Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Проблема сохранения исчезающих, редких и лекарственных видов растений 10
1.2. Фундаментальные аспекты морфогенеза 13
1.3. Культура in vitro растений семейства Бобовые 18
1.3.1. Растения рода Astragalus L. in vitro 26
1.4. Биологическая характеристика растений рода Astragalus L. 31
Глава II. Объект и методы исследований 36
2.1. Описание объекта исследования 36
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выбор исходного материала и первичного экспланта 41
2.2.2. Стерилизация растительного материала 41
2.2.3. Условия культивирования изолированных органов растений астрагала 42
2.2.4. Укоренение и адаптация микроклонов к условиям in vivo 43
2.2.5. Культивирование микропобегов астрагала в условиях разного
спектрального состава света 44
2.2.6. Получение растительных экстрактов из микрорастений астрагала 45
2.2.7. Статистическая обработка данных 48
Экспериментальная часть 49
Глава III. Технология клонального микроразмножения растений рода Astragalus L . 49
3.1. Размножение астрагала монгольского 49
(Astragalus mongholicus Bge.) в условиях in vitro 49
3.2. Размножение астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.) в условиях in vitro з
Глава IV. Влияние светодиодных ламп разного света на морфогенетическую активность клеток астрагала монгольского и астрагала приподнимающегося в условиях in vitro 66
4.1. Влияние светодиодных ламп разного света на клональное микроразмножение астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) 69
4.2. Влияние светодиодных ламп разного света на клональное микроразмножение астрагала приподнимающегося 79
Глава V. Изучение цитотоксичности растительных экстрактов, полученных из микропобегов astragalus mongholicus bge. и astragalus adsurgens pall. 90
5.1 Изучение цитотоксичности растительных экстрактов, полученных из надземной биомассы растений астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) in vitro 91
5.2 Влияние светодиодных ламп на цитотоксичность растительных экстрактов растений рода Astragalus L 94
Выводы 98
Список литературы 100
- Культура in vitro растений семейства Бобовые
- Условия культивирования изолированных органов растений астрагала
- Размножение астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.) в условиях in vitro
- Влияние светодиодных ламп разного света на клональное микроразмножение астрагала приподнимающегося
Культура in vitro растений семейства Бобовые
Существует два пути морфогенеза, приводящего к регенерации целого растения: соматический эмбриогенез и органогенез побегов с последующим ризогенезом. Оба пути развития могут происходить как напрямую, без дополнительной стадии формирования каллусной ткани, с образованием адвентивных органов, так и через этап неорганизованного роста клеток с развитием органов de novo. Однако существуют некоторые виды растений, для которых экспериментально было показано, что регенерация может быть получена как путем органогенеза, так и путем соматического эмбриогенеза (Gamborg O.L., Phillips G.C., 1995; Phillips G.C., 2004).
В последнее время наибольший интерес представляют работы по изучению соматического эмбриогенеза, так как при таком способе размножения можно получать не только высокий коэффициент размножения, но и, впоследствии, получать «искусственные семена».
В своей монографии «Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур» профессор И.В. Митрофанова пишет: «Исследования проэмбриогенных клеток и развития зародышевых структур дает огромную информацию о сигналах и белках-акцепторах, эндогенных стимуляторах и экзогенных регуляторах роста, участвующих в процессе морфогенеза. При незиготическом эмбриогенезе соматические клетки высших растений должны пройти перепрограммирование и стать клетками, детерминированными к образованию биполярных структур.» (Митрофанова, 2011). Первые сообщения, объясняющие способность каллусных тканей к соматическому эмбриогенезу были сделаны К. Гобелем и Дж. Хаберландтом в начале ХХ века (Goebel, 1902; Haberlandt, 1922). Их концепция предполагала, что изолированные от организма клетки и отсутствие связи между каллусными клетками «заставляют» некоторые из них вести себя аналогично зиготе.
Формирование соматических зародышей является наиболее ярким выражением и реализацией присуще всем растительным соматическим клеткам тотипотентности. В отличие от зиготического эмбриогенеза, соматический эмбриогенез можно разделить на две стадии: 1) начальная клеточная фаза, 2) переход к эмбриогенезу и развитию зародышей in vitro. Именно изучение ранних фаз (стадий) соматического эмбриогенеза является одним из важных моментов в исследованиях в области соматического эмбриогенеза, так как установление сигналов и индукторов этого процесса, а также механизмов переключения дедифференцированной клетки на иной путь развития является одной из сложных и, порой, трудно решаемых задач.
