Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ и
1. ДЕЙСТВИЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ НА ФИЗИОЛОГО БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ 11
1.1. Действие газообразных промышленных загрязнителей на растения. Фтор как загрязнитель и токсикант 11
1.2. Влияние промышленных загрязнителей на метаболические процессы у растений 20
1.3. Изучение действия промышленных загрязнителей на физиолого-биохимические процессы у растений с использованием культуры in vitro 31
2. РАЗЛИЧИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ ПО ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К ДЕЙСТВИЮ ПРОМЫШЛЕННЫХ ЭМИССИЙ 35
3. КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ 42
3.1. Культура клеток высших растений, 42
3.2. Культура клеток, органов и тканей хвойных 46
3.3. Исследования культуры in vitro у представителей рода Larix 55
Заключение , 61
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 63
1. РАСТИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ 63
2. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 64
3. ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ЛИСТВЕННИЦ НА
ФТОРСОДЕРЖАЩИХПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ. 67
4. КЛАССИФИКАЦИЯ КАЛЛУСНЫХШТАММОВ ЛИСТВЕННИЦ ПО ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К ДЕЙСТВИЮ ФТОРА IN VITRO 70
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ 71
5.1. Определение содержания ТБК-активных продуктов 71
5.2. Определение содержания диеновых конъюгатов 72
6. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ 72
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 73
1. ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСОГЕНЕЗА У ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ И
ЛИСТВЕННИЦЫ ГМЕЛИНА 73
1.1. Получение долгоживущей каллусной культуры двух видов лиственниц при использовании различных типов эксплантов 73
1.2. Оптимизация питательной среды 84
1.3. Зависимость характеристик каллусогенеза на оптимизированной среде от генотипа исходного растительного материала 96
2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ IN VITRO ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
УСТОЙЧИВОСТИ ЛИСТВЕННИЦ К ФТОРУ J 02
2.1. Действие фторида натрия нарост каллусной культуры лиственниц 103
2.1.1. Эффект различных концентраций фторида натрия на рост каллусной культуры лиственниц 103
2.1.2 Определение концентраций фторида натрия, вызывающих дифференцированную ростовую реакцию каллусных культур лиственниц 107
2.2. Реакция каллусных штаммов разных видов и популяций лиственниц на действие фтора в культуре in vitro 109
2.3. Физиолого-биохимическая характеристика каллусных штаммов лиственниц с различной устойчивостью к действию фтора in vitro. 127
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Антропогенная деятельность сопровождается образованием огромного количества твердых, жидких, газообразных отходов, включающих токсические соединения, среди которых к числу наиболее агрессивных загрязнителей относятся производные фтора. В результате этого происходит деградация веками складывающихся биогеоценозов и появляется реальная угроза серьезных нарушений в биосфере. Загрязнение атмосферы имеет особенно губительное действие на лесные экосистемы. При этом наиболее подвержены воздействию токсикантов хвойные леса, и, в первую очередь, представители семейства Ргпасеае (Рожков и Михайлова, 1989; Бельчинская, 2000; Осколков и Воронин, 2003). Наблюдаются усыхание и гибель хвойных, наиболее выраженные в промышленно развитых регионах. Столь критическая ситуация объясняет значительный интерес, проявляемый к изучению влияния промышленных выбросов на представителей видов хвойных и образуемые ими биоценозы, исследования механизмов устойчивости к токсикантам, поиску и созданию форм, толерантных к загрязнителям. К настоящему моменту накопился большой объем информации в области экологических и физиолого-биохимических исследований действия промышленных выбросов, а также механизмов устойчивости к загрязнителям, начиная с уровня растительных сообществ, и заканчивая уровнем целого организма или отдельных его частей и органов. Значительная часть этих исследований посвящена изучению действия фторсодержащих соединений (Тарчевский, 1964; Негруцкая, 1970; Соков и Рожков, 1975; Bucher-Wallin, 1976; Keller, 1976; Braun, 1977; Соков, 1979; Рожков и Михайлова, 1989; Бабушкина и др., 1993; Воробейник и Хантемирова, 1994; Третьякова и Бажина, 1994; Ярмишко и др., 1995; Харук и др., 1996; Pukacki, 1998; Михайлова и др., 1998; Mikhailova, 2000; Михайлова и Бережная, 2002; Осколков и Воронин, 2003). Только использование комплексного подхода с привлечением различных методов исследования на всех уровнях организации биологической системы позволяет получить исчерпывающую информацию о состоянии лесных экосистем и выработать способы разрешения сложившейся негативной ситуации (Mikhailova, 2000). В этой связи большие перспективы открываются при использовании, в дополнение к традиционно применяемым приемам, методов культуры клеток, органов и тканей in vitro. Такой подход позволяет достаточно детально изучить действие какого-либо конкретного фактора или агента, в частности токсиканта, на растительную клетку и ее реакции на это воздействие, в строго контролируемых условиях, максимально устраняя влияние других сопутствующих факторов. Кроме того, используя эти методы, можно четко разделить устойчивость и адаптацию растений на уровне организма и клеточный уровень устойчивости; на основе клеточной селекции отобрать устойчивые к токсиканту клоны или линии, а далее и целые растения. Применение генно-инженерных подходов позволяет получить растения с повышенной устойчивостью к негативному фактору. Методы культуры клеток, тканей и органов успешно используются для изучения влияния тяжелых металлов (Гуральчук, 1994), гербицидов (Diaz-Cacho et al, 1999; Encina, 2001), солевого стресса и стресса обезвоживания (Костюк и др., 1994) на растительные клетки и получения или отбора организмов устойчивых к засолению, затоплению, засухе, тяжелым металлам и экстремальным температурам (Tyagi et al., 1981; Sumaryati et al., 1992; Харинарайн и др., 1996; Winicov, 1996; Samantaray et al., 1999; Rout et al., 1999; Сергеева, 20006, 2000в). Подавляющее большинство исследований в данной области проводилось на культуре in vitro травянистых растений, и ни в одном случае не использовался растительный материал хвойных. Кроме того, до настоящего момента не изучалась реакция культивируемых растительных клеток на действие таких высоко агрессивных и повсеместно распространенных промышленных загрязнителей, какими являются производные фтора. С учетом недостаточной изученности действия фторсодержащих соединений на физиолого-биохимические процессы у представителей хвойных пород значительную актуальность представляет использование для этих целей современных методов клеточной биологии и биохимии растений.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в оценке возможности меж- и внутривидовой дифференциации лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) по их устойчивости к фтору на основе каллусной культуры in vitro-Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Подобрать исходный растительный материал и оптимальные условия культивирования для получения и стабильного поддержания долгоживущеи каллусной культуры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина. Исследовать характеристики каллусогенеза у лиственниц.
