Введение к работе
Актуальность темы. Методы культуры in vitro клеюк растений в настоящее время широко используются для решения как теоретических, так и прикладных задач физиологии и эмбриологии растений [Бутенко. 1999. Носов, 1999; Razdan, 2003] Культивируемые клетки представляют собой пластичные системы, обладающие способностью менять процессы дифференциации под воздействием определенных физических и химических факторов Это свойство дает возможность подобрать условия для максимальной реализации морфогенетического потенциала культивируемого зкепланта, заканчивающейся формированием растений-регенерантов при нетрадиционных системах размножения. Кроме того, регенерация фертильных растений в строго контролируемых экспериментальных условиях определяет и практическую значимость большинства методов культуры in vitro
Одно из перспективных направлений в этой области исследований -метод культуры in vitro изолированных незрелых зародышей, связанный с образованием эмбриоидогенного каллуса, формированием в каллусе эмбриоидов, а затем прорастанием эмбриоидов до зрелых фертильных растений-регенерантов. В основе данного метода лежит феномен эмбриоидогенеза - асексуального формирования эмбриоидов [Батыгина, 1997].
Экспериментально установлено, что важнейшую роль в формировании эмбриоидов и их развитии до растений-регенерантов играют фитогормоны [Li, Qu, 2002; Langhansova et al., 2004; Wang, Bhalla, 2004], что хорошо согласуется с концепцией гормонального контроля экспрессии генома растений [Кулаева, 1978, 1982; Кулаева, Прокопцева, 2004] и теорией физиологической стратегии морфогенеза [Сайб, Карабаев, 1991]. Однако клеточные механизмы влияния фитогормонов на индукцию и процесс эмбриоидогенеза т vitro при культивировании незрелых зародышей изучены недостаточно. В то же время от полноты комплексных знаний о цито-физиологических особенностях этих процессов во многом зависит эффективность биотехнологий, связанных с массовым получением фертильных растений-регенерантов из каллусных
тканей, полученных в культуре
нечрепых чярппміпей В этом плане
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ і БИБЛИОТЕКА |
однодольные растения хлебные злаки, в том числе пшеница, исследованы недостаточно полно С другой стороны, изучение изолированных незрелых '.ародышей в строго контролируемых условиях т vitro способствует решению важнейшей фундаментальной проблемы биологии - морфогенеза, выявлению его основных закономерностей и особенностей. Более того, именно зародыш наиболее перспективен в качестве модели при изучении различных аспектов морфогенеза, поскольку обладает всеми морфогенетическими потенциями взрослого растения [Батыгина, 2000].
В связи с этим, цель исследований состояла в выявлении цито-физиологических особенностей эмбрновдогенеза яровой пшеницы в каллусной культуре in vitro. Дня достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Выявить фазу развития in vivo незрелого зародыша, оптимальную для получения эмбриоидогенного каллуса, дать оценку цито-гистологического статуса такого зародыша и содержания в нем эндогенного ауксина ИУК.
-
Определить концентрацию экзогенного ауксина 2,4-Д, оптимальную для индукции эмбриоидогенного каллуса, в зависимости от содержания эндогенного ауксина ИУК в экспланте - незрелом зародыше.
-
Выявить цито-гистологические особенности эмбриоидогенного каллуса и дать цито-гистологическую характеристику эмбриоидогенных клеточных комплексов.
-
Выявить концентрацию экзогенной АБК и длительность культивирования, необходимые для получения максимального количества эмбриоидогенных клеточных комплексов.
-
Провести цито-гистологическое исследование формирования, развития и прорастания эмбриоидов in vitro Дать сравнительный анализ цито-гистологического статуса сформированного эмбриоида и сформированного зиготического зародыша.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Формирование эмбриоидогенного каллуса in vitro определяется оптимальной фазой развития незрелого зародыша, которая характеризуется
определенным цито-гистологическим статусом зародыша и определенным содержанием в нем эндогенного ауксина ИУК
2 Повышения количества эмбриоидогенных клеточных комплексов можно добиться длительностью культивирования каллусов на питательной среде с определенной концентрацией экзогенной АБК.