Известно, что активный базипетальный транспорт индилил-3-уксусной кислоты (ИУК) является отражением полярности каждой индивидуальной клетки, при этом в суспензии клеток вектор полярности каждой клетки имеет произвольное значение. Установлено, что проэмбриогенные массы клеток находятся в зоне электрического поля со специфическим рисунком силовых линий (Митрофанова, 2011). Так, С. Бровли с соавторами в 1984 году определили плотность биоэлектрического потенциала для группы из четырех морфогенных клеток с помощью сверхчувствительного виброзонда (Browley, et.all, 1984). Максимальная плотность электрического тока проявлялась на полярных полюсах этой группы клеток. Исследования также показали, что при переходе клеток в глобулярную фазу эмбриогенеза рисунок поля не менялся, но плотность тока значительно увеличивалась и на «входе» и на «выходе». В своих последних работах Р.Г. Бутенко обобщила существующие данные и сделала вывод, что аксилярность морфогенных клеток «физиологическая ось полярности» в массе проэмбриогенных клеток поддерживается различными механизмами (Атанасов А., 1993, Бутенко Р.Г.,1999). Первое, базипетальный транспорт эндогенного ауксина, второе, градиент биоэлектрического потенциала, и, наконец, третье, градиент ионов кальция. Установлено, что поляризация присуще всем стадиям эмбриогенеза. Кроме того, большое значение для детерминации морфогенных клеток имеет перестройка цитоскелета. Элементы цитоскелета – микротрубочки и активные филаменты необходимы для деления клеток, в особенности морфогенеза.
При органогенезе происходит раздельное формирование новых органов. После индукции деления клеток экспланта формируются зоны локализации клеточного деления, из которых впоследствии возникают меристематические центры – так называемые меристемоиды (Thorpe T.A., 2000). Они и дают начало новым меристемам, из которых в дальнейшем развиваются органы. Такие органы возникают или непосредственно из родительских тканей или через стадию каллуса.
Регуляция морфогенетического потенциала (эмбриогенез и органогенез) находится под контролем ряда взаимосвязанных факторов: регуляторы роста растений и их концентрация; тип первичного экспланта; состав питательной среды (соотношение различных источников азота, концентрации углеводов); условия культивирования (включая физическое состояние среды, рН, влажность, качественный, количественный состав или отсутствие света, температура, газовый состав) и осмотический потенциал. Однако, многие из описанных выше факторов влияют на индукцию морфогенеза по разному (Joy R.W., Thorpe T.A., 1991). Например, высокое содержание ауксинов, обычно использование 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), важно для индукции соматического эмбриогенеза. В то время как для инициации роста корней, как правило, необходимо снижение концентраций регуляторов роста и использование ауксинов более «природного» происхождения, чем 2,4-Д (Третьякова И.Н., Ворошилова Е.В., Иваницкая А.С. и др., 2013, Gamborg O.L., Phillips G.C, 1995; Phillips G.C., 2004). Поскольку образующиеся в процессе органогенеза органы униполярны, то для развития полноценного растения необходимо два сигнала индукции органогенеза. В то время как при развитии соматических биполярных зародышей этот процесс индуцируется одним сигналом (Phillips G.C., 2004).
Важным событием последних лет стало открытие специфических генов, вовлеченных в регенерацию растений in vitro. Было показано, что экспрессия трансгена LEC2 (leafy cotyledon) инициирует соматический эмбриогенез с высокой жизнеспособностью регенерантов, но при этом появляются некоторые аномалии в их морфологии (Lohmann J.U., Weigel D, 2002). Также обнаружены гены, вовлеченные в переход от вегетативного роста к эмбриогенезу, такие как WUS (wuschel, или PGA6, plant growth activator), LEC1 (Lohmann J.U., Weigel.D, 2002), SERK (somatic embriogenesis receptor kinase), PT1 (primordial timing) (Harada H., 1975). Приобретение способности к регенерации побегов зависит от экспрессии генов CYCD3 и SRD3 (shoot redifferentiation) (Walton P.D., Brown D.C.W., 1988; Suginobu, K., 1989).
