клубней (Xin-Xu et al, 1998). Имеющиеся данные о роли ауксинов также неоднозначны. Так, добавление ИУК в опытах у одних исследователей вызывало рост клубней (Me Grady et al., 1986), а у других оказывало ингибирующий эффект (Xin-Xu et al, 1998). Таким образом, имеющиеся данные о роли ауксинов и цитокининов в процессах инициации и роста клубней в изолированных системах растений картофеля не поддаются однозначной интерпретации.
В связи с этим целью данной работы было сравнение степени инициации и роста клубней in vitro у различных генотипов картофеля в зависимости от добавления к культивируемой среде фитогормонов ауксинов и цитокининов. Представленные на рис.13 данные показали, что добавление к культивируемой среде фитогормонов существенно активизировало воздействие на инициацию и размер клубней. Кривая зависимости процесса инициации и роста клубней от концентрации фитогормонов определяется генотипом растений. Как видно из данных рис, 13, кинетин существенно влияет на инициацию клубней как у исходного сорта (Жуковский ранний), так и у ТУ-растений-регенерантов картофеля. Уровень этих процессов во многом определяется соотношением концентрации сахарозы и кинетина в культивируемой среде и чувствительностью генотипа растений к этим стимулирующим факторам клубнеобразования. Высокая стимуляция инициации клубней кинетином проявилась при содержании сахарозы от 5 % до 7 % у исходного сорта Жуковский ранний (контроль) и у ТУ-растений-регенерантов от 7 % до 9 % сахарозы, т. е. каждому генотипу свойственна различная чувствительность к концентрации сахарозы. Кроме того, инициирующий эффект кинетина зависел не только от концентрации сахарозы, но и от концентрации кинетина в культуральной среде. Так, при низких концентрациях кинетина высокий уровень инициации клубнеобразования был при более высокой концентрации сахарозы (5-7 %), тогда как при более высокой концентрации кинетина инициирующая активность проявилась при более низких концентрациях сахарозы (3-5 %). Действие НУК на инициацию клубней оказалось более сильным и однообразным. На фоне низкого содержания сахарозы для культивирования исходного сорта Жуковский ранний и ТУ-растений-регенерантов наблюдалась стимуляция инициации клубней под действием НУК (рис.13). При 3 % содержании сахарозы концентрация НУК практически не оказывала влияния на инициацию клубней у обоих генотипов картофеля. При более высокой концентрации сахарозы эффект от действия НУК проявлялся только у исходного сорта Жуковский ранний (контрольный вариант), тогда как у ТУ-растений-регенерантов НУК не оказывала существенного влияния на инициацию клубней. Необходимо отметить некоторые особенности реакций каждого генотипа на инициацию клубней под влиянием НУК. У ТУ-растений-регенерантов НУК оказывала существенное влияние при более высокой концентрации сахарозы (7-10 %), тогда как у исходного сорта Жуковский ранний эффект от действия НУК проявился при 5-7 % содержании сахарозы.
Различное сочетание фитогормонов и сахарозы существенно оказывало влияние на морфологические особенности регенерантов и процессов микроклубнеобразования (рис.14). Из этих рисунков видно, что высокая концентрация кинетина и сахарозы давали укорочений стебель, изменение корневых волосков, образоввание столонов, влияла на размер и цвет образующихся микроклубней in vitro.
Синтез белков растений-регенерантов картофеля в процессе роста растений и инициации столоно-клубнеобразования in vitro
Характерным для обоих вариантов опыта были различия в стимуляции процесса инициации клубней под влиянием ауксина. Цитокинин способствовал ускорению роста и повышению роста клубней.
Таким образом, фаза инициации и фаза роста клубней независимо от генотипов картофеля требуют различных концентраций фитогормонов, и эти процессы зависят от концентрации сахарозы в культивируемой среде. Уровень потребности растений в этих веществ имеет генотипическую зависимость. Вместе с тем, следует особо отметить, что сахароза в комплексе с фитогормонами может играть в процессе клубнеобразования двоякую роль: индуцирующую и энергетическую (образование новых клеток в процессе морфогенеза). Более того, индуцирующая роль сахарозы в сочетании с действием ауксина важна для инициации процессов клубнеобразования, тогда как энергетическая в сочетании с действием цитокинина больше имеет значение для их роста.
Инициация и рост клубней независимо от генотипов картофеля при более высокой концентрации фитогормонов ускоряются при более низком содержании сахарозы в культивируемой среде и, наоборот, при низких концентрациях гормонов инициация происходит при более высоком содержании сахарозы в системе in vitro.
Влияние фитогормонов на сырую массу клубней (урожай) в расчете на одну пробирку явилось эффективным результатом действия кинетина и НУКа на процессы инициации и рост клубней (табл. 4). Биомасса клубней увеличивалась у исследованных генотипов под влиянием фитогормонов и всегда была выше в несколько раз по сравнению с биомассой клубней, получаемых в культивируемой среде без гормонов. И эти различия отчетливо проявились при различном содержании сахарозы в культивируемой среде.
Наиболее низким был урожай у ТУ-растений-регенерантов, особенно у линии А. Фитогормоны в сочетании с сахарозой стимулировали урожай в большей степени у линии Б, но незначительно влияли на линию А. Эти результаты указывают на то, что взаимодействие фитогормонов и углеводов является основным фактором повышения продуктивности при выращивании растений в системе in vitro и, возможно, растения картофеля в целом, природа которого до конца не выяснена. Обнаружена, обратная зависимость морфогенетической потенции столоновых регенерантов. Можно предположить, что фитогормоны и углеводы инициируют активацию одних и тех же генов, которые регулируют фазы инициации и фазы роста клубней. Проверка данного предположения стала задачей следующих наших экспериментов. Для анализа синтезируемых белков пробирочных растений использовали методы гель-электрофореза в денатурирующих условиях (0,1% додецильсульфат натрия).
Нами в работе (Мирзохонова и др., 2004) было показано, что рибосомы обратимо связаны с мРНК при снятии действия водного дефицита растений картофеля. Было выдвинуто предположение, что ассоциации и диссоциации полисом носят адаптивный и генотипический характер. При создании водного дефицита у одних генотипов происходило разрушение полисом, у других полисомы мигрировали в области низких концентраций градиента сахарозы. В этих условиях важно было уточнить качественные и количественные характеристики белков растений, мигрирующих верх при центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы.
На удобном объекте - регенерантах картофеля-изучено влияние различных факторов (углеводов, гормонов) на трансляционную активность и седиментационные свойства полирибосом. Наше внимание также было сфокусированно на исследовании белков в денатурирующих условиях при воздействии углеводного и фитогормонального фактора при культивировании регенерантов картофеля в условиях ш vitro. Предполагается, что среди этих белков могут находиться регуляторные белки, играющие важную роль в трансляционной активности рибосом. В зависимости от гормонального и углеводного воздействия может активироваться экспрессия различных групп генов, ответственных за процесс инициации столоно-клубнеобразования и изменения размера клубней в условиях in vitro.
Для исследований использовали 20-25 дневные пробирочные растения картофеля {Solanum tuberosum L.) сорта Жуковский ранний и его температуроустойчивую линию, полученную нами ренее, а также сортов Кардинал и Пикассо, которые являются самыми распространивши в Республике Таджикистан (кроме температуроустойчивой линии - ТУ-растений-регенерантов).
Пробирочные оздоровленные растения картофеля являлись оптимальной моделью для исследования молекулярно-физиологических механизмов in vitro. В этой модельной системе было успешно решена проблема стерильности опытов, столь необходимой при работе с транскрипционной и трансляционной компонентами растительной клетки.
Пробирочные растения поддерживали микрочеренкованием in vitro. Растения выращивали в стандартных (20 х 200мм) и в некоторых экспериментах (32 х 250мм) биологических пробирках. Пробирки были закрытыми ватно-марлевыми пробками. В качестве культивационной среды использовали МС с добавлением 0,6 % агара, 0,1мг кинетина, 0,5мг НУК.
Белки на ПААГ-е распределялись в диапазоне от 10 до 90 кД, что соответствует результатам работы (Rajapakse et al., 1991), проведенной на микроклубнях картофеля. Анализ белков позволил выявить некоторые различия в вариантах с использованием кинетина и НУК. Эти различия между вариантами обнаружились в опыте с белками с молекулярной массой 22кД, 27кД, 53Кд, 70кД, 90 кД, интенсивность которых менялась от наличия в культуральной среде кинетина или НУК.