3. Эмбриоиды, сформированные in vitro с участием эмбриоидогенного клеточного комплекса как единого целого, развиваются и прорастают типично для зиготических зародышей пшеницы.
Научная новизна работы состоит в проведенном впервые с привлечением данных цито-гистологического и иммуноферментного анализа исследовании эмбриоидогенеза в культуре in vitro незрелых зародышей сортов яровой мягкой и яровой твердой пшеницы через этап формирования эмбриоидогенного каллуса.
Установлено, что основным условием формирования эмбриоидогенных каллусов является инокуляция незрелых зародышей в фазе органогенеза, которая характеризуется определенным цито-гистологическим статусом зародыша.
Показана тенденция обратной зависимости между концентрацией экзогенного ауксина 2,4-Д, необходимой для формирования эмбриоидогенного каллуса, и содержанием эндогенного ауксина ИУК в исходных эксплантах - незрелых зародышах. Выявлена принципиальная цито-гистологическая особенность эмбриоидогенного каллуса - наличие морфогенетического очага, представленного меристематическими клетками. Показано преобразование морфогенетического очага в эмбриоидогенный клеточный комплекс, представленный несколькими зонами клеток и обособленный от остального каллуса.
Установлено, что повышения количества эмбриоидогенных клеточных комплексов можно добиться длительностью культивирования каллусов на питательной среде с определенной концентрацией экзогенной АБК.
По данным цито-гистологического анализа показано, что формирование эмбриоида состояло в реорганизации эмбриоидогенного клеточного комплекса как единого целого и проходило сходно у изученных сортов пшеницы. На основании
сравнительного цито-гистологического исследования выявлено принципиальное сходство эмбриоида и зиготического зародыша в развитии и прорастании.
Предложены термины "эмбриоидогенный каллус" и "эмбриодогенный клеточный комплекс", которые отражают суть явления корректнее, чем широьо применяемые в соответствующей литературе термины "эмбриогенный каллус" и "эмбриональный клеточный комплекс".
Практическая значимость работы состоит в использовании полученных данных для решения дискуссионных вопросов, связанных с увеличением выхода растений-регенерантов в культуре in vitro незрелых зародышей яровой пшеницы, что имеет несомненное значение как в клонировании растений-регенерантов, так и в ускорении генетико-селекционного процесса по созданию новых форм с использованием методов биотехнологии. Полученные данные представляют интерес для исследователей, изучающих различные аспекты проблемы морфогенеза и регенерации растений в условиях т vitro Экспериментальные данные рекомендуются для использования при чтении лекций по курсу физиологии и биотехнологии растений в ВУЗах на факультетах биологического профиля.
Связь работы с научными программами Исследования поддержаны РФФИ (грант № 02-04-48701, 2002-2004 гг.), ФЦП "Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы" (грант № ЯО 128/1644).
Реализация результатов. Полученные теоретические и практические результаты используются при чтении спецкурса по биотехнологии растений на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского госуниверситета и включены в учебное пособие "Биотехнология растений", изданное в Башкирском государственном университете в 2004 г.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на ряде конференций, в том числе на II международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), IV международной конференции "Геном растений" (Одесса, 2003), II международной конференции молодых ученых "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений" (Харьков, 2003), VIII
международной конференции по биотехно югии (Saratov, 2003), V съезде общества физиолоюв растений России и международной конференции "Физиология растений - основа фитобиотехнологии" (Пенза, 2003), II международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 2003), VIII международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пушино, 2004), XIV конгрессе FESPB (Cracow, 2004), международной научной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Минск, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях. 2 статьи находятся в печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов Список литературы включает 328 работ, в том числе 212 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 52 рисунками и 6 таблицами.