Условия культивирования изолированных органов растений астрагала
Растительный экстракт получали из микропобегов астрагала монгольского и приподнимающегося, полученных на питательных средах разного гормонального состава, культивируемых в течение пяти пассажей в условиях разного спектрального состава света. Для получения экстракта брали сухую массу образца (от 200 до 500 мг), которую экстрагировали 100% метанолом (3-5 мл), путем растирания ее в ступке. После этого полученную массу помещали в стеклянные пробирки и оставляли при комнатной температуре на 1 сутки. По истечении времени экстракции анализируемый образец дважды фильтровали через фильтровальную бумагу, после чего полученный растительный экстракт лиофильно высушивали. Схема эксперимента представлена на рисунке 8. Фильтрование Рис. 8 Схема эксперимента по получению растительного экстракта
Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде (1 мл) и стерилизовали через бактериологический фильтр. Полученные экстракты растворяли в культуральной среде в различных концентрациях. Изучение цитотоксичности проводили в лаборатории молекулярной биологии Института проблем химической физики РАН, при непосредственном участии кандидата биологических наук Балакиной А.А.
Для исследования цитотоксичности использовали линию клеток M-HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, сублиния HeLa, клон M HeLa, коллекция Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Культивирование опухолевых клеток проводили согласно общепринятой методике (Фрешни Р.Я., 2011). Клетки выращивали на среде EMEM (Игла-МЕМ) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% NEAA (незаменимые аминокислоты) в атмосфере 5% СО2 и температуре 37оС. Для проведения экспериментов клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью культуры 50000 кл/мл по 100 мкл среды в лунку. Через 24 ч после посева культуральную среду удаляли и заменяли средой с различными концентрациями растительных экстрактов. Инкубацию клеток с экстрактами проводили в течение 72 ч. Повторность в одном эксперименте каждого варианта 8-кратная, представлены данные 3-х независимых экспериментов.
Для определения количества выживших клеток использовали метод МТТ-теста. В каждую лунку после 72 ч культивирования наносили 10 мкл раствора МТТ-красителя и инкубировали в стандартных условиях в течение 3 ч. Культуральную среду удаляли водоструйным насосом и окрашенные клетки растворяли в 200 мкл ДМСО. Планшет помещали на шейкер для полного растворения клеток (15-20 мин). Измерение поглощения проводили при длине волны 570 нм на планшетном фотометре «Эфос» (Рис. 9).
Затем проводили расчет интенсивности МТТ-окрашивания в % относительно контроля (контроль – 100 %). Чем выше процент окрашивания, тем выше жизнеспособность клеток и ниже цитотоксичность экстрактов (Рис. 10). Рис. 10 Расположение образцов на культуральном планшете. Вид после растворения окрашенных клеток в ДМСО
Математическая обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики (Доспехов Б.А., 1985; Смиряев А.В, Кильчевский А.В., 2007). Дисперсионный анализ проводил на компьютере с использованием программы MS ECXEL.
Эксперименты проводил в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях. На графиках представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения.
При клональном микроразмножении в качестве первичного экспланта можно использовать различные части растений, выбор которого зависит от способности тканей и клеток к реализации морфогенетического потенциала. В нашей работе мы использовали различные первичные экспланты (сегменты семядольных листьев и гипокотиля, а также верхушечные почки, изолированные со стерильных проростков) и разные методы клонирования. Для клонального микроразмножения в работе были применены следующие приемы: микрочеренкование и регенерация растений из каллусной ткани.
Размножение астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.) в условиях in vitro
Таким образом, проведенные исследования позволили заключить, что для астрагала монгольского (Аstragalus mongholicus Bge.) применение в технологии клонального микроразмножения разных светодиодных ламп (белый, красный, красный и синий свет) не является эффективным. Это связано с тем, что данные лампы не оказывали .существенного влияния на такой важный показатель как коэффициент размножение (количество побегов, образовавшихся на одном экспланте в течение одного пассажа). Наилучшие результаты для данного вида были получены при использовании стандартных условий культивирования – применение люминесцентных ламп.