2. Изучить возможность использования характеристик каллусогенеза для оценки генотипического разнообразия у двух видов лиственниц.
3. Оценить действие различных концентраций фторида натрия на рост каллусной культуры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина in vitro.
4. Исследовать возможность использования характеристик каллусогенеза для оценки устойчивости каллусной культуры лиственниц к фтору в условиях in vitro.
5. Изучить возможность дифференциации видов и экотипов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина по устойчивости к фтору с использованием каллусной культуры in vitro. Научная новизна. В результате проведенных исследований разработана модельная система, позволяющая оценить реакцию растительных клеток лиственниц на действие фтора в условиях in vitro. Впервые показано, что долгоживущая каллусная культура позволяет эффективно дифференцировать генотипы сибирских видов лиственниц по признаку фторустойчивости in vitro. Изучение реакции каллусных штаммов на присутствие различных концентраций фтора в среде культивирования по изменению ростовой активности культур позволило провести их классификацию по степени устойчивости к галогену.
Научная и практическая ценность работы. На основе долгоживущеЙ каллусной культуры лиственниц разработана система клеточной селекции генотипов у разных видов хвойных на устойчивость к фтору в условиях in vitro. Такие характеристики каллу согенеза, как ростовая активность культуры, сроки появления первых участков некротизации и степень некротизации каллуса на фторсодержащих средах в учетные даты эксперимента зависят от генотипа исходного растения. Отбор наиболее устойчивых к действию фтора в условиях in vitro каллусных штаммов позволяет получить растительный материал для изучения конкретных механизмов фторустойчивости на уровне клетки. Применение методов микроклонального размножения, генной и клеточной инженерии в сумме с данными по изучению механизмов фторустойчивости позволит в будущем получить растительные формы с повышенной устойчивостью к токсиканту для целей их использования в программах лесовосстановления и создания санитарно-защитных насаждений вокруг промышленных предприятий.
Защищаемые положения. I. Долгоживущая каллусная культура, поддерживаемая на содержащих фторид натрия средах, позволяет эффективно дифференцировать генотипы сибирских видов лиственниц по устойчивости к действию фтора in vitro. 2. Исследуемые каллусные штаммы L. sibirica и L. gmeltnii по их устойчивости к действию фтора in vitro подразделяются на 5 классов: высокоустойчивые, устойчивые, среднеустойчивые, слабоустойчивые, неустойчивые.
3. Каллусные штаммы лиственниц с повышенной устойчивостью к действию фтора in vitro характеризуются более низким уровнем перекисного окисления липидов.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены и докладывались на следующих региональных, всероссийских и международных конференциях: Международная конференция "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), Научно-практическая конференция "Проблемы экологии". Чтения памяти профессора М.М. Кожова" (Иркутск, 1997), Межотраслевой симпозиум IUFRO «Larix-98: World Resources of Breeding, Resistance and Utilization» (Красноярск, 1998), I международная конференция «Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia» (BDENE-2000) (Новосибирск, 2000), 6 международная конференция «Acid rain 2000» (Tsukuba, Japan, 2000), I международное рабочее совещание "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии: информационные технологии и моделирование" (WITA-2001) (Новосибирск, 2001), XI международная конференция IBFRA «Boreal forests and environment: local, regional and global scales» (Красноярск, 2002), V съезд Общества физиологов растений «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), Всероссийская научно-практическая конференция «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе» (Иркутск, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 342 источника, в том числе 236 зарубежных авторов. Работа изложена на 172 страницах, содержит 10 рисунков и 33 таблицы.
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность своему научному руководителю, доктору биологических наук Ю.М Константинову за постоянное внимание к работе и активную поддержку; д.б.н. К.З. Гамбургу, к.б.н. Е.Ф. Высоцкой, к.б.н. Л.В. Гаманец, к.б.н. Л.А. Семеновой за консультационную помощь в проведении работы; д.б.н. Т.А. Михайловой, за критические замечания в процессе обсуждения результатов; к.б.н. В.И. Тарасенко, Е.Ю. Гарник и другим сотрудникам лаборатори за помощь в подготовке рукописи диссертации и обсуждении результатов.
Похожие диссертации на Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro
