Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Исследование механизмов интеграции внутриклеточных органелл необходимо нс только для получения фундаментальных знаний по физиологии клетки, но и для изучения возможности управления продукционным процессом целого растения.
В функционировании клетки живого организма одним из важнейших элементов является се энергообеспечение. В этом плане клетки растений уникальны, так как в них совмещены две энерготрансформирующие системы — хлоропласта и митохондрии. Являясь полуавтономными органеллами, имеющими собственные ДНК ,и белоксинтезирующий аппарат, обладающими однотипными системами генерации энергии, они функционируют в едином пространстве, называемом цитозолем, и не могут существовать без взаимодействия с другими клеточными структурами и друг с другом. Наиболее полно изучено их взаимовлияние на генетическом и метаболитном уровнях, получены доказательства возможности существования прямых контактов между хлоропластами и митохондриями в определенных условиях.
Мало изученным остается взаимовлияние этих органелл на энерготрансформирующие функции друг друга. Т.к. исследование этого вопроса in vivo крайне затруднено, в лаборатории фотосинтеза Института экспериментальной ботаники НАНБ под руководством доктора биологических наук В.М.Иванченко был впервые предложен метод изучения взаимодействия хлоропластов и митохондрий in vitro. Уже первые эксперименты дали возможность предположить существование неописанного ранее механизма взаимовлияния этих органелл на электронный транспорт (ЭТ) и образование АТФ в них. Поэтому было правомерным продолжить исследования в этом направлении.
Связь с крупными научными программами, темами. Исследования выполнены в рамках госпрограммы фундаментальных исследований и входили в плановые темы Института экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купрсвича НАНБ: «Эпигенетическая регуляция активности фотосинтетического аппарата в связи с условиями произрастания растений» (№ г.р. 01850010153, 1985-1988 гг.); «Взаимодействие хлоропластов и митохондрий посредством белков-регуляторов» (№ г.р. 01890023819, 1989-1992 гг.); "Физиология и биохимия регуляторного взаимодействия хлоропластов и митохондрий", (№ г.р. 1993387; 1993-1995 гг.); "Физиология и биохимия регуляции реакций переноса энергии в хлоропластах и митохондриях эндогенными водорастворимыми факторами", (№ г.р. 1997336; 1997-2000 гг.)
Цели и задачи исследовании. Цель работы: исследовать механизм и особенности действия митохондрий на фотохимическую активность хлоропла-
стов in vitro, определить природу этого влияния. Для этого необходимо было решить следующие задачи:
исследовать действие митохондрии на кинетику реакций Хилла и фо-тофосфорилирования (ФФ);
установить специфичность действия митохондрий из корней и листьев на ЭТ и ФФ в хлоропластах, а также сравнить влияние митохондрий разных видов растений на их хлоропласта;
изучить влияние присутствия хлоропластов в среде инкубации па скорость выхода эффектора из митохондрий;
определить природу эффектора;
исследовать его действие на хлоропласта различного структурного состояния;
выделить из митохондрий разобщитель реакции ФФ и получить его биохимические и физические характеристики.
Объект и предмет исследования. Обг>сктом исследования служили хлоропласта и митохондрии проростков гороха сорта Вегетативный желтый, элита. Предметом исследования были изменения фотохимической активности хлоропластов гороха и их связь с водорастворимыми белковыми эффекторами из митохондрий корней проростков гороха.
Методология и методы проведенного исследования. Были осуществлены модельные эксперименты, в которых хлоропласта и митохондрии помещались в единую среду и исследовалось непосредственное влияние митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов in vitro. Для определения фотохимической активности хлоропластов использовали стандартные и модифицированные автором методики. Для изучения природы действующего вещества использовали биохимические и спектрофотометрнчсскис методы. Для очистки эффектора, а также определения его молекулярного веса использовали гель-фильтрацию и электрофорез в полиакриламидном геле (ПАЛГ).
Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые изучено влияние митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов in vitro и выявлен механизм этого влияния. Идентифицированы эффекторы, изменяющие энерготрансформирующие функции хлоропластов. В результате проблема внутриклеточного энергообеспечения в растительной клетке приобретает статус более высокой структурно-функциональной организации взаимодействия органелл и этим способствует разработке путей управления фотосинтезом и дыханием как главными составляющими продукционного процесса. Кроме того, новые знания взаимосвязанности функций хлоропластов и митохондрий являются основой для переосмысления существующих представлений о данном предмете и могут использоваться в ВУЗах.
Практическая значимость полученных результатов. Полученные результаты указывают на существование неописанного механизма интеграции хлоропластов и митохондрий на уровне трансформации энергии. Они имеют не только фундаментальное значение, но представляют также практический интерес для физиологов растений и фотобиологов, так как обнаруженные эффекторы, действуя на фотохимическую активность хлоропластов, могут выполнять в клетке роль регуляторов скоростей ФФ и ЭТ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения: 1) особенности фотохимической активности хлоропластов in vitro в присутствии митохондриальных эффекторов; 2) идентификация природы митохондриальных эффекторов, механизм их действия.
Личный вклад соискателя. Весь представленный экспериментальный материал получен и обработан лично автором или при его активном участии. Автором предложена модифицированная методика определения фотохимической активности хлоропластов в одном образце для получения кинетических кривых ЭТ и ФФ, а также разработаны методические подходы для выделения изучаемых эффекторов из митохондрий.
Апробация результатов диссертации. Результаты работы были представлены на IV конференции молодых ученых ИПФС АН СССР, г. Пущино-на-Оке, 1989 г.; IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, г. Минск, 1990 г.; II съезде Всесоюзного общества физиологов растений, г. Минск, 1990 г.; III съезде Всероссийского общества физиологов растений, г. Санкт-Петербург, 1993 г.; I съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков, 1994 г.; II съезде Белорусского общества физиологов растений, г. Минск, 1995 г.
Опублнкованность результатов. Основные положения работы опубликованы в 6 статьях (из них 4 — в научных журналах, 2 — в сборниках работ) и 5 тезисах. Общее количество страниц опубликованных материалов — 33.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 103 стр. машинописного текста, включая 27 рисунков и 1 таблицу, и состоит из введения, общей характеристики, 3 глав, заключения, списка литературы (148 источников, из них 59 на иностранном языке).