Однако полное отрицание применения светодиодных ламп при клональном микроразмножении астрагала монгольского (Аstragalus Рис. 40 Укоренившиеся микропобеги астрагала монгольского (Аstragalus mongholicus Bge.) при использовании ламп красного и синего света mongholicus Bge.) не совсем корректно, так как в условиях применения светодиодных ламп красного и синего света наблюдали формирование корневой системы у микропобегов, что не было характерно для стандартных условий культивирования (Рис. 40). 4.2. Влияние светодиодных ламп разного света на клональное микроразмножение астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.)
Для астрагала приподнимающегося были проведены исследования аналогичные, как и для астрагала монгольского. Микропобеги выращивали при разном освещении и на разных питательных средах, отличающихся только гормональным составом.
Безгормональная среда. Исследования показали, что в условиях безгормональной среды спектральный состав света оказывает влияние на индукцию образования адвентивных почек/побегов (коэффициент размножения). В контрольном варианте (люминесцентные лампы) не зависимо от числа субкультивирований среднее количество микропобегов на один эксплант составило 3 – 3,5 шт (Рис. 41). Причем при применении ламп синего и красного света был получен схожий результат, который существенно превосходил варианты, где были применены лампы белого и красного света. Причем следует отметить, что в условиях белого света среднее число микропобегов было постоянным на протяжении четырех пассажей и составило 1,5 – 1,8 шт, в то время как в условиях красного света этот показатель снижался в процессе культивирования. На втором пассаже он составил 2,5 шт и к концу пятого пассажа этот показатель снизился до 0,5 шт. Полученные данные свидетельствуют о том что применение светодиодных ламп красного света оказывает негативное влияние на коэффициент размножения при условии их постоянного применения. Светодиодные лампы оказали влияние не только на коэффициент размножения, но и на высоту сформировавшихся побегов. Например, при использовании красного света на ранних пассажах наблюдали формирование удлиненных побегов (до 7 см в высоту), в то время как в остальных вариантах этот показатель не превышал 4 см. Однако следует отметить, что последующее культивирование микропобегов в условиях красного света приводило к формированию укороченных побегов, которые к концу пятого пассажа были в 1.5 – 3 раза меньше (ниже) по сравнению с побегами, полученными во всех других условиях освещения (Рис. 42, 43).
В результате культивирования микропобегов на питательных средах, содержащих в составе питательной среды БАП/НУК и в условиях разного источника света установлено, что в этих условиях наблюдается увеличение коэффициента размножения по сравнению с условиями культивирования микропобегов на безгормональной среде. Причем максимальный коэффициент размножения (до 4,5 шт) был получен при использовании светодиодных ламп красного и синего света на втором и третьем пассажах. Однако последующее культивирование микропобегов в этих условиях привело к снижению учитываемого показателя. В остальных вариантах на протяжении четырех субкультивирований существенных изменений по коэффициенту размножения не было отмечено, и учитываемый показатель в среднем составил от 2,7- до 3,7 шт. (Рис. 44). Рис. 44 Влияние спектрального состава света на формирование микропобегов Аstragalus adsurgens Pall. на питательной среде, содержащей БАП/НУК
Что касается влияния светодиодных ламп на высоту микропобегов, то нами был отмечен стабильный эффект лишь при применении белого света. В этих условиях культивирования наблюдали на протяжении четырех пассажей формирование побегов высотой в среднем 2,5 см, в то время как в остальных вариантах этот показатель был не стабильным и изменялся на каждом пассаже (Рис. 45, 46).
Микропобеги Аstragalus adsurgens Pall. в разных условиях культивирования на среде с БАП/НУК: а – белый свет, б – красный свет, в – красный и синий свет, г – люминесцентные лампы (контроль) Содержание в питательной среде Дропп/НУК. При культивировании микропобегов на средах с Дропп/НУК нельзя однозначно сказать о положительном или отрицательном влиянии тех или иных светодиодных ламп на процесс морфогенеза. Например, на ранних пассажах наибольший коэффициент размножения был отмечен в варианте с применение светодиодных ламп белого света. Однако при дальнейшем культивировании в этих условиях наблюдалось снижение учитываемого показателя с 5,7 до 3,5. В то время как в остальных вариантах этот показатель незначительно увеличивался, и максимальные результаты были получены на третьем пассаже, которые при дальнейшем культивировании в аналогичных условиях постепенно снижались. Например, в процессе культивирования на красном свете коэффициент размножения изменялся 3,4 (II пассаж) – 4,7 (III пассаж) – 3,9 (IV пассаж) – 2,3 (V пассаж). Аналогичные закономерности были характерны и для контрольного варианта, а также для света красного и синего (Рис. 47).
Влияние светодиодных ламп разного света на клональное микроразмножение астрагала приподнимающегося
Было показано, что наибольшей цитотоксичностью независимо от времени культивирования in vitro обладают экстракты, полученные из микропобегов, культивируемые на среде, содержащей в качестве регуляторов роста Дропп, а так же на безгормональной среде. В этих вариантах цитотоксичность составила в среднем 3%. В то время как в вариантах с БАП и 2ip растительный экстракт был не эффективен. Этот показатель на ранних этапах культивирования составил 48,3 и 60,2%, соответственно. Однако при длительном культивировании микропобегов на разных питательных средах (в течение семи пассажей) цитотоксичность полученных растительных экстрактов во всех вариантах существенно увеличилась. Показано, что менее 10% исследуемых раковых клеток выжило.
Таким образом, был сделан вывод, что все изученные экстракты не зависимо от условий выращивания растительного материала (микропобегов) обладают цитотоксичностью для изученной линии опухолевых клеток.
В следующей серии эксперимента необходимо было выявить концентрацию, вызывающую гибель 50%-клеток, то есть IC50 для каждого варианта культуральной среды. Для этого определяли массу полученного после лиофилизации экстракта и растворяли его до концентрации 50 мг/мл. На клетки наносили экстракты в концентрации от 50 до 5000 мкг/мл. Результаты представлены на рисунке 55. Рис. 55 Влияние различных концентраций экстрактов астрагала монгольского на жизнеспособность опухолевых клеток
В результате проведенных исследований было установлено, что наибольшей токсичность для изученной линии клеток обладает экстракт, полученный из растений культивируемых на безгормональной среде и на среде, содержащей препарат Дропп. 50 и более процентов клеток гибнет при концентрации более 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл, соответственно. Наименьший цитотоксический эффект был отмечен в варианте с 2ip – 50% клеток гибнет только при высоких концентрациях - 5000 мкг/мл. Полученные данные можно объяснить тем, что именно на среде с 2ip формирование побегов происходило менее интенсивно и морфогенетический потенциал был слабо выражен. Это проявлялось по таким показателям как медленная скорость роста побегов и низкий коэффициент размножения. Вероятно, в клетках таких побегов отмечается нарушение метаболических процессов.
В связи с тем, что при концентрации экстрактов 5000 мкг/мл наблюдали гибель опухолевых клеток во всех вариантах, то в дальнейших экспериментах данная концентрация была взята нами для изучения влияния светодиодных ламп разного света на цитотоксичность растительных экстрактов.
Как следует из результатов, представленных на рисунке 56, растительный экстракт, полученный из растений астрагала монгольского проявляет различную цитотоксичность по отношению к клеткам M-HeLa. Во всех вариантах выращивания микропобегов (красный и синий свет, белый свет) учитываемый показатель составляет от 9 до 22%, что свидетельствует о высокой цитотоксичности экстрактов. Следует отметить, что даже для варианта выращивания микропобегов на среде с 2ip МТТ-окрашивание составило 15%, в то время как в контрольном варианте (люминесцентные лампы, смотри рисунок 55) этот показатель находился на уровне 45%. Все это свидетельствует о том, что спектр белого и красно-синего света оказал стимулирующий эффект на синтез вторичных метаболитов, который проявился в высокой цитотоксичности экстрактов по отношению к клеткам M-HeLa.
Влияние различных концентраций экстрактов, полученных из микропобегов Astragalus аdsurgens Pall. (безгормональная среда), на жизнеспособность опухолевых клеток
Для астрагала приподнимающегося был получен неоднозначный эффект действия растительных экстрактов на клетки M-HeLa. Эта ответная реакция зависела, прежде всего, от гормонального состава питательной среды, а также от условий освещения. Кроме того, растительный экстракт разной концентрации (500, 1000, 2500 мкг/мл) проявил не одинаковую цитотоксичность. Установлено, что чем меньше концентрация растительного экстракта, тем меньшей цитотоксичностью он обладает. С повышением концентрации, увеличивается его эффект (Рис. 57-59).
Похожие диссертации на Влияние условий культивирования на размножение растений рода Astragalus L. и синтез вторичных соединений в культуре in vitro
